Extracto
Antecedentes
EMX2 es un ortólogo humano de la
Drosophila
gen homeobox espiráculos vacía que ha sido implicado en la embriogénesis. Estudios recientes sugieren la posible participación de EMX2 en los cánceres humanos; Sin embargo, el papel de EMX2 en la carcinogénesis requiere mayor análisis.
Resultados
En este estudio, se informó de que la baja regulación de la expresión EMX2 se correlacionó significativamente con el promotor hipermetilación EMX2 en el cáncer gástrico. La restauración de la expresión EMX2 el uso de un sistema de suministro de adenovirus en líneas celulares de cáncer gástrico que carecen de expresión endógena EMX2 condujo a la inhibición de la proliferación celular y la vía de señalización Wnt, tanto in vitro y en un modelo de xenoinjerto de cáncer gástrico in vivo. Además, se observó que los animales tratados con el vector de expresión adenoviral EMX2 tenían una supervivencia significativamente mejor que aquellos tratados con el vector adenoviral vacío.
Conclusión
Nuestro estudio sugiere que EMX2 es un supresor tumoral putativo cáncer gástrico humano. El adenoviral-EMX2 puede tener potencial como una nueva terapia génica para el tratamiento de pacientes con cáncer gástrico
Visto:. Li J, Mo M, Chen Z, Chen Z, Sheng Q, Mu H, et al. (2012) Entrega por adenovirus de la EMX2 Gene suprime el crecimiento en el cáncer gástrico humano. PLoS ONE 7 (9): e45970. doi: 10.1371 /journal.pone.0045970
Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón
Recibido: 13 Abril, 2012; Aceptado: 23 Agosto 2012; Publicado: 21 Septiembre 2012
Copyright: © Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por fondos del Programa clave Nacional de Investigación y Desarrollo de base (973) de China (2011CB910800 y 2012CB917304), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31170732), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang (Y2101329), y de la Ciencia Postdoctoral Fundación de la provincia de Zhejiang (2010-BSH-031). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es el cuarto cáncer más común y la segunda causa más común de muerte por cáncer en el mundo [1], [2], [3]. Aunque su incidencia global ha disminuido, la incidencia sigue siendo alta en los países asiáticos [2], [4], [5]. La mayoría de pacientes con cáncer gástrico se diagnostican en etapas avanzadas [6]. A pesar de la mejora en las estrategias de tratamiento [7], [8], 5 años de supervivencia de los pacientes con cáncer gástrico avanzado que recibieron terapia convencional sigue siendo inferior al 30% [4]. Por lo tanto, se necesitan urgentemente enfoques alternativos.
La terapia génica, incluyendo el sistema de suministro de genes virales y no virales, es un enfoque prometedor para el tratamiento del cáncer [9]. Entre todos los sistemas disponibles en la actualidad, de adenovirus recombinante (Ad) vectores son particularmente prometedores. Las ventajas de vectores de Ad incluyen la capacidad de producir altos títulos, capacidad de infectar a la división y que no se dividen las células de manera eficiente, la estabilidad del genoma, y bajos niveles de la integración del ADN en el genoma huésped [9], [10]. Se ha informado de que la restauración de genes a través de este enfoque conduce a la regresión del tumor e induce la apoptosis
in vivo
sin afectar a los tejidos normales [11], [12], [13].
EMX2, ortólogo humano de la
Drosophila
gen homeobox espiráculos vacías (eMS), pertenece a la familia de genes homeobox que codifica proteínas reguladoras de la transcripción (homeoprotein) esenciales para muchos aspectos del crecimiento y la diferenciación [14]. EMX2 juega un papel vital en el cerebro [15] y el desarrollo esquelético [16]. Los ratones con mutaciones homocigóticas Emx2 exhiben dramática reducción de tamaño de las zonas de caudal-medial incluyendo corteza occipital e hipocampo [17], [18], [19]. La perturbación de la expresión EMX2 puede alterar la tasa de proliferación de las células madre neurales adultas [20]. EMX2 también controla la reproducción de mamíferos mediante el ajuste de la proliferación de células de endometrio sin afectar la diferenciación [21].
Estudios recientes sugieren la posible participación de EMX2 en los cánceres humanos [22], [23], [24], [25]. Por ejemplo, EMX2 se ha demostrado como un supresor tumoral en el cáncer de pulmón, y la expresión de bajo EMX2 está asociada con una menor supervivencia global y la supervivencia libre de recurrencia en pacientes con adenocarcinomas de pulmón [22], [23]. También se informa de que la expresión EMX2 es abundante en el endometrio normal de las mujeres posmenopáusicas, pero ausente o reducida en los tumores de endometrio, y los niveles de Emx2 están correlacionados negativamente con la proliferación [24], [25]. Por otra parte, EMX2 puede regular a través de la tumorigénesis vía de señalización Wnt, una vía fundamental que regula la determinación del destino celular, el desarrollo del tejido y la tumorigénesis [26], [27], [28]. EMX2 se encuentra como un represor de la expresión directa Wnt1, y golpeando hacia abajo del gen EMX2 induce la expresión ectópica de Wnt1 en el telencéfalo y el desarrollo de displasia cortical [29]. silenciamiento epigenético de la expresión EMX2 puede ser importante para la activación aberrante de la señalización Wnt en cáncer de pulmón, y la consiguiente proliferación y metástasis [22]. Sin embargo, la función de EMX2 durante la tumorigénesis y el mecanismo correspondiente todavía necesita ser estudiada posteriormente. En este estudio, se presenta EMX2 como un supresor tumoral putativo en el cáncer gástrico humano. Se demuestra la regulación a la baja EMX2 y su correlación con el estado de metilación de la región promotora del gen en el cáncer gástrico. También mostramos que la restauración de EMX2 usando un sistema de administración de adenovirus inhibe la proliferación celular y la señalización de Wnt
in vitro
, y da como resultado una mejor supervivencia de un modelo de xenoinjerto de cáncer gástrico
in vivo
. Nuestros datos sugieren fuertemente el potencial terapéutico de utilizar el Ad-EMX2 como terapia génica para el tratamiento futuro de pacientes con cáncer gástrico.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Este estudio fue aprobado por el comité ético del hospital Xuanwu, Universidad médica capital en Beijing. Un escrito el consentimiento informado aprobado por el comité de ética se obtuvo de cada paciente antes de la recogida de muestras de tejido.
Cell Culture, 5-aza-2'- desoxicitidina (DAC) /tricostatina A (TSA) Tratamiento y Las muestras de tejido
líneas celulares de cáncer gástrico humano (AZ521, AGS y MKN28) se obtuvieron de china Center for Type Culture Collection (Wuhan, china). Las líneas celulares se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino, penicilina y estreptomicina a 37 ° C en un incubador húmedo con 5% de CO
2. Para analizar la restauración del gen EMX2, las células fueron tratadas con 4 mM o DAC 300 nM TSA (Sigma, St. Louis, EE.UU.) durante 4 días, con sustitución de medio fresco que contiene la misma dosis de DAC o TSA todos los días. Las células de control se cultivaron con medio fresco que contiene DMSO. Las células fueron cosechadas por consiguiente, para la extracción de ADN /ARN.
Un total de 20 bloques tejidos fijados en formalina embebidos en parafina (10 tejidos de cáncer gástrico y 10 tejidos normales adyacentes), así como el ARN total de 15 muestras de displasia gástrica y 20 muestras quirúrgicas de cáncer gástrico se obtuvieron del hospital Xuanwu, Universidad médica capital en Beijing. Total RNA y DNA genómico extraído de tejidos gástricos normales adultas humanas se adquirieron de Biochain (Hayward, CA, EE.UU.).
Construcciones de ADN
reporteros
Topflash /FOPFLASH contienen tipo salvaje y mutante TCF /LEF sitios, respectivamente, fueron amablemente proporcionados por el Dr. Yeguang Chen (Universidad de Tsinghua, Beijing, china) de unión. Un mutante CTNNB1 (S45Y) construcción de cDNA fue también proporcionado amablemente por el Dr. Yeguang Chen (Universidad de Tsinghua, Beijing, China). vectores de adenovirus recombinantes que expresan EMX2 y el vector de control fueron adquiridos de Biolabs (Biolabs Vector Vector, Burlingame, CA, USA).
PCR específica de metilación (MSP) y secuenciación de bisulfito (BS)
la conversión de bisulfito de tejidos y células se lleva a cabo sin el requisito previo para la purificación de ADN usando el kit EZ-metilación del ADN directa (Zymo, Orange, CA, EE.UU.). Los tejidos FFPE fueron primero de-con parafina en xileno (Sigma) y rehidratada en etanol graduado, antes del tratamiento con bisulfito por las instrucciones del fabricante. Para MSP, el ADN modificado se amplifica usando cebadores MSP (enumerados a continuación) que se refiere especialmente reconocida ya sea las secuencias promotoras EMX2 metilados o no metilados después del tratamiento con bisulfito. PCR se realizó en un volumen final de 20 l que contenía 1 × MSP tampón de reacción [30], 0,5 M de cada cebador y 1 U de Zymo
Taq
™ ADN polimerasa (Zymo). condición de la PCR fue el siguiente: 10 min a 95 ° C; 40 ciclos de 30 s a 95ºC, 30 s a 50 ° C y 30 a 72 ° C; y 7 min de extensión final a 72 ° C. Para BS, la amplificación de ADN con bisulfito convertida se realizó en un volumen final de 50 l que contenía 1 M de cada cebador BS y 2 U de Zymo
Taq
™ ADN polimerasa. condición de la PCR fue el siguiente: 10 min a 95 ° C; 40 ciclos de 30 s a 95ºC, 40 s a 55 ° C y 1 min a 72 ° C; y 7 min de extensión final a 72 ° C. Los productos de PCR se clonaron en PMD-18T (Takara, Dalian, China). 5 o 3 clones positivos seleccionados al azar de cada grupo se secuenciaron en Shanghai Invitrogen (Shanghai, China). Los cebadores fueron los siguientes:
MSP-M (avance): 5'-3 TAGTTTTTTGTTCGTTTCGCGTTTC '
MSP-M (hacia atrás): 5'-3 GAATTAAAATAAACGCCCCTACCGAC'
MSP-T (hacia delante): 5'-GTTTTTTGTTTGTTTTGTGTTTTGA-3 '
MSP-T (hacia atrás): 5'-CCAAATTAAAATAAACACCCCTACCAAC-3'
BS-A (hacia delante): 5 ' -GTTTGTAAATTTTTTTGGAAGGATTT-3 '
BS-A (hacia atrás): 5'-AACAAAAAACTATCCTTAACCACCA-3'
BS-B (hacia delante): 5'-GGTTAGGGATTTTGTAGGGAT-3 '
BS-B (inversa): 5'-AAAATCACATAAACAACTTCCTCC-3 '
La inmunohistoquímica (IHC)
IHC se realizó siguiendo el protocolo estándar. Los anticuerpos utilizados en el estudio incluyeron Ki67 ratón anti-humano (1:100; BD, San José, CA, EE.UU.) y el ratón EMX2 anti-humano (1:500; Pierce, Rockford, IL, EE.UU.), y Alexa 594-conjugado cabra anti-anticuerpo secundario del ratón (1:200; Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Los portaobjetos también se contratiñeron con hochest 33342 (Invitrogen). Zeiss LSM 710 microscopio confocal (Oberkochen, Alemania) se utilizó para examinar la tinción. La intensidad de Ki67 se cuantificó usando Image Pro ® Plus. tinción EMX2 fue visualizado con el kit Histostain Plus DAB (amplio espectro, Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, contraste con hematoxilina (Sigma), y se fotografiaron usando un escáner de diapositivas Leica SCN400 (Leica, Alemania).
Luciferase Assay
Las células a una densidad de 5 × 10
3 por pocillo se sembraron en placas de 24 pocillos antes de la transfección. TOPflash o FOPFLASH plásmidos se co-transfectaron con plásmido PRL-TK. Después las células se cultivaron durante 18 horas, la actividad de luciferasa se midió por el Sistema Dual-Glo Luciferase Assay (Promega, Madison, EE.UU.). La relación entre la actividad luciferasa de luciérnaga (Topflash /FOPFLASH) y la actividad de Renilla se utilizó para la actividad TCF /LEF transcripción.
inmunotransferencia
Tanto la proteína total (20 g) y extractos de citoplasma (40 g) se sometieron a inmunotransferencia. Los anticuerpos primarios incluyeron anti-EMX2 (1:500; Pierce), anti-β-actina (1:5000; Sigma), anti-ciclina D1 (1:500; BD) y anti-c-Myc (1:200; Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.).
Ensayo de proliferación
El crecimiento celular se determinó mediante acuoso CellTiter 96 Ensayo de proliferación Kit (Promega). Las líneas celulares se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos con el número de 5 × 10
2 células /pocillo. Después se cultivaron las células durante los días 0, 2, 3 y 4, se añadieron las soluciones de MTS para el medio y se incubaron durante 1,5 h. La absorbancia a 490 nm se midió utilizando un lector de microplacas modelo 680 (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).
formación de colonias de ensayo
Las células (1 × 10
3) infectado con el vector que expresa EMX2 adenovirus o vector vacío se sembraron por triplicado en placas de 100 mm. medio fresco se cambió cada 3 días. Después se cultivaron durante 3-4 semanas, las células se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 10 min, se lavaron con PBS, se tiñeron con 0,1% de cristal violeta durante 20 minutos y se fotografiaron.
Extracción de ARN y cuantitativa en tiempo real Transcripción inversa -PCR (RT-PCR)
La extracción de RNA y en tiempo real de RT-PCR se realizaron como se describe anteriormente [31]. El primer secuencias fueron descritos anteriormente [22].
Modelo Animal y la salida del vector adenoviral
Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo bajo condiciones específicas libres de patógenos en animalario de la Universidad de Tsinghua y aprobados por el Institutional Cuidado de Animales y el empleo Comisión de la Universidad de Tsinghua. xenoinjertos de cáncer gástrico se establecieron en ratones BALB /c ratones desnudos 5 semanas de edad. En resumen, después se cultivaron hasta la confluencia, MKN28 o células AGS se trypisnized y se resuspendieron en PBS (pH 7,4) y luego se mezcla 01:01 (v /v) con matrigel (vigoroso) a 4 ° C para inyectar un ratón en un volumen total de 150 l. La mezcla se inyectó s.c. en el flanco derecho de ratones hembra 16 con 10
7 células por ratón (día 0). En el día 7, los ratones portadores de tumores locales variaron de 50 a 100 mm
2 recibió una inyección directa intratumoral de 1 × 10
9 unidades formadoras de placa del adenovirus se indica (diluido con PBS en un volumen total de 100 l). La formación de tumores se controló durante un máximo de 1 ½ meses. El tamaño del tumor se midió utilizando pinza y determina multiplicando por 0,5 x anchura
2 × longitud. El método de Kaplan-Meier se utilizó para estimar la supervivencia de los dos grupos de animales tratados. En la terminación del experimento, se recogieron los tumores de cada tratamiento en 10% de formalina tamponada, se embebieron en parafina y se cortan en rodajas gruesas 5-m para más de detección de Ki-67. proteínas citosólicas y lisado de células enteras también se extrajeron de los tumores para el análisis Western.
Análisis estadístico
Todos los datos fueron calculados como media ± desviación estándar. Las diferencias entre los grupos se compararon con la prueba t de estudiante de dos caras. Un
P valor Red de 0,05 o menos se considera significativa.
Resultados
regulación a la baja de EMX2 en el cáncer gástrico humano
Se examinó la expresión de EMX2 nueve líneas celulares de cáncer gástrico humano, así como tumor y los tejidos normales adyacentes apareados de diez pacientes con cáncer gástrico (Figura 1). Uso de tiempo real RT-PCR, se encontró que la expresión de EMX2 se downregulated significativamente en ocho de los nueve líneas celulares examinó cuando se compara a la de tejido gástrico normal (P & lt; 0,01, Figura 1 A). Por otro lado, una línea celular AZ521 mostró nivel similar de expresión EMX2 que el de control normal (Figura 1A). Con el fin de detectar la expresión de proteína EMX2 en muestras de tejido de pacientes, inmunohistoquímica (IHC) se realizó y la intensidad de la tinción IHC se cuantificó por Image Pro® Plus. Se encontró que todos diez muestras analizadas para exhibir ya sea la falta de expresión EMX2 o disminución de los niveles de expresión EMX2 en tejidos de cáncer en comparación con sus homólogos normales (P & lt; 0,01, Figura 1B). Para establecer el posible papel de EMX2 en la progresión patológica de cáncer gástrico humano, analizamos la expresión EMX2 utilizando ARN total que se obtuvo a partir de quince muestras de displasia gástrica y veinte muestras quirúrgicas de cáncer gástrico. Se encontró que la expresión EMX2 se downregulated significativamente en muestras de displasia (P & lt; 0,05). Y casi pierde en las muestras de cáncer en comparación con los que en el tejido normal del estómago adulto (Figura 1C), lo que sugiere que podría ocurrir en la etapa precancerosa no invasiva downregulation EMX2
(a) en tiempo real RT-PCR de la expresión EMX2 en una muestra normal de tejido de estómago y las líneas celulares de cáncer gástrico. (B) tinción IHC de la proteína EMX2 en tejidos de cáncer gástrico y sus tejidos normales adyacentes de los mismos pacientes. (100X, barra de escala = 500 micras; 400X, barra de escala = 100 micras). (C) en tiempo real resultado RT-PCR de 15 displasia gástrica y 20 muestras quirúrgicas de cáncer gástrico. Una muestra de tejido de estómago adulto normal se usó como un control. Percentiles 25 y 75 se representan como márgenes de caja, percentiles 10 y 90 se representan como barras de error, y la mediana se representa como una línea en la caja.
Corrección entre la expresión EMX2 y su estado de metilación
examinó el estado de metilación del promotor EMX2 en nueve líneas celulares de cáncer gástrico y de tejido gástrico normal. Regiones de islas CpG (CGI) se identificaron con MethPrimer -800 a -470 y -55 hasta 459 en relación con los sitios de inicio de transcripción esperados (+1) del gen EMX2 (Figura 2A). El estado de metilación se analizó mediante el uso de secuenciación de bisulfito (BS) (Figura 2B) y PCR específica de metilación (MSP) (figuras 2C-2D). Nuestra BS y los resultados MSP mostraron que el promotor EMX2 en las células del tejido y AZ521 gástrica normal era no metilado, mientras que en los otros ocho líneas celulares examinó fue metilado densamente (figuras 2B-2C). Estos resultados son consistentes con los niveles de expresión EMX2 en estas líneas celulares: altas en el tejido normal y AZ521, pero baja en los otros ocho líneas celulares examinadas. Se encontró una mezcla de banda metilado y no metilado en varias líneas celulares incluyendo MKN28, N87, y SNU16 que indica la metilación parcial. Además, se encontró que el estado de metilación de las muestras de tejido de pacientes revelados por MSP es consistente con los niveles de expresión EMX2 en esas muestras (Figura 2D, cuatro de los diez pares de muestras de tejido se examinaron debido a falta de disponibilidad de DNA genómico a partir de los otros seis pares ). Estos datos sugieren que la regulación por disminución de la expresión EMX2 puede ser el resultado de su promotor hiper-metilación en cáncer gástrico.
(A) Representación esquemática de la región promotora 5 'del gen EMX2. TSS indica el sitio de inicio de la transcripción. MSP es la amplificación MSP y BS-A /BS-B son amplificados para la secuenciación de bisulfito. (B) resultados de la secuenciación de bisulfito de la muestra de tejido normal del estómago y líneas celulares de cáncer gástrico. cuadrados abiertos y llenos representan los sitios no metilados y metilados, respectivamente. resultados (C) MSP de la región promotora EMX2 en muestra normal de tejido de estómago y las líneas celulares de cáncer gástrico. (D) los resultados del MSP de la región promotora EMX2 en tejidos de cáncer gástrico y sus tejidos adyacentes normales emparejados.
Para investigar más la correlación entre la expresión EMX2 y la metilación del promotor, nos trataron líneas celulares MKN28 y AGS con un inhibidor de la metiltransferasa DAC y un TSA inhibidor de histona desacetilasa. La línea celular AZ521 se utilizó como control negativo como su región promotora no está metilado. Se observó que la banda específica de no metilación fue significativamente mayor (Figura 3A) con los niveles de expresión EMX2 upregulated en consecuencia (Figura 3B) por tratamiento DAC tanto en AGS y células MKN28, mientras que los de las células AZ521 se mantuvo sin cambios (Figura 3). El tratamiento de la TSA tuvo efectos mínimos en tanto el estado de metilación y los niveles de expresión Emx2. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren fuertemente la baja regulación de la expresión EMX2 se correlacionó significativamente con la hipermetilación del promotor EMX2 en el cáncer gástrico humano.
MSP (A) y en tiempo real de RT-PCR (B) analiza en gástrica líneas celulares de cáncer después del tratamiento de DMSO, 1 M DAC, 300 nM TSA, y una combinación de DAC (1 M) y TSA (300 nM), respectivamente (*:
P & lt; 0,05
, ***:
P. & lt; 0,001
) guía empresas
inhibición del crecimiento celular por adenovirus entregado EMX2 in vitro
a continuación examinó el papel de EMX2 sobre el crecimiento celular de células de cáncer gástrico . El crecimiento de las células AGS y MKN28 se suprimió significativamente a la infección con adenovirus que expresa EMX2 (Ad-EMX2) en comparación con un control de vector vacío (Ad-ctrl) (P & lt; 0,001, Figura 4A), mientras que el crecimiento de las células AZ521 no se vio afectada (P & gt; 0,05, Figura 4A). Estas observaciones también fueron confirmados por el ensayo de formación de colonias (Figura 4B). Nuestros resultados demuestran la función anti-proliferación de EMX2 en células de cáncer gástrico.
ensayo (A) MTS. (B) Cuantificación de ensayo de formación de colonias (**:
P & lt; 0,01
, ***:
P & lt; 0,001
). ad-ctrl y ad-E2 representan la lucha contra los vectores de adenovirus vacío y el vector adenoviral que contiene EMX2 ADNc, respectivamente.
TCF /LEF análisis de la actividad del indicador (A), y Western blot de EMX2, β citosólica catenina y los genes Wnt canónica vía de destino (B) en líneas celulares de cáncer gástrico infectadas con ad-ctrl o ad-E2. (C) Efecto de la supresión de la proliferación inducida por ad-EMX2 después de una transfección β-catenina estabilizada. 0,5 g CTNNB1 (S45Y) ADNc mutante o un control de vector vacío fue utilizada en cada transfección. La proliferación celular se evaluó en el día 5 después de la transfección y la infección. Occidental fue para confirmar la expresión de la β-catenina mutante (*:
P & lt; 0,05
, **:
P & lt; 0,01, España ***:
P & lt; 0,001
)
represión de Wnt vía de señalización por adenovirus entregado-EMX2
La función de EMX2 se ha relacionado con la vía de señalización Wnt.; Por lo tanto, se estudió la relación entre EMX2 y la señalización de Wnt en cáncer gástrico. Se utilizó un ensayo indicador Topflash /FOPFLASH para medir la actividad de transcripción TCF /LEF-dependiente regulada por la vía Wnt canónica. Se encontró que la actividad de transcripción TCF /LEF-dependiente se inhibió significativamente por Ad-EMX2 en células AGS y MKN28 que carecen de expresión EMX2 endógeno (P & lt; 0,05), pero no en células AZ521 expresan EMX2 endógeno (P & gt; 0,05, Figura 5A). Consistentemente, los niveles de proteína de citosólico β-catenina y la vía Wnt canónica abajo objetivos c-myc y ciclina D1 se suprime en estos AGS y células MKN28 infectadas con Ad-EMX2, pero no en células AZ521 (restauración de la expresión EMX2 en estas líneas celulares después de infección Ad-EMX2 fue confirmada por Western) (Figura 5B). Para examinar aún más la relevancia de la vía Wnt baja regulación y supresión de la proliferación de Ad-EMX2, transfectadas y expresó estabilizado β-catenina (S45Y mutación) en estas células de cáncer gástrico infectadas con Ad-EMX2. Hemos observado que la sobre-expresión de β-catenina atenuó significativamente el efecto de supresión del crecimiento de Ad-EMX2 en ambos AGS y células MKN28 (P & lt; 0,01), pero no en células AZ521 (Figura 5C). En conjunto, estos resultados apoyan un papel importante de EMX2 en la supresión de la vía de Wnt en el cáncer gástrico.
(A) El volumen del tumor y el peso del tumor de los modelos de xenoinjerto de cáncer gástrico (MKN28 y AGS) tratados con Ad-ctrl o ad-E2. (B) Imágenes de Ki-67 tinción de los tumores tratados con MKN28 ad-ctrl o ad-E2 (panel superior) y la cuantificación de la tinción (panel inferior). (C) de Kaplan-Meier para la supervivencia acumulativa de los ratones tratados con Ad-ctrl o ad-E2 (**:
P & lt; 0,01
). (D) Western blot de EMX2, citosólico β-catenina y la vía canónica de Wnt genes diana vía en MKN28 y los tumores tratados con AGS ad-ctrl o ad-E2.
supresión del crecimiento del cáncer gástrico por adenovirus entregado EMX2 in vivo
Hemos establecido los modelos de xenoinjertos MKN28 y AGS para explorar el potencial terapéutico de EMX2 adenovirus entregado para el cáncer gástrico
in vivo
. Una semana después de la inoculación, los ratones portadores de tumores locales que van desde 50 a 100 mm
2 recibieron una inyección intratumoral directa de 1 × 10
9 unidades formadoras de placas del adenovirus se indica. El crecimiento de los tumores en ratones infectados Ad-Emx2 fueron significativamente más lenta que en el grupo control (P & lt; 0,05, Figura 6A dejó dos paneles). A la finalización de la masa tumoral experimento en ratones infectados Ad-Emx2 también significativamente menor que en el grupo control (P & lt; 0,05 para el tumor MKN28, P & lt; 0,01 para el tumor de AGS, la Figura 6A panel derecho). Intensidad de la tinción de un marcador de proliferación Ki67 de muestras de tumores al finalizar el experimento mostró que la entrega de Ad-EMX2 disminuyó significativamente la Ki-67 tinción (P & lt; 0,01, Figura 6B), la inhibición de lo que sugiere la proliferación celular en tumores. Por otra parte, la supervivencia del grupo Ad-EMX2 infectados fue significativamente mejor que la del grupo control (P = 0,014, Figura 6C). De acuerdo con nuestra
in vitro
análisis, citosólico β-catenina y la vía Wnt canónica abajo objetivos de c-myc y ciclina D1 también fueron regulados a la baja en Ad-EMX2 infectados MKN28 y tumores AGS (restauración de la expresión EMX2 en estas in vivo tumores también se confirmó por Western) (Figura 6D). Tomados en conjunto, nuestros resultados demuestran un potencial terapéutico de EMX2 adenovirus entregado para tratar el cáncer gástrico.
Discusión
genes homeobox han sido bien conocidas por su importancia en el desarrollo durante décadas, mientras que el estudio de estos genes durante la oncogénesis es todavía en su infancia. Aberrantes expresiones de genes homeobox se han documentado en varios tipos de cáncer [32], [33], lo que indica los cambios de expresiones hemeobox podría ser importante para la oncogénesis. Esto puede proporcionar una base molecular para aplicaciones clínicas potenciales. Sin embargo, varias cuestiones fundamentales todavía deben ser abordados por completo, incluyendo los mecanismos moleculares que conducen a la expresión aberrante, y las dianas moleculares y las vías de señalización que promueven la oncogénesis. En este estudio, proporcionar ideas sobre estas preguntas mediante la investigación de EMX2 en el cáncer gástrico humano.
Nuestro estudio reportado una disminución significativa y pérdida de la expresión EMX2 en líneas celulares de cáncer gástrico y los tejidos tumorales primarias, y demostró que la regulación a la baja se correlacionó significativamente con la hiper-metilación del promotor EMX2, lo que sugiere silenciamiento epigenético como un mecanismo importante para la desregulación EMX2 en el cáncer gástrico humano. En efecto, la modificación epigenética se ha propuesto como un mecanismo clave responsable de genes homeobox regulación a la baja o el silenciamiento en otros tipos de tejido de cáncer en las que estos genes funcionan en la supresión de tumores [14], [32]. Además, nuestra observación de dowregulation EMX2 en la displasia gástrica no invasiva apoya un posible papel importante de EMX2 en la progresión patológica de cáncer gástrico humano. Una limitación de nuestro estudio es el número de muestras de tejidos analizados. Un mayor número de muestras de los pacientes deben ser examinados para validar el hallazgo de metilación-silenciamiento de EMX2 en el cáncer gástrico. Sin embargo, nuestros resultados proporcionan una primera evidencia directa para apoyar este mecanismo en el cáncer gástrico e identificar EMX2 como una novela putativo supresor de tumores en el cáncer gástrico.
Además, se investigó importantes vías oncogénicas a través del cual EMX2 funcionado en el cáncer gástrico , y encontró que vía de señalización Wnt puede jugar un papel clave que media la función EMX2. Hemos ilustrado en ensayos de proliferación que la alta expresión de EMX2 exógeno significativamente el crecimiento reprimido de líneas celulares de cáncer gástrico que carecen de expresión de genes endógenos (células AGS y MKN28), coherente con los informes anteriores que diferencia en la expresión EMX2 se correlaciona negativamente con la proliferación en otros tipos de células de cáncer [ ,,,0],24], [25]. Se demostró además que vía de señalización Wnt se inhibió dramáticamente por EMX2
in vivo
y
in vitro
, proporcionando evidencia adicional de que vía de señalización Wnt puede mediar en la función de EMX2 en el cáncer como se propone anteriormente [22 ].
Finalmente, nuestros resultados indican el potencial del uso de la terapia génica EMX2 para el tratamiento del cáncer gástrico. La infección de los tumores con Ad-EMX2 suprimió significativamente la proliferación y lo más importante, la mejora de la supervivencia global. Es de destacar que el sistema de suministro se utilizó para el tratamiento fue de adenovirus recombinante de serotipo 5 (Ad5), el vector más frecuentemente utilizada en varios tipos de terapia génica del cáncer [11], [12], [34], [35]. En comparación con viral adeno-asociado (AAV) y sistemas de entrega retrovirales, vectores adenovirales, tales como Ad5, tienen claramente muchas ventajas. Por ejemplo, los vectores adenovirales tienen amplio tropismo permitiendo unos objetivos eficaces en muchos tejidos de interés y una gran capacidad de carga útil y de alta transducción de eficiencia relativa al sistema de AAV [10] y también un no-integración de características que de otro modo inducir el riesgo de mutagénesis aleatoria de genoma [ ,,,0],10], [36] [36], [37], [38]. Además, los vectores adenovirales pueden ser diseñados para virus oncolíticos cáncer selectiva [39], [40], [41], que son críticos para la aplicación clínica de la terapia génica del cáncer. Sin embargo, todavía hay muchos retos de la utilización de vectores adenovirales para ofrecer terapias génicas en los pacientes. Por ejemplo, se pueden perder rápidamente a partir de células que se dividen rápidamente después de la infección. Otros factores que afectan a la aplicación clínica de la entrega adenoviral incluyen capacidad de envasado y la gama de huéspedes de los vectores adenovirales, su perfil de expresión de genes y la tendencia a provocar respuestas inmunitarias, especialmente importante si se necesita la administración repetida [42], [43]. Sin embargo, nuestro
in vivo
estudio de la infección por Ad-EMX2 sugiere que la terapia génica EMX2 puede tener potencial para convertirse en una estrategia terapéutica anti-tumor clínico para el tratamiento del cáncer gástrico en el futuro.