Extracto
Las células madre del cáncer (CSC) o células similares a las células madre del cáncer (CSC-CL) se han identificado en muchos tumores malignos. Se proponen las CSC estar relacionado con la resistencia a fármacos, la recurrencia del tumor y la metástasis y son considerados como una nueva diana para el tratamiento del cáncer; Sin embargo, sólo hay unos pocos informes sobre células madre cancerosas o CSC-CL en el carcinoma de células renales (CCR). Diferentes enfoques han sido reportados para la identificación de CSC, pero no existen marcadores universales para CSC. Se han utilizado dos enfoques diferentes, el enfoque tradicional de lado la población (SP), y el método enzimático (aldehído deshidrogenasa 1 (ALDH1)) para identificar la población de CSC-LC de dos líneas celulares de RCC, ACHN y KRC /Y. Se encontró que ACHN y KRC /Y contienen células SP 1,4% y 1,7%, respectivamente. ACHN células SP mostraron una esfera más alta capacidad de formación, resistencia a los medicamentos, y una capacidad ligeramente superior tumorigénico en ratones SCID que los no-SP células /NOD (NSP), lo que sugiere que las células con propiedades de CSC-LC se incluyen en las células ACHN SP. células NSP KRC /Y SP y no mostraron diferencias en tales propiedades. análisis de la actividad ALDH1 reveló que las células SP ACHN expresaron un nivel superior de actividad que las células de NSP (SP vs. NSP: 32,7% frente a 14,6%). El análisis de las células ACHN ALDH1 positivo revelado que tienen una esfera más alta capacidad, la capacidad de auto-renovación, la formación de la tumorigenicidad y expresan altos niveles de mRNA de los genes relacionados con la propiedad de CSC-LC (por ejemplo, ABC transportador de genes, los genes de auto-replicación, anti- genes de apoptosis, y así sucesivamente) que las células ALDH1-negativas. El tratamiento con fármacos o la exposición a condiciones hipóxicas indujeron un incremento de 2 a 3 veces en el número de células ALDH1-positivo. En conclusión, los resultados sugieren que la población de células ALDH1-positivo en lugar de células SP muestran propiedades CSC-LC en una línea celular RCC, ACHN
Visto:. Ueda K, S Ogasawara, Akiba J, Nakayama H, Todoroki K, Ueda K, et al. (2013) de la aldehído deshidrogenasa 1 identifica células con cáncer propiedades de células madre-como en una línea celular de carcinoma de células renales humano. PLoS ONE 8 (10): e75463. doi: 10.1371 /journal.pone.0075463
Editor: Masaharu Seno, Universidad de Okayama, Japón
Recibido: 25 Marzo, 2013; Aceptado: August 14, 2013; Publicado: 8 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Ueda et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen financiación o apoyo al informe
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma de células renales (CCR) es uno de los más. la mayoría de los cánceres comunes del tracto genitourinario, lo que representa 116.500 muertes en 2008 de acuerdo con la Organización Mundial de la Salud [1]. La incidencia de CCR ha aumentado constantemente durante los últimos 30 años [2]. Además, debido a RCC metastásico es notoriamente resistente a la mayoría de las terapias convencionales, tales como quimioterapia y radioterapia, el pronóstico de los pacientes con RCC es pobre como un tercio de los pacientes que ya tienen enfermedad metastásica en el momento del diagnóstico inicial y 30 a 40% de ellos desarrollan distante metástasis después de la resección del tumor primario [3]. En los últimos años, las terapias dirigidas moleculares que se han desarrollado han demostrado respuestas objetivas significativas [4] - [6], y que ahora se reconocen como las terapias estándar actuales del CCR metastásico. Sin embargo, la eficacia de estas terapias diana molecular es insuficiente.
Los dos modelos dominantes de la carcinogénesis son el modelo estocástico (evolución clonal) y la organización jerárquica del tumor (cáncer de células madre) CSC () modelo. De acuerdo con el modelo tradicional evolución clonal, la formación de tumores es la consecuencia de la acumulación de eventos genéticos aleatorios en células diferenciadas normales, mientras que el modelo CSC postula que un solo CSC da lugar a una organización jerárquica dentro de un tumor [7], [8]. Estudios recientes sugieren que las CSC pueden ser responsables de la tumorigénesis y contribuir a la resistencia de algunos individuos para la terapia del cáncer, lo que resultó en la recaída del cáncer y la metástasis [9], [10]. Por lo tanto, en general se cree que la identificación y caracterización de CSC o célula-célula como la madre de cáncer (CSC-LC) pueden contribuir significativamente al desarrollo de terapias eficaces. Bussolati et al. identificado una población de CD105 positivas tumor células iniciadoras en los CRC, y revisado la literatura sobre el papel de las células madre en el RCC humano [11], [12]. Kim et al. informó de que la expresión de marcadores de células madre, Oct4 y CD133, puede servir, respectivamente, como un marcador de mal pronóstico y favorable, en CCR papilar [13]. Además, sugirieron que la expresión de CD133 es un marcador pronóstico favorable en [14]
Hay muchos informes que CSC-CL de algunos tumores sólidos están presentes en la población lateral (SP) células de RCC.
De células claras [15], [16], pero sólo hay unos pocos informes sobre el papel de las células SP en el RCC humano [17], [18]. células SP se identificaron originalmente en el flujo de los análisis de citometría de por su capacidad de flujo de salida del colorante de ADN de vital importancia, Hoechst 33342, resultando en células SP y células Hoechst-positivos no SP (NSP) Hoechst-negativas. Estudios previos de cáncer in vitro y los tumores primarios in vivo han demostrado que las células SP son las únicas capaces de generar tanto las poblaciones de células SP y NSP, propiedades consistentes con células madre o CSC exhibiendo. células SP expresan altos niveles de cassettes de miembros de la familia del transportador de unión a ATP (ABC), especialmente ABCG2, y exhiben resistencia a los medicamentos más quimioterapéutico que las células de NSP en líneas celulares derivadas de algunos tumores malignos sólidos humanos, tales como cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario y el cáncer de células escamosas [19] - [21]
Recientemente, se ha informado de que aldehído deshidrogenasa 1 (ALDH1) es responsable de la oxidación del retinol a ácido retinoico y juega un papel fundamental en el desarrollo embrionario y la homeostasis. en varios órganos [22]. Algunos investigadores han informado de que la alta expresión de ALDH1 se asoció con resistencia a los medicamentos y de mal pronóstico, y que es un marcador ALDH1 CSC [23], [24]. Ozbek et al. informó que la expresión ALDH1 se correlacionó con el grado del tumor en el CCR [25], pero las características biológicas de las células ALDH1-positivas en RCC aún no se conocen.
En este estudio, hemos aislado a partir de células SP dos células RCC humana líneas y se investigan sistemáticamente las propiedades de CSC de las células y las células SP-ALDH1 positiva, y la relación entre las células y las células SP-ALDH1 positivos.
Materiales y Métodos
líneas celulares y animales de
se utilizaron dos líneas celulares de RCC: una derivada de efusión pleural maligna de un paciente con RCC (ACHN) y el otro derivado de lesión primaria de un paciente con RCC (KRC /y). Estas 2 líneas celulares de RCC tienen capacidades formadoras de colonias de alta proliferativa y
in vitro
y poseen alta tumorigenicidad en ratones desnudos incluso
in vivo
. ACHN se adquirió de American Type Culture Collection. KRC /Y se estableció en nuestro laboratorio [26]. El medio de cultivo para ACHN consistía en medio de Eagle modificado (EMEM) (Gibco, BRL /Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, EE.UU.). El medio de cultivo para KRC /Y consistía en medio modificado de Dulbecco (DMEM) (Nissui Seiyaku Co., Tokio, Japón) suplementado con inactivado por calor (56 ° C, 30 min) 5% de suero bovino fetal (FBS, Bioserum, Vic, Australia ), 100 U /ml de penicilina y estreptomicina 100 mg (Gibco BRL /Life Technologies Inc.). Las células se cultivaron en una atmósfera de 5% de CO
2 en el aire a 37 ° C. diabéticos no obesos /inmunodeficiencia combinada severa (NOD /SCID) Mujer (5 semanas de edad) fueron adquiridos (Clea Japan, Inc., Osaka, Japón), y alojados en gabinetes de flujo laminar en condiciones libres de patógenos específicos. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética de Experimentación Animal de la Facultad de Medicina de la Universidad de Kurume.
La expresión de marcadores de CSC en RCC líneas celulares
Se analizó la expresión de la supuesta CSC marcadores ABCG2, CD90, CD105, CD133 y epitelial molécula de adhesión celular (EpCAM) en ACHN y KRC /y. Las células se incubaron en la oscuridad a 4 ° C durante 30 minutos con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorescencia, incluyendo isocianato de fluoresceína (FITC), anticuerpo CD90 anti-humano de ratón conjugado (5E10, BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) y anti-ratón anticuerpo CD105 humana- (MEM-226, EXBIO, Praga, República Checa) y ficoeritrina (PE) conjugado con CD133 /2 anticuerpos (293C3, Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Alemania) y anticuerpo anti-EpCAM (EBA-1, BD Biosciences ). Las células con anti-BCRP anticuerpo monoclonal de ratón (ABCG2) (BXP-21, Chemicon, Temecula, CA, EE.UU.) se incubaron durante 30 minutos y después se incubaron en la oscuridad a 4 ° C durante 30 minutos con anticuerpo de cabra conjugado con FITC anti-ratón Ig (FITC-GAM) (BD Biosciences). Las células se lavaron, se resuspendieron y se analizaron en un FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.).
Identificación SP celular y la expresión de marcadores de CSC en el SP y células NSP
Las células cultivadas con 80 % de confluencia fueron separadas con accutase (Cell Technologies Inc., innovador, San Diego, EE.UU.) y se suspendió a 1 x 10
6 células /ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementado con FBS al 2% y luego incubadas con Hoechest 33342 tinte solo (5 mg /ml para ACHN y 10 mg /ml para KRC /y) (SIGMA-Aldrich, Saint Louis, MO, EE.UU.) o con 20 mg /ml reserpina (SIGMA-Aldrich) a 37 ° C durante 60 min. Las muestras se lavaron, se centrifugaron y se resuspendieron en 2 ml de PBS frío suplementado con 2% de FBS, después se añadió 1 mg /ml de yoduro de propidio (PI) (BD Biosciences) y las células se filtró a través de un filtro de 40 micras de células (BD Biosciences). Se realizó un análisis de citometría de flujo como se describe anteriormente [27]. La reserpina se utiliza convencionalmente como un parámetro de guía para determinar el límite entre células SP y NSP. Los análisis se llevaron a cabo con un FACSAria II (BD Biosciences). Se examinó después la expresión de CD90 y EpCAM en ACHN, y la de CD105 y EpCAM en KRC /Y, en SP y las células de NSP. Las células fueron teñidas utilizando el método descrito anteriormente.
ensayo de crecimiento celular de células SP y NSP
Un total de 2.000 SP células y las células del NSP se sembraron en placas de 96 pocillos y se cultivaron en un CO
2 incubadora. Las células se recogieron a las 24, 48, 72, 96, 120 o 144 horas y la proliferación se examinó en ensayos colorimétricos utilizando 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il-il -) - bromuro de tetrazolio 2,5-difenil (MTT ) kits de ensayo de crecimiento celular (Chemicon, Temecula, CA, EE.UU.) como se describe en otro lugar [28].
formación de colonias ensayo de células SP y NSP
El ensayo independiente del anclaje en agar blando crecimiento clonogénico era realizado. Brevemente, 2 × 10
4 células se suspendieron en 2 ml de EMEM o DMEM que contiene 0,36% de agar blando (Gibco BRL /Life Technologies Inc.) y 10% FBS en una placa de 35 mm. A continuación, la suspensión de células se superpone sobre un agar duro presolidified 0,72%. El medio que contiene 0,36% de agar blando se complementó una vez a la semana. Las colonias (& gt; 10 células) que surgieron el plazo de 3 semanas se presentaron como clonogenicidad. Cinco platos fueron examinados para cada tipo celular y ciegamente contados bajo el microscopio (x200) en todos los campos.
Esfera Formación de Ensayo de la SP y células NSP
SP aislado y las células de NSP de los dos líneas de células (4.000 células /placa) se cultivaron en medio libre de suero incluyendo 10 ng /ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Sankojunyaku, Tokio, Japón) y 20 ng /factor de crecimiento de fibroblastos básico ml (bFGF) (Sankojunyaku) usando de ultra -baja en el apego placas de 6 pocillos (Corning Inc., Corning, Nueva York, EE.UU.) durante 1 semana, después de lo cual la formación de la esfera se evaluó contando el número de esferas (& gt; 3 células). bajo el microscopio (x 200)
se plantaron Evaluar resistencia Drogas
SP células aisladas y NSP a 2.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos, y el efecto del inhibidor multicinasa Sorafenib (2 M) (Cell Signaling Technology. Inc. , Danvers, MA, EE.UU.) y IFN (4.000 UI /ml) (OIF, Otsuka Pharma Co., Ltd., Tokio, Japón) se examinó. Se determinó la resistencia a los medicamentos después del tratamiento durante 72, 96 o 144 horas de ensayo de MTT.
Tumorigenicidad Los ensayos de SP y células in vivo NSP
Para explorar la capacidad tumorigénico, SP y células NSP (1, 10 o 100 × 10
3) fueron aisladas de las dos líneas celulares de RCC, colocados en 100 l de medio, y por separado inyectados en el espacio subcutáneo en el costado de ratones de cinco semanas NOD /SCID hembra bajo anestesia. capacidad Tumorígeno fue juzgado 8 semanas después de la inyección.
ADNc Preparación y cuantitativa en tiempo real RT-PCR para la expresión de genes de ensayo
Después se aislaron células SP y NSP en ACHN y KRC /Y, el total de el ARN se extrajo usando un kit RNeasy Micro Plus (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.), y el ADN complementario (ADNc) se sintetizó usando el sistema de transcripción inversa (Promega, Madison, WI, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Cuantitativa en tiempo real RT-PCR (QRT-PCR) se realizó para examinar la expresión de genes relacionados con la propiedad de CSC-LC (por ejemplo, los genes ABC transporter (ABCB1 y ABCG2), los genes de autorreplicación (IMC1 y c-MYC), genes anti-apoptosis (BCL2 y CFLAR), los genes relacionados con la hipoxia (factor inducible por hipoxia 1α (HIF1α) y vascular de crecimiento endotelial factor A (VEGFA)), y epiteliales-mesenquimal transición (EMT) relacionadas con los genes (Caracol y torsión) ) con un ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Gene ensayos de expresión y de cebadores y sondas mezclas se utilizaron para ABCB1, ABCG2, ALDH1A1, IMC1, c-myc, BCL2, CFLAR, HIF1α, VEGFA, Caracol, Twist, y β-actina (ID de ensayo (SA 00184500_m1, Hs00184979_ml, Hs00946916_m1, Hs00180411_ml, Hs00153408_ml, Hs00608023_m1, Hs00153439_m1, Hs00153153_ml, Hs00900055_ml, Hs00195591_m1, Hs01675818_s1, y Hs99999903_m1, respectivamente; Applied Biosystems), y las condiciones del ciclo térmico fueron las siguientes: incubación inicial a 95 ° C durante 10 minutos, luego 40 ciclos alternando a su vez con 95 ° C durante 10 s, 60ºC durante 20 s, y 72 ° C durante 15 s, y después se mantuvo a 72 ° C durante 10 minutos.
el análisis comparativo de la expresión génica se realizó utilizando el 2
(- ΔΔCt) con métodos de normalización a nivel del gen de control interno, β-actina
expresión ALDH1 en SP y NSP células y en las células bajo condiciones patológicas
ALDH1 expresión se investigó en. muestras preparadas a partir de SP y las células de NSP, las células tratadas con el fármaco, y las células cultivadas en condiciones hipóxicas. brevemente, se aislaron células SP y NSP de ACHN y células KRC /y cultivadas durante 72 horas utilizando el método descrito anteriormente. células de los padres y SP aisladas y células NSP fueron utilizados como muestras. células ACHN cultivadas con EMEM que contiene Sorafenib (1 M) o IFNa (4.000 UI /m) para 48, 72 o 96 horas y las células cultivadas bajo condiciones hipóxicas (1% O
2) las condiciones de 48, 72 o 96 horas eran también se utiliza como muestras. Las muestras se suspendieron en tampón de ensayo ALDEFLUOR sustrato que contiene ALDH, BAAA (Bodipy-aminoacetaldehído) (50 g reactivo seco), con o sin 5 l de la diethylaminobenzaldehyde inhibidor específico de ALDH (DEAB 1,5 mM en 95% de solución de etanol de valores), como un negativo control, y se incubó durante 60 minutos a 37 ° C (KIT ALDEFLOUR, Stem tecnologías de células, Vancouver, BC, Canadá), y se analizaron mediante citometría de flujo (FCM).
características biológicas de ALDH1-positivo y ALDH1- Las células negativas
ensayo de formación
Esfera se llevó a cabo en ACHN y células KRC /y. ensayo de tumorigenicidad y el ensayo de expresión génica se realizaron para examinar las características biológicas de las células ACHN ALDH1-positivos y negativos ALDH1. Para comparar la capacidad de auto-renovación entre las células ACHN ALDH1-positivos y ALDH1-negativo, se examinaron una capacidad de formación de esferas por tres pases seriados consecutivos de células disociadas individuales de acuerdo con el método de Lim et al. [29]. En pocas palabras, después de disociación de la primera esfera pasaje con 0,25% de tripsina, las células disociadas individuales en células ALDH1-positivos y negativos de ALDH1-ACHN se sembraron en placas de 6 pocillos. Una semana más tarde, se contó el número de esferas y el mismo procedimiento se repitió una vez más. Tumorigenicity ensayo y el ensayo de la expresión génica se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente, excepto la comparación en 1 × 10
3 células no se realizó en el ensayo de tumorigenicidad.
Análisis estadístico
Comparación del crecimiento de células de ensayo se realizó mediante dos factores ANOVA factorial, y los de ensayo de colonias de formación, ensayo de formación de esferas, y el ensayo de resistencia a los medicamentos se realizaron con Estudiante de
t-test
. Las otras comparaciones de datos se realizaron con la prueba de Mann-Whitney. Un valor de
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
Expresión de marcadores CSC
ACHN expresan CD90 (96,9%) y EpCAM (. 87,7%), pero la expresión de CD105 (1,5%), CD133 (1,3%) y ABCG2 (0,9%) se mantuvo en niveles muy bajos. Por otro lado, KRC /Y expresa CD105 (28,9%) y EpCAM (93,0%), pero la expresión de CD90 (1,7%), CD133 (1,7%), y ABCG2 (2,9%) fue muy baja.
Las células Las células SP análisis y la expresión de marcadores de CSC en SP y NSP
Las fracciones de células SP en ACHN y KRC /y fueron de 1,4% y 1,7%, respectivamente (fig. 1A). Posteriormente, se analizó la expresión de marcadores de CSC, tales como CD90 y EpCAM en ACHN, y CD105 y EpCAM en KRC /Y, en SP y células NSP. No hubo diferencias aparentes en CD90 y la expresión de EpCAM entre SP y las células de NSP en ACHN. Aunque no hubo diferencia en la expresión EpCAM entre SP y las células de NSP en KRC /Y, la expresión de CD105 en células SP (24,6%) fue mucho mayor que en las células de NSP (4,6%) (Fig. 1B).
(A) y ACHN KRC /y fueron marcadas con Hoechst 33342, y luego analizados por FCM. Las velocidades de células SP en ACHN y KRC /Y fueron 1,4% (A-A) y 1,7% (A-C), respectivamente, que disminuyó significativamente en presencia de reserpina (A-B, A-D). El experimento se repitió al menos tres veces para cada línea celular y casi se obtuvieron resultados idénticos. Se muestra una figura representativa de nuestros experimentos. (B) No hubo diferencias aparentes en CD90 y la expresión de EpCAM entre SP y las células de NSP en ACHN. En la línea de células KRC /Y, aunque no hubo diferencias en la expresión de EpCAM, células SP expresaron una mayor tasa CD105-positivo de células que las células de NSP (SP vs NSP: 24,6% frente a 4,6%). Los experimentos se repitieron dos veces, y casi se obtuvieron resultados idénticos. Se muestra una figura representativa de nuestros experimentos.
Características biológicas de las células SP y NSP en ACHN y KRC /Y in vitro
No hubo diferencia significativa en la capacidad proliferativa celular y clonogenicidad entre SP y las células de NSP en ACHN. Por otra parte, después de cultivar durante 48 horas, las células SP en KRC /Y tenían una capacidad significativamente mayor de proliferación que las células de NSP (
P
& lt; 0,0001) (Fig. 2A). Aunque las células SP en KRC /Y tenían una clonogenicidad significativamente mayor que las células de NSP (
P
& lt; 0,01) (Fig. 2B), no hubo diferencia significativa en la esfera capacidad entre SP y las células NSP formando en KRC /Y. Por el contrario, las células SP en ACHN tenían una capacidad de formación de esfera significativamente mayor que las células de NSP (Fig. 2C). Después del tratamiento 72, 96 o 144 horas con Sorafenib o IFNa, la sensibilidad a cada fármaco se evaluó con el ensayo MTT. No hubo diferencia en la sensibilidad entre las células SP y células de NSP en KRC /Y contra el tratamiento Sorafenib o IFNa. Sin embargo, las células SP en ACHN tuvieron una mayor resistencia a IFN (
P Hotel & lt; 0,0001). (Fig. 2D)
(A) Curvas de crecimiento de las células SP y NSP. células SP en KRC /Y mostraron una capacidad proliferativa mayor en comparación con las células de NSP (*
P
& lt; 0,0001). (B) El clonogenity fue significativamente mayor en las células SP en KRC /Y (*
P Hotel & lt; 0,01). (C) Esfera capacidad de formación fue significativamente mayor en células SP en ACHN (*
P
& lt; 0,05). (D) La resistencia a fármacos de las células SP y NSP tratados con sorafenib o IFN. SP células en ACHN tuvieron mayor resistencia a IFN (*
P Hotel & lt; 0,0001). Los experimentos se repitieron dos veces, y se obtuvieron resultados casi idénticos.
Tumorigenicidad Los ensayos in vivo en células SP y NSP
Tanto SP y células tumorales NSP mostraron la capacidad de cada uno de los que forman dos líneas celulares de RCC. La relación de la tumorigenicidad entre células SP y NSP en ACHN y KRC /Y no fue significativamente diferente, pero la tumorigenicidad de células SP fue ligeramente mayor que la de las células de NSP en ACHN (Tabla 1).
análisis de CSC-LC relacionados con la propiedad de expresión de genes en células SP y NSP por QRT-PCR
No hubo diferencias significativas en la expresión de ARNm de genes transportadores ABC (ABCB1 y ABCG2), genes de autorreplicación (del IMC 1 y c-MYC), los genes anti-apoptosis (BCL2 y CFLAR), los genes relacionados con la hipoxia (VEGFa y HIF1α), y los genes relacionados con la EMT (caracol y twist) entre SP y células de NSP en las líneas celulares 2. SP células en ACHN expresaron un nivel ligeramente más alto de ALDH1A1 ARNm de células de NSP, pero no se observó ninguna diferencia aparente en KRC /Y (Fig. 3).
No hubo diferencias significativas en la expresión de ARNm de genes transportadores ABC (ABCB1 y ABCG2), genes de auto-replicación de genes (IMC-1 y c-MYC), anti-apoptosis (BCL2 y CFLAR), los genes relacionados con la hipoxia (VEGFa y HIF1α), y los genes relacionados con la EMT (caracol y twist) entre SP y las células de NSP en las líneas celulares 2. SP células en ACHN expresaron un nivel ligeramente más alto de ALDH1A1 ARNm de células de NSP, pero no se observó ninguna diferencia aparente en KRC /Y. El experimento se repitió al menos cuatro veces para cada línea celular y casi se obtuvieron resultados idénticos.
Expresión ALDH1 y características biológicas de ALDH1-positivo y negativo-ALDH1 Las células RCC
la velocidad de células ALDH1-positivo en las células KRC /Y fue del 6,5%. No hubo diferencia en la expresión ALDH1 entre SP y las células de NSP. En las células ACHN, la velocidad de células ALDH1-positivo fue del 15,3%. Además, el número de células SP ALDH1 positivos (32,7%) fue mayor que la de las células de NSP (14,6%) (Fig. 4A). El crecimiento celular se suprimió significativamente en las células tratadas con Sorafenib o IFNa y en las células expuestas a la hipoxia, en comparación con células de control (Fig. 4B). En cuanto a la expresión ALDH1, no había ninguna diferencia aparente en los tipos de células ALDH1-positivas entre las células de control, las células tratadas con Sorafenib o IFNa, y las células expuestas a condiciones hipóxicas durante 48 horas. Sin embargo, el porcentaje de células positivas aumentó ALDH1 cronológicamente, especialmente en las células tratadas con Sorafenib o expuestos a condiciones de hipoxia. En particular, después de la exposición a sorafenib o IFN, o hipoxia durante 96 horas, los porcentajes de células ALDH1-positivo fue del 40,0%, 19,2% y 37,1%, respectivamente (Fig. 4C).
(A) La expresión de ALDH1 en las células y las células SP NSP en ACHN y KRC /y. Las velocidades de células ALDH1-positivas en ACHN y KRC /Y fueron 15,3% y 6,5%, respectivamente. (B) Comparación del crecimiento de células entre las células de control, las células tratadas con Sorafenib o IFNa, y las células expuestas a la hipoxia en ACHN. El crecimiento celular se midió a las 48, 72 o 96 horas después del tratamiento de drogas o la exposición a la hipoxia. El crecimiento celular después de tratamiento con fármacos o la exposición a la hipoxia se suprimió significativamente en comparación con el control (*
P
& lt; 0,005, **
P
& lt; 0,0001 frente a control). (C) El porcentaje de células ALDH1-positiva en las células tratadas con Sorafenib o IFNa, o las células expuestas a hipoxia durante 48, 72 o 96 horas. El porcentaje de células ALDH1-positiva en las células tratadas con Sorafenib o IFNa, o las células expuestas a hipoxia durante 96 horas fue mayor en comparación con la condición normal. Los experimentos se repitieron dos veces, y casi se obtuvieron resultados idénticos. Se muestra una figura representativa de nuestros experimentos. (D) Esfera de formación de capacidad entre las células ALDH1-positivas y células ALDH1-negativo. La formación de las células esfera ALDH1-positivas en ACHN y KRC /Y fue mayor que la de las células ALDH1-negativas. Los experimentos se repitieron dos veces, y se obtuvieron resultados casi idénticos.
La esfera capacidad de las células ALDH1-positivo en ambos ACHN y KRC /Y de formación era más alta que la de las células ALDH1-negativas. Por otra parte, las células ALDH1-positivas en ACHN generaron tamaños esfera significativamente más grandes que las células ALDH1-negativos (Fig. 4D). Además, encontramos que las células de esfera disociado individuales chapadas a una densidad de 4.000 células por pocillo dieron lugar a esferas secundarias y terciarias dentro de 1 semana de la siembra. Aunque se muestra el número de esferas a disminuir en el segundo y tercer conductos en comparación con el primer pasaje, la esfera capacidad de las células ALDH1-positivas en ACHN formando se mantuvo durante el segundo y tercer pasajes. Por otro lado, las células ALDH1-negativas forman un par de esferas secundarias (Fig. 5).
La esfera capacidad de las células ALDH1-positivas en ACHN formando se mantuvo durante el segundo y tercer pasos (*
P
. & lt; 0,0001) guía empresas
se observó la formación de tumores en tres de cinco y cinco de cinco ratones inyectados con 10 × 10
3 y 100 × 10
3 ALDH1- células positivas, respectivamente, a las 8 semanas. Sin embargo, la inyección de células ALDH1-negativos no desarrollaron tumores visibles en todos los ratones por este tiempo (Tabla 2).
QRT-PCR en células ALDH1-positivos y negativos ALDH1 ACHN
Se realizó el análisis qRT-PCR para comparar la expresión de genes relacionados con la propiedad de CSC-LC en las células ACHN ALDH1-positivos y negativos ALDH1. células ALDH1-positivas expresaron niveles significativamente más altos de ARNm en todos los genes, excepto que las células Snail ALDH1-negativas. Los niveles de aumento fueron los siguientes: ABCB1, 4,9 veces; ABCG2, 2,5 veces, ALDH1A1, 4,8 veces; BCL2, 5,0 veces; CFLAR, 4,1 veces; IMC-1, 3,9 veces; c-myc, 3,9 veces; HIF1α, 3,4 veces; VEGFA, de 2,7 veces; Twist, 4.0 veces (Fig. 6).
ALDH1 células positivas mostraron significativamente mayor expresión del ARNm de ALDH1A1, los genes relacionadas con el trasportador (ABCB1 y ABCG2), los genes de autorreplicación (IMC-1 y C- MYC), los genes anti-apoptosis (BCL2 y CFLAR), los genes relacionados con la hipoxia (HIF1α y VEGFa) y los genes relacionados con la EMT (torcedura) que las células ALDH1 negativo en ACHN. Sin embargo, no hubo diferencia significativa en la expresión de ARNm de Snail entre las células ALDH1-positivas y ALDH1-negativas. Los experimentos se repitieron al menos cuatro veces, y casi se obtuvieron resultados idénticos.
Discusión
Desde que se propuso el concepto de CSC para explicar la heterogeneidad de las células tumorales, células madre cancerosas o CSC- CL se han identificado en muchos tipos de cáncer. En general, las células madre cancerosas poseen tanto la auto-renovación y diferenciación de las capacidades que permiten CSC para recrear en parte la heterogeneidad celular del tumor parental. Un número de estudios han informado de que la incapacidad de las terapias convencionales para prevenir la recurrencia o metástasis es debido a la presencia de pequeños subconjuntos de células resistentes, es decir, células madre cancerosas [8], [30]. En los últimos años la técnica de SP se ha convertido en uno de los métodos más utilizados para el aislamiento de CSC-CL. Dado que el método detallado de tinción y la medición de Goodell et al. fue introducido por primera vez, muchos investigadores han informado de que las células SP son un subconjunto de células con alto grado de malignidad, y las características de CSC-lcs [15], [16], [31]. Con respecto al RCC, Addla et al. informaron de que células SP representaron el 4-6% del total de células cancerosas. Sin embargo, las características celulares de células SP no se entienden bien [17].
En nuestro estudio, se encontró que las fracciones de SP en ACHN y KRC /Y fueron de 1,4% y 1,7%, respectivamente. No hubo diferencias entre las células de NSP KRC /Y SP y en la tumorigenicidad, capacidad de formación de esfera, o en la resistencia a Sorafenib o IFNa, que se usan convencionalmente para el tratamiento de RCC avanzado. Estos resultados indican que las células KRC /Y SP carecen de las características de los CAC-CL. Por el contrario, mientras que no hubo diferencias significativas entre las células ACHN SP y NSP en el crecimiento celular o de formación de colonias ensayos in vitro, las células SP mostraron una esfera más alta capacidad de formación, mayor resistencia IFNa y superior tumorigenicidad en ratones NOD /SCID que las células de NSP , sugestivo de células con propiedades CSC-LC se incluyen en células SP ACHN. En la actualidad el enfoque SP es el método más ampliamente utilizado para identificar marcadores de CSC, sin embargo, muchos investigadores siguen cuestionando la relación entre células madre cancerosas y células SP [32] - [34]. Además, Ibrahim et al. estudiado la relación entre la concentración de la tinción de Hoechst y el tiempo de incubación y concentración informado de que Hoechst tinción tuvo un efecto en el daño celular [35]. En nuestro estudio, a fin de identificar las células SP en ACHN y KRC /Y se utilizó la tinción de Hoechst a una concentración de 5 mg /ml y 10 mg /ml, respectivamente. Hoechst tinción se lleva a cabo generalmente a una concentración de 5 mg /ml, pero en el presente estudio se utilizó una concentración más alta en células KRC /Y [36]. Por lo tanto, no podemos descartar por completo la posibilidad de que el daño celular debido a la tinción de Hoechst era responsable de la diferencia en las características biológicas observadas entre las células KRC /Y in vivo e in vitro en nuestro estudio actual.
Bussolati et al. se informó anteriormente en una línea celular RCC humano que las células CD105 positivas representan un grupo de células con alta clonogenicidad y alta tumorigenicidad; Sin embargo, nuestro presente estudio encontró que mientras que las células KRC /Y SP contenían alrededor de cinco veces más células CD105 positivas como células KRC /Y NSP, no hubo diferencias en las propiedades CSC-LC entre las células NSP KRC /Y SP y. Además, la expresión de CD105 se encontró en unas pocas células en la ACHN. Por lo tanto, nuestros resultados actual conflicto con los hallazgos de Bussolati et al., Y sugieren la posibilidad de que CD105 puede no ser un marcador universal CSC en el CCR.
Muchos estudios recientes han informado de que las células SP muestran una mayor expresión de transportadores ABC, especialmente ABCG2, que las células de NSP en muchos tumores sólidos y líneas celulares, y que esto puede desempeñar un papel en el flujo de salida de drogas y la resistencia a los medicamentos. La expresión de transportadores de fármacos a través de ABCG2 es un marcador importante en la identificación y análisis de células SP [19], [20], [31], [37]. En nuestro estudio, se observó ninguna diferencia en la expresión ABCG2 en el ARNm entre SP y las células de NSP en cualquiera de las dos líneas celulares de RCC estudiados. Sin embargo, en los últimos años varios estudios han informado de que las células SP expresan otros transportadores, tales como ABCB1 y ABCB5, además de ABCG2 [38], [39]. Por lo tanto, este resultado puede ser debido a la expresión de los otros transportadores en células SP, o puede ser debido a que las funciones de ABCB1 y ABCG2 no se reflejaron por la expresión de mRNA de estos genes. Este punto debe ser más estudiado.
A continuación, con el fin de estudiar otros marcadores CSC, se realizó un ensayo Aldefluor. actividad enzimática ALDH1 ha sido reconocida en los últimos años como un marcador general de ambas células y células madre cancerosas [40] madre normales, [41]. células ALDH1-positivas tienen características CSC-LC, tales como la capacidad de auto-replicarse y formar tumores, por lo que un número de investigadores han utilizado la actividad enzimática ALDH1 como marcador CSC en muchos tipos diferentes de cáncer, incluyendo cáncer de pulmón, el hígado, el páncreas , de próstata, de vejiga, de mama y melanoma maligno [42] - [46]. También se ha informado de mama y otros tipos de cáncer que la expresión de alto ALDH1 está estrechamente asociada con un mal pronóstico clínico [23]. Recientemente, ensayos de formación de esferas han sido ampliamente utilizados para evaluar la capacidad de auto-renovación de las CL-CSC.