Extracto
La trombosis es común en el cáncer de ovario. Sin embargo, la interacción de las plaquetas con las células de cáncer de ovario no ha sido examinada críticamente. Para solucionar esto, se investigó la interacción de plaquetas en una gama de líneas celulares de cáncer de ovario con diferentes potenciales metastásicos [HIO-80, 59M, SK-OV-3, A2780, A2780cis]. Las plaquetas se adhirieron a las células de cáncer de ovario con la adhesión más significativo a la línea celular 59M. células de cáncer de ovario inducida por la activación de plaquetas [expresión de selectina P] de una manera dependiente de la dosis, con la activación más significativo visto en respuesta a la línea de células 59M. Los antagonistas de plaquetas [cangrelor, MRS2179, y apyrase] inhibieron la activación inducida por células 59M que sugiere un mecanismo mediado P2Y12 y P2Y1 receptor de la activación plaquetaria dependiente de la liberación de ADP por 59M células. células A2780 y 59M potenciada PAR-1, PAR-4, y el receptor de TxA2 mediada por la activación de plaquetas, pero no tuvo ningún efecto sobre la activación inducida por ADP, epinefrina, o colágeno. Análisis de los cambios de expresión génica en células de cáncer de ovario después del tratamiento con plaquetas lavadas o un concentrado plaquetario mostró una sutil pero válida la regulación positiva de anti-apoptótica, pro-angiogénicos, ciclo-celular pro anti-autofagia y los genes metabólicos. De este modo, las células de cáncer de ovario con diferente potencial metastásico y se adhieren las plaquetas se activan diferencialmente mientras tanto las plaquetas y concentrado plaquetario median señales pro-supervivencia y pro-angiogénicos en las células de cáncer de ovario
Visto:. Egan K, D Crowley, Smyth P , O'Toole S, Spillane C, Martin C, et al. (2011) adhesión plaquetaria y la desgranulación Inducen favor de la supervivencia y pro-angiogénicos de señalización en células de cáncer de ovario. PLoS ONE 6 (10): e26125. doi: 10.1371 /journal.pone.0026125
Editor: Pan-Chyr Yang, el Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán, Taiwán
Recibido: 10 de mayo de 2011; Aceptado: September 20, 2011; Publicado: 12 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 Egan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por una beca de la Fundación Científica de Irlanda [SFI] como parte del diagnóstico Biomedical Institute [BDI-2 Centro de Ciencia y Tecnología Excelencia (CSET)]. KE es apoyado a través de la Biofotónica Nacional y la Plataforma de Imagen, Irlanda, y financiado por el Programa del Gobierno irlandés para la Investigación en Tercera instituciones de nivel, ciclo 4, Plan Nacional de Desarrollo 2007-2013. DC es apoyado por el Programa de Académicos (Irlanda) Junta de Investigación de la Salud: Medicina Molecular - a partir de genes de función. BF y LMCE son apoyados por la Fundación Emer Casey, Irlanda. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es la quinta causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en las mujeres [1]. Es la neoplasia ginecológica más común y tiene la más alta de mortalidad de la relación de casos de todos los tumores malignos ginecológicos. La tasa de supervivencia de los pobres es el resultado de los diagnósticos finales de etapa. La mayoría de los pacientes son asintomáticos hasta que la enfermedad ha hecho metástasis [2]. La propagación del cáncer de ovario se ha considerado que se produzca principalmente en el peritoneo [3]. Sin embargo, estudios de autopsia y de imagen [4], así como la evidencia de la presencia de micrometástasis en los aspirados de médula de pacientes con cáncer de ovario en estadio temprano [5] sugieren que la metástasis hematógena es más común de lo que se pensaba anteriormente.
Durante diseminación hematógena, se cree que la capacidad de las células tumorales circulantes para interactuar con las plaquetas para promover su supervivencia dentro de la circulación y por lo tanto facilitar la metástasis. los experimentos con animales preclínicos han demostrado que farmacológicamente [6] o genéticamente [7] trombocitopenia inducida, así como defectos en la función plaquetaria [7] - [10] están asociados con la metástasis reducida. La interacción de las células cancerosas con las plaquetas se cree que confieren una serie de ventajas que promueven la metástasis éxito, incluyendo la protección de asalto inmunológico y la evasión de la vigilancia inmune [11], [12], la liberación de crecimiento, angiogénica, y factores de permeabilidad vascular durante activación y degranulación [13]
Trombosis y trombocitosis son complicaciones frecuentes de cáncer de ovario y están asociados con un mal pronóstico [14] - [16]., poniendo de relieve la importancia de las plaquetas en la patología del cáncer de ovario. Sin embargo, la interacción entre las plaquetas y las células de cáncer de ovario no ha sido bien estudiado. En este estudio, que tuvo como objetivo caracterizar la interacción de las plaquetas con células ováricas, utilizando una línea normal de ovario de células [HIO-80] y de ovario líneas celulares de cáncer con diferentes propiedades biológicas y los potenciales metastásicos [59M, SK-OV-3, A2780, y A2780cis].
en primer lugar, se estudió la adhesión de plaquetas a las células de cáncer de ovario en condiciones estáticas para determinar si existe una interacción adhesiva entre las plaquetas y las células de cáncer de ovario. En segundo lugar, se evaluó la capacidad de las células de cáncer de ovario para inducir la activación de las plaquetas y la desgranulación [expresión de selectina P]. Después de establecer que las plaquetas se adhieren a las células de cáncer de ovario, cáncer de ovario y las células son capaces de inducir la activación plaquetaria y la desgranulación, el próximo evaluó los cambios de expresión génica a nivel del transcriptoma en células de cáncer de ovario tratados con plaquetas o un concentrado plaquetario. Nuestros resultados muestran interacciones diferenciales entre las plaquetas y las líneas celulares de cáncer de ovario, no sólo en términos de adhesión y activación de plaquetas, sino también en los cambios de expresión de genes en células de cáncer tratados con plaquetas lavadas o un concentrado plaquetario. Múltiples interacciones se producen entre las plaquetas y las células de cáncer de ovario que implican factores liberados por las plaquetas y las células cancerosas, así como las interacciones de células de plaquetas-ovárico directos. Esta interacción produce un pro-supervivencia, la señal pro-angiogénicos para la célula de cáncer de ovario.
Métodos
Ética declaración
La extracción de sangre para este estudio fue aprobado por el Real Colegio de Cirujanos en Irlanda del comité de ética y el consentimiento informado por escrito de todos los donantes antes de la flebotomía.
reactivos
todos los reactivos fueron adquiridos de Sigma-Aldrich [St Louis, MO, EE.UU.] a menos indique lo contrario. El colágeno [piel de ternera soluble], adenosina-5'-difosfato, epinefrina, y el ácido araquidónico se obtuvieron de BioData [Horsham, PA, EE.UU.]. marcado con Fluor-488 Alexa faloidina, calceína AM, y el fibrinógeno se obtuvieron de Invitrogen [Carlsbad, CA, EE.UU.]. Ficoeritrina [PE] marcado con humanos anti P-selectina [IgG de ratón], marcado con PE de control de isotipo IgG de ratón, y marcado con PE contra CD42a humano [IgG de ratón] anticuerpos se compraron de BD Pharmingen [San Diego, CA, EE.UU.].
las líneas celulares
Una selección de líneas de células de ovario de origen epitelial se eligieron para su inclusión en este estudio como los cánceres ováricos epiteliales son el tipo histológico más frecuente. HIO-80 [un regalo del Fox Chase Cancer Center, Filadelfia, PA] representa una línea no tumorigénicos humana normal epitelial de ovario de células, que ha sido inmortalizada por transfección con un plásmido que codifica para el gen T grande de SV40. Las células HIO-80 se mantuvieron en una mezcla 01:01 de medio de 199 y MCDB-105 suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mM L-glutamina, 100 unidades /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina y 0,2 UI /ml de la insulina humana recombinante como se recomienda por Fox Chase. 59M [Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Salisbury, Reino Unido] representa un carcinoma de ovario humano tumorigénico epitelial de tipo endometrioide con componentes de células claras, originalmente aisladas de ascitis de un paciente de 65 años con cáncer de ovario metastásico. células 59M se mantuvieron en DMEM, 1 g de glucosa /L, suplementado con 10% de suero bovino fetal, 2 mM L-glutamina, 100 unidades /ml de penicilina, y 100 ug /ml de estreptomicina como recomendado por ECACC. SK-OV-3 [American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, EE.UU.] representa un adenocarcinoma de ovario humano tumorigénico epitelial, aislado originalmente de ascitis de un paciente de 64 años con cáncer de ovario metastásico. SK-OV-3 se cultivó con los medios de McCoy 5A, suplementado con 10% de suero fetal bovino [Invitrogen, Países Bajos], 100 unidades /ml de penicilina y 100 ug /ml de estreptomicina como recomendado por ATCC. A2780 [ECACC, Salisbury, Reino Unido] se deriva de un tejido tumoral epitelial seroso de ovario en un paciente no tratado. La línea de células resistentes al cisplatino A2780cis fue desarrollado por la exposición crónica de la línea celular A2780 cisplatino sensibles padre a concentraciones crecientes de cisplatino. Ambas líneas celulares se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal, 2 mM L-glutamina, 100 unidades /ml de penicilina y 100 ug /ml de estreptomicina como recomendado por ECACC. Todas las líneas celulares se cultivaron en condiciones estándar en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2 a 37 ° C.
preparación de plaquetas
Se obtuvo sangre de donantes sanos que no habían tomado medicamentos sabe que afectan a la función plaquetaria durante al menos 10 días. La sangre se recogió por punción venosa a través de una aguja de mariposa de calibre 19 sin un torniquete, para evitar la activación de plaquetas. Las plaquetas se prepararon como se describe anteriormente [17]. En resumen, para la preparación de plasma rico en plaquetas [PRP], se recogió sangre en una jeringa que contiene 3,2% de citrato trisódico como anticoagulante [10% vol /vol, a continuación, se centrifugó a 170 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Para la preparación de plaquetas lavadas, se recogió sangre en ácido-citrato-dextrosa [ACD: ácido cítrico 38 mM, citrato de sodio 75 mM, 124 mM de D-glucosa] como anticoagulante [15% vol /vol]. La sangre se centrifugó a 170 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. PRP se acidificó a pH 6,5 con ACD, y se añadió PGE
1 [1 mM] para evitar la activación de las plaquetas durante la centrifugación. Las plaquetas se sedimentaron por centrifugación a 720 g durante 10 minutos. El sobrenadante se eliminó y el sedimento de plaquetas se resuspendió en tampón JNL [NaCl 130 mM, 10 mM citrato de sodio, 9 mM NaHCO
3, 6 mM de D-glucosa, y mM MgCl 0,9
2, mM KH 0.81
2 PO
4, y 10, pH 7,4] a una concentración de 2,5 x 10
8 /mL y suplementado con 1,8 mM CaCl
2.
ensayo de adhesión de plaquetas
El ensayo de adhesión de plaquetas se realizó como se describió anteriormente [18]. En resumen, las células de ovario se sembraron en una placa de 96 pocillos [Nunc, Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Alemania] a una concentración de 5 × 10
4 /ml y se dejaron crecer hasta confluencia. Las plaquetas lavadas [1,5 × 10
8 /ml] precargado con calceína AM [2 mg /ml] se les permitió adherirse a las células durante 45 minutos a 37 ° C. La fluorescencia total [485/535 nm] por pocillo se midió usando un Wallac 1420 Victor2 ™ contador Multilabel [Perkin Elmer, Waltham, MA., EE.UU.] lector de placas. La placa se lavó tres veces, se añadieron 100 ml de JNL a cada pocillo de la placa, y se leyó la fluorescencia restante. % La adhesión plaquetaria se calculó como [fluorescencia restante - en blanco] /[fluorescencia total - en blanco] x 100. Plaquetas adhesión a células de ovario Se obtuvieron imágenes por microscopía de fluorescencia. Cuando confluentes, las células se separaron con EDTA 7 mM en PBS de Dulbecco, se lavó dos veces, y se resuspendieron en JNL suplementado con CaCl 1,8 mM
2. Las células [1 × 10
5 /ml] se incubaron en una BSA recubierto de diapositivas de poli-L-lisina durante 45 minutos a 37 ° C. A raíz de la adhesión, se lavaron las plaquetas [50 × 10
6 /l] se añadieron al portaobjetos y se incubó durante 45 minutos a 37 ° C. Las muestras se fijaron con 3,7% de paraformaldehído durante 15 minutos a temperatura ambiente y se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100. Las plaquetas y células de ovario fueron teñidas con Alexa Fluor 488-faloidina [41,25 nM,] durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las plaquetas se tiñeron específicamente con ficoeritrina anticuerpo marcado CD42a anti-humano [1,25 mg /ml] durante 2 horas a 37 ° C. Los portaobjetos se montaron y imágenes de microscopía de fluorescencia.
Activación plaquetaria
La capacidad de las células de cáncer de ovario para inducir la activación de las plaquetas (la expresión de P-selectina) se evaluó mediante un ensayo de citometría de flujo basado modificados de Nylander et al [19]. En un volumen total de reacción de 100 l, 10 l de PRP se incubó con las células de cáncer de ovario [0-1,5 × 10
6 /ml,] en la presencia de un anticuerpo de P-selectina contra humano marcado con PE [1,25 g /ml] o un control de isotipo apropiado [1,25 mg /ml]. Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después, la reacción se terminó con 1 ml de tampón de JNL antes del análisis por citometría de flujo. Las muestras se analizaron usando un BD FACS Calibur [Becton Dickinson, Palo Alto, CA, EE.UU.] dentro de 1 hora. El instrumento se ajustó para medir el tamaño [dispersión frontal, FSC], granularidad [dispersión lateral, SSC] y la fluorescencia celular. El uso de un FSC frente a log log gráfico de puntos de SSC, una puerta de dos análisis dimensional se ha elaborado en torno a la población de plaquetas, y se obtuvo un histograma de fluorescencia [log FL2 frente recuento] para 10000 eventos de plaquetas para cada muestra. Los datos fueron analizados utilizando el software CellQuest Pro y se expresa como porcentaje de plaquetas que eran P-selectina positiva en relación con el control de isotipo.
El aislamiento de un concentrado plaquetario
Las plaquetas lavadas [2,5 × 10
8 /ml] fueron estimuladas con tanto TRAP [receptor del péptido de la trombina activación, 20 mM] y colágeno [190 mg /ml] y se agitó en una transmisión de la luz BioData PAP-4 agregómetro [Horsham, PA, EE.UU.] a 37 ° C durante 15 minutos. El agregado de plaquetas se centrifugó a 720 g durante 10 minutos. El sobrenadante se aspiró y se filtró a través de un filtro de jeringa con una membrana de 0,22 micras para eliminar PVDF micropartículas de plaquetas.
MTT ensayo
Para optimizar la concentración de concentrado plaquetario para la exposición de las células tumorales, una serie de ensayos de proliferación celular de MTT [Roche Diagnostics Ltd, Reino Unido] se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante para determinar la concentración máxima que se podría aplicar a las células sin impactar negativamente sobre el crecimiento celular o la supervivencia. Las células se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos a 2 x 10
4 células /pocillo y se cultivaron durante 24 horas para permitir la unión celular. Una vez unido a las placas, el medio de crecimiento se aspiró y las células se lavaron brevemente con 200 l de pre calentado PBS. Las células fueron expuestas a diluciones seriadas del concentrado plaquetario de 1:10 a 1:10,000 en medios completos, medios libres de suero o tampón JNL para permitir optimizar la concentración que deberán utilizarse en los estudios basados en la expresión de genes posteriores.
Washed la exposición concentrado plaquetario /plaquetas para el análisis de la expresión génica
La concentración óptima de concentrado plaquetario [determinado por MTT] se aplicó a las líneas celulares y los niveles de apoptosis se compararon contra las células cultivadas en medios completos solamente utilizando una Roche Apodirect TUNEL /propidio kit yoduro. Como se observó la dilución de un concentrado plaquetario 1:1000 en medio de crecimiento completo a ser la más alta concentración de concentrado plaquetario en medios completos que no tuvo ningún impacto sobre el crecimiento celular /viabilidad de todas las líneas celulares y se demostró posteriormente para dar lugar a diferencias significativas en apoptosis en comparación con las células cultivadas en medios completos solos se determinó que era adecuado para proceder con esta concentración. Dado que el producto liberado de las plaquetas se preparó a partir de preparaciones de plaquetas lavadas idénticos, la dilución de un concentrado plaquetario 1:1000 informa directamente el uso de una dilución 1:1000 de plaquetas lavadas para estudio comparativo. Las concentraciones óptimas de concentrado plaquetario y plaquetas lavadas [1:1000] se suspendieron en medio de cultivo completo y se aplicaron a las células cultivadas en 75 cm
2 matraces por triplicado. Las células se expusieron a producto liberado o plaquetas lavadas durante 6 horas después de lo cual el ARN total fue extraído de las células. El análisis del transcriptoma se realizó con Affymetrix Humanos Exon Arrays.
extracción de RNA
Las células fueron lavadas brevemente en PBS, se tripsinizaron y se centrifuga para eliminar el sobrenadante. Se extrajo el ARN usando RNeasy mini kit [Qiagen Ltd., West Sussex, Reino Unido] de acuerdo con el protocolo del fabricante. la cantidad de ARN se evaluó mediante una gota de Nano-ND-1000 espectrofotómetro [Wilmington, EE.UU.] y de calidad por un ensayo de Nano chip de microfluidos Agilent Bioanalyser 2100 y RNA 6000 [Santa Clara, EE.UU.]. ARN se almacenó a -80 ° C.
Affymetrix
100 ng de ARN total extraído de células de control y las células expuestas a las plaquetas lavadas /concentrado plaquetario se marcó utilizando el kit de Expresión Ambion WT [ ,,,0],Ambion /Life Technologies, Austin, TX, EE.UU.], incluyendo los controles del etiquetado desde el Kit de Affymetrix gen chip de poli-A de control de ARN. Como se sugiere por Affymetrix /Ambion, en cada paso del protocolo de preparación de la muestra, el progreso se controló usando tanto el Agilent 2100 Bioanalyzer y el espectrofotómetro Nanodrop. Control de calidad [QC] requiere una evaluación después de la primera limpieza de ARN ciclo, después del segundo ciclo de limpieza de un solo capítulo cDNA y siguiendo ssDNA fragmentación. Preparado ssDNA fragmentado se hibridó a la Affymetrix Human exón 1,0 ST matriz a 45 ° C durante 16 horas siguientes protocolos de Affymetrix para su GeneChip WT Terminal de etiquetado, control de hibridación GeneChip y GeneChip hibridación, lavado, y kits de tinción [Affymetrix, Santa Clara, EE.UU.] . Después de la hibridación, los chips se lavaron y se tiñeron usando la estación de fluidos Affymetrix GeneChip con protocolo de ensayo 64 formato adecuado. Después de la tinción y el lavado de medidas del escáner Affymetrix GeneChip 3000 y Affymetrix GeneChip software operativo se utiliza para el manejo y procesamiento inicial de los datos de expresión. Los datos procedentes de 45 exón arrays estaba sujeta al control de calidad conjunto realizado utilizando la expresión Affymetrix consola. Todos los controles están dentro de los parámetros sugeridos por Affymetrix. Tras la evaluación de las normas de control de calidad sea satisfactoria, los datos del chip se analizaron entonces en profundidad utilizando el software de análisis Biotique Sistemas RADIOGRAFÍA. Cada línea celular se examinó en tres condiciones diferentes; las células en reposo, las células expuestas a un concentrado plaquetario, y las células expuestas a las plaquetas lavadas. Cada línea celular y el estado se ensayó por triplicado. El software se utilizó para comparar las dos cohortes de exposición contra el control de descanso y los genes que presentan un factor de cambio positivo o negativo de más de 1,5 y una significación de p = 0.05 examinado.
Fluidigm validación
la expresión de genes se validó utilizando un alto rendimiento de Fluidigm qPCR 48,48 sistema de matriz dinámica. Se seleccionaron genes que muestra los cambios más significativos de plegado Además de los genes implicados en las vías biológicamente relevantes para su validación. TaqMan® en tiempo real ensayos de expresión PCR se utilizaron en combinación con el sistema de microfluidos Biomark de Fluidigm. Las muestras se analizaron por triplicado y los resultados se compararon con los datos de expresión de Affymetrix. El ARN se transcribe de forma inversa en ADNc monocatenario usando una alta capacidad de cDNA RT Kit [Applied Biosystems, CA, EE.UU.] en 100 pl reacciones. Las reacciones contenían 10 l de buffer [10 ×], 4 l de desoxinucleótido trifosfato [25 ×], 10 l de cebadores aleatorios [10 ×], 5 l de MultiScribe enzima RT [50 U /l], 21 l de nucleasa libre agua y 50 l de ARN total extraído [20 ng /l]. Antes de Fluidigm, de alto rendimiento qPCR, una etapa de pre-amplificación se realizó siguiendo los protocolos Fluidigm; Se combinaron 1 ml de ensayo TaqMan para cada uno de los genes de interés identificados mediante análisis XRAY y controles endógenos y hechas a un volumen final de 100 ml en 1 x tampón TE, pH 8,0. 1,25 ml de cada muestra se añadió a 2,5 ml de preamplificador Master Mix [AB] y 1,25 ml agrupados mezcla de ensayo para dar un volumen de reacción de 5 ml. Esta mezcla fue luego sometido a 14 ciclos de amplificación de 95 ° C, 15 segundos y 60 ° C, 4 minutos antes de diluirse 1:05 con DNasa y RNasa libre de H
20 para dar un volumen final de 25 ml de pre- amplificado de ADNc. Fluidigm datos fueron analizados utilizando el software Fluidigm en tiempo real Análisis de PCR [ver3.02] para producir valores de cuantificación relativa calibrados a las células normales [HIO-80]. Plegables cambios devueltos a partir del análisis de Affymetrix se representaron frente a los calculados a partir de datos Fluidigm y la correlación entre los valores se calculó utilizando Graph Pad Prism [ver 5.02].
epitelial mesenquimal [EMT] análisis de la expresión de plaquetas envuelta /producto liberado células tratadas
el proceso de EMT es crítica en la cascada metastásica, facilitando la entrada de las células en el sistema vascular. El ARN se transcribe de forma inversa en ADNc monocatenario usando una alta capacidad de cDNA RT Kit [Applied Biosystems, CA, EE.UU.] en reacciones de 100 l que el anterior. Una combinación de los jugadores principales en el proceso de EMT [20] y otros genes identificados en nuestro laboratorio como parte integral del proceso de EMT [datos no mostrados] fueron examinados como parte de la elaboración de perfiles para la EMT en las células de cáncer de ovario: Akt-1, ALDH1 A1, CDH1, PIK3CA, SNAIL1, caracol 2, TWIST 1, vimentina, ZEB1, ZEB 2, TLR 4, MyD88 usando el cebador TaqMan y sondas [Life Technologies /Applied Biosystems: ensayos de expresión génica] de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La expresión se examinó en las células tratadas concentrado plaquetario y plaquetas y se compara con células en reposo de cáncer de ovario para todas las líneas de células [HIO-80, 59M, SK-OV-3, A2780 y A2780cis]. Los resultados se representan como un volcán parcela del valor de p en función de factor de cambio. Los números de ensayo de adhesión en los genes examinados se muestran a continuación:
GAPDH - Hs99999905_m1
AKT1 - Hs00178289_m1
ALDH1A1 - Hs00167445_m1
PIK3CA - Hs00180679_m1
SNAIL1 - Hs00195591_m1
Snail2 - Hs00950344_m1
ZEB1 - Hs01566407_m1
ZEB2 - Hs00207691_m1
TWIST - Hs00361186_m1
vimentina - Hs00958116_m1
CDH1 - Hs01023895_m1
MYD88 - Hs00182082_m1
TLR4 - Hs00152939_m1
Estadísticas
Los datos fueron analizados utilizando el software GraphPad Prism 5.0 [GraphPad Software Inc, San Diego, CA, EE.UU.]. Los resultados se expresan como media ± error estándar de la media.
Resultados
La adhesión de las plaquetas a las células de cáncer de ovario en condiciones estáticas
La adhesión plaquetaria a líneas celulares de cáncer de ovario en virtud estática condiciones se cuantificó basándose en la detección fluorescente de plaquetas marcadas [Figura 1A]. Plaquetas adhesión a A2780 [2,4 ± 0,2%, n = 8], A2780cis [3,0 ± 0,2%, n = 8] y 59M [3,4 ± 0,3%, n = 8] las células fue significativo en comparación con el BSA de control negativo [1,0 ± 0,1%, n = 8]. Plaquetas adhesión a HIO-80 [1,8 ± 0,2%, n = 8] y SK-OV-3 [1,3 ± 0,2%, n = 8] las células no fue significativa en comparación con BSA. La adhesión a los 5 células de cáncer de ovario fue inferior a la de fibrinógeno de control positivo [5,9 ± 0,4%, n = 8]. Imágenes de microscopía de fluorescencia demuestran claramente la adhesión de plaquetas a las líneas celulares de cáncer de ovario A2780 y 59M [Figura 1B y C]. De acuerdo con el ensayo de adhesión de plaquetas, la figura S1 demuestra la adhesión de las plaquetas mínimo para la línea celular de HIO-80.
[A] de plaquetas de adhesión a las células de cáncer de ovario se cuantificó en base a la detección de fluorescencia de las plaquetas marcadas. Plaquetas adhesión al fibrinógeno y BSA se utilizaron como controles ± [n = 8 + SEM, * = p & lt; 0,05 vs. BSA]. Imágenes de microscopía de fluorescencia de las plaquetas se adhieren al A2780 [B] y las células 59M [C] en condiciones estáticas [representante de n = 3]. Las células de cáncer de ovario y las plaquetas fueron teñidas para la actina [verde], las plaquetas se tiñeron específicamente para CD42a [rojo /amarillo].
células de cáncer de ovario inducir la activación de las plaquetas de una manera dependiente de la dosis
La capacidad de las células de cáncer de ovario para inducir la activación de plaquetas se cuantificó por citometría de flujo. Concentraciones crecientes de células de cáncer de ovario [0-1,5 × 10
6 células /ml] se añadieron a PRP y activación de las plaquetas se evaluó basado en la expresión de P-selectina. células de cáncer de ovario indujeron un aumento dependiente de la dosis en la activación de plaquetas [Figura 2]. Las dos líneas celulares de cáncer de ovario metastásicos; SK-OV-3 [1.5 × 10
6 células /ml, 47 ± 10,2% de positividad plaquetas P-selectina, n = 3] y 59M [1,5 × 10
6 células /ml, 51 ± 18% positividad P-selectina n = 6] inducida por la activación de plaquetas más significativo. La activación de las plaquetas más bajo se observó en respuesta a la línea celular de cáncer de ovario no metastásico A2780 [1,5 × 10
6 células /ml, 16,1 ± 5,2% de positividad P-selectina, n = 6]. [A2780cis una línea resistente al cisplatino célula hija A2780] demostraron mayor activación de las plaquetas que su línea de célula madre [1,5 × 10
6 células /ml, 28,1 ± 12,2% de positividad P-selectina, n = 3]. Las células epiteliales de ovario normales inmortalizadas línea de activación de las plaquetas también inducida HIO-80 [1,5 × 10
6 células /ml, 32,5 ± 7,8% de positividad plaquetas P-selectina, n = 3], pero en un grado menor que 59M y células SK-OV-3.
plaquetas activación [expresión de selectina P] inducida por una variedad de líneas de células de ovario en un rango de concentración de gran [0,1-1,5 × 10
6 /ml] se midió por citometría de flujo, sobre la base de la expresión superficial P-selectina plaquetaria. La activación de las plaquetas más significativa se observó en respuesta a las líneas de células de cáncer de ovario metastásicos SK-OV-3 y 59M.
P2Y12 /receptor P2Y1 y antagonistas ADP /ATP inhiben la activación plaquetaria inducida por el cáncer de ovario 59M células
Desde 59M células causaron la activación de las plaquetas más significativo, que se utilizaron para probar el efecto de una gama de inhibidores de plaquetas sobre la activación de plaquetas inducida por células de cáncer de ovario. 59M células de cáncer de ovario [1,5 × 10
6 células /ml, la respuesta normalizada a la activación 100%] se añadieron a PRP pre-tratados con inhibidores de la activación de plaquetas y se midió por citometría de flujo [expresión de selectina P]. Las concentraciones de inhibidores fueron elegidos en base a citometría de flujo y agregometría de plaquetas resultados preliminares que mostraron que sean antagónicos (datos no mostrados). Los antagonistas frente a la trombina [hirudina], integrina αIIbβ3 [Reopro y RGDS péptido], la COX-1 [aspirina], y el calcio [EDTA], no tuvieron efecto sobre la activación de plaquetas inducida por células 59M [Figura 3]. Después del tratamiento con el antagonista del P2Y12 [cangrelor, 1 mM], el antagonista de P2Y1 [MRS2179, 10 M] o el ADP /ATPasa (apirasa, 10 unidades /ml), activación de las plaquetas en presencia de 59M células de cáncer de ovario se redujo significativamente [ ,,,0],1 M Cangrelor - 92,4 ± 0,64% de inhibición, p & lt; 0,001; 10 M MRS2179 - 71,4 ± 10,52% de inhibición, p = 0,01; 10 unidades /ml de apirasa, inhibición 91,8 ± 3,7%, p & lt; 0,001]. Esto sugiere un mecanismo dependiente de ADP de la activación plaquetaria por 59M células, potencialmente mediadas por la liberación de ADP por las células en su sobrenadante [Figura 3].
Esto sugiere un mecanismo de la activación plaquetaria dependiente de la plaqueta receptores P2Y12 y P2Y1, y el ADP liberado por las células 59M en su sobrenadante. Otros antagonistas de plaquetas tales como la hirudina, EDTA, abciximab, RGDS, y la aspirina no tuvieron efecto sobre la activación de plaquetas inducida de células 59M.
[Péptido receptor de la trombina de activar]
células de cáncer de ovario potencian TRAP, PAR 4 agonista, y el ácido araquidónico inducida por la activación de las plaquetas en un dependiente de la dosis manera
Dado que la trombosis es un proceso complejo que involucra múltiples agonistas
in vivo
, a continuación pregunta si las células de cáncer de ovario modulados agonista [TRAP, par 4 agonista, el ácido araquidónico, ADP, epinefrina y colágeno] inducida por la activación de las plaquetas. Para determinar esto, se evaluó la activación de las plaquetas co-incubaron con concentraciones de células de cáncer de ovario bajos y bajas concentraciones de agonista. Se utilizaron concentraciones de agonistas de plaquetas que dieron ≤20% activación de las plaquetas [expresión de selectina P]. A bajas concentraciones celulares [0,5-1 x 10
5 células /ml], las células cancerosas de ovario 59M potenciada PAR-1 [TRAP], PAR-4 [agonista PAR4] y el receptor de TxA2 [ácido araquidónico] activación plaquetaria mediada [P expresión -selectin], pero no tuvo efecto sobre ADP, epinefrina, o inducida por la activación de colágeno [Figura 4]. Por ejemplo, en respuesta a TRAP 1 M y 1 × 10
5 59M células /ml, la activación de las plaquetas fue de 44 ± 12,16% de P-selectina positividad [n = 3, Figura 3] en comparación con 4,4 ± 1,6% de P-selectina positividad [1 × 10
5 59M células /ml solo, n = 3] y 5,1 ± 1,3% de P-selectina positividad [1 M TRAP solo, n = 3]. A la inversa, en respuesta a ADP 1 mM y 1 × 10
5 59M células /ml, la activación de plaquetas se 17.3 ± 6.2% de P-selectina positividad [n = 3, la Figura 4] en comparación con 2,4 ± 1,4% [1 × 10
5 59M células /ml solo, n = 3] y 14,73 ± 5,3% [1 uM ADP solo, n = 3]. Resultados similares se observan también en respuesta a las células A2780 [1-5 × 10
5 células /ml], pero se requieren concentraciones de células A2780 superiores para inducir un efecto similar a 59M células [datos no mostrados]. Los datos sugieren una relación sinérgica entre la activación de plaquetas PAR-1, PAR4, y TxA2 receptor mediada por la activación de plaquetas y A2780 /59M inducidos. Esta interacción sinérgica también se inhibe por el cangrelor antagonista P2Y12 [datos no mostrados].
La activación se produce de una manera dependiente de la dosis [n = 3, + SEM]. A bajas concentraciones, 59M [0,5-1 × 10
5 /ml], las células TRAP potenciada significativamente, agonista PAR4, y la activación plaquetaria [expresión de selectina P] inducida por el ácido araquidónico. Esto sugiere una relación sinérgica entre PAR-1, PAR-4, y el receptor de TxA2 la activación de plaquetas mediada y 59M inducida por la activación de plaquetas. Se observaron resultados similares para las células A2780 [1-5 × 10
5 células /ml, datos no mostrados]
serie de análisis de expresión de células de cáncer de ovario tratados con plaquetas lavadas o un concentrado plaquetario utilizando Affymetrix exón arrays
Todos los arrays pasados control de calidad utilizando software de Affymetrix control de calidad. Se utilizó bióticos X-Ray software plug-in para Microsoft Excel para interrogar a los cambios de expresión génica entre los tratamientos y tipos de células [pliegue del cambio & gt; 1,5 y p & lt; 0,05]. rigurosidad analítica se relajó para plegar cambios de & gt; 1,5 para dar cabida a la variación biológica sutil pero significativa [p & lt; 0,05] que estaba supeditada a tratamiento. Las tablas 1, 2, 3, 4 representan las variaciones de expresión génica observados en las células tratadas con un concentrado plaquetario /plaquetas lavadas.
En las células de HIO-80, tras el tratamiento con plaquetas lavadas o un concentrado plaquetario, siete genes fueron significativamente hasta reguladas, con la mayor diferencia observada en respuesta a las plaquetas lavadas. Los genes regulados positivamente codifican para las proteínas asociadas con la metástasis del cáncer de ovario [SERPINB2 /PAI2], las actividades metabólicas [IDI1, PMM2] y la expresión de genes /transcripción [PCGF6, ZNF267].
células 59M también la expresión de genes exhibido cambia después del tratamiento con concentrado plaquetario y plaquetas lavadas. Los procesos biológicos afectados involucrados anti-autofagia, las vías de señalización anti-apoptóticos y pro-angiogénicos [TRAF2, CCL2, TNFAIP2, PDGFB].