Extracto
Antecedentes
La vitamina E α- análogo redox silencio se encontró succinato de tocoferol (α-TOS) para cooperar sinérgicamente con la vitamina K3 (VK3) más ácido ascórbico (AA) en la inducción de la apoptosis selectiva de células de cáncer a través de una vía independiente de caspasas. Aquí se investigó el mecanismo molecular subyacente (s) de muerte celular inducida en células de cáncer de próstata por α-TOS, VK3 y AA, y el uso potencial de la combinación de fármacos específica en el tratamiento de cáncer de próstata.
Metodología /Principal hallazgos
La generación de ROS, la respuesta celular al estrés oxidativo, y la autofagia en las células se investigaron cáncer de próstata PC3 mediante el uso de medicamentos en dosis sub-tóxicos. Evaluamos si el factor inductor de apoptosis PARP1 mediada (AIF) de liberación juega un papel en la apoptosis inducida por la combinación de los agentes. A continuación, el efecto de la combinación de α-TOS, VK3 y AA sobre el crecimiento tumoral se examinó en ratones desnudos. VK3 más AA indujo la formación de ROS temprano asociado con la inducción de la autofagia en respuesta al estrés oxidativo, que se redujo por α-TOS, evitando la formación de autofagosomas. α-TOS induce la desestabilización mitocondrial que conduce a la liberación de AIF. Translocación de AIF de la mitocondria al núcleo, un resultado del tratamiento combinatorio, estaba mediada por la activación PARP1. La inhibición de la AIF, así como de PARP1 atenúan eficazmente la apoptosis desencadenada por la combinación de fármacos. El uso de un modelo de ratón de cáncer de próstata, la combinación de α-TOS, VK3 y AA fue más eficiente en la supresión de tumores que cuando se dan por separado las drogas, sin efectos secundarios perjudiciales.
Conclusiones /Importancia
α-TOS, un agente apoptótico mitocondrias de metas, cambia a dosis sub-apoptóticas de supervivencia autofagia dependiente de las células cancerosas a su desaparición por la promoción de la inducción de la apoptosis. Dado el pronóstico sombrío para los pacientes de cáncer, este hallazgo es de potencial relevancia clínica
Visto:. Tomasetti M, L Nocchi, Neuzil J, J Goodwin, Nguyen M, Dong L, et al. (2012) alfa-tocoferil succinato inhibe la autofagia supervivencia de las células del cáncer de próstata inducida por la vitamina K3 y ascorbato de causar muerte celular. PLoS ONE 7 (12): e52263. doi: 10.1371 /journal.pone.0052263
Editor: Kamyar Afarinkia, University of Bradford, Reino Unido
Recibido: 26 de Junio, 2012; Aceptado: 12 Noviembre 2012; Publicado: 18 de diciembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Tomasetti et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención de la Fundación de cáncer de próstata de Australia en JN, y la parte adicional por la financiación de la investigación de la Universidad Politécnica de Marche. No se recibió financiación externa adicional para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las mitocondrias han surgido recientemente como objetivos interesantes para los fármacos contra el cáncer [1] - [3]. Vitamina K3 (VK3), una versión sintética de la vitamina K, exhibe actividad citotóxica en las células cancerosas por causar daño mitocondrias dependiente a modo de ciclo redox, así como la inhibición selectiva de la ADN polimerasa-γ, la enzima clave de ADNmt replicación [3], [4]. Para potenciar su efecto anti-cáncer, VK3 se ha combinado con el ácido ascórbico redox-activo (AA). El peróxido de hidrógeno generado por la combinación VK3-AA se ha informado de inducir la muerte celular en diferentes tipos de cáncer [5], [6].
VK3-AA inducida por el estrés oxidativo podría ser diferente en las células tumorales y normales metabolismo de la célula, y puede permitir la manipulación diseñada para mejorar la terapia del cáncer. Sin embargo, en respuesta a las células de estrés oxidativo activar vías que promueven su supervivencia y la adaptación [7]. Uno de tales mecanismos de respuesta al estrés es la autofagia [8], [9]. ROS puede inducir la autofagia, que puede contribuir a la muerte celular independiente de caspasas o, por el contrario, la autofagia puede promover un papel protector contra la muerte mediada por ROS [10], [11]. Por lo tanto, el descubrimiento de moléculas que regulan la autofagia puede ser de gran importancia en el desarrollo de fármacos para el tratamiento de cáncer de
.
concentraciones Recientemente, sub-letales de VK3 y AA, junto con una dosis sub-apoptótica de α-tocoferil succinato (α-TOS), han demostrado inducir eficazmente la muerte celular del cáncer de próstata que se caracteriza por la fragmentación del ADN, lisosomal /perturbación mitocondrial, citocromo
c
liberación, mientras que carecen de la activación de caspasa [12]. La evidencia creciente sugiere que las vías independiente de caspasas juegan un papel importante en la muerte por cáncer, y el factor inductor de apoptosis (AIF) está emergiendo como un mediador central de este proceso [13] - [16]. Relevantes a esta premisa, la activación de la enzima poli reparación del ADN (ADP-ribosa) polimerasa-1 (PARP1) ha sido reportado como esencial para la liberación AIF por un mecanismo que implica Ca
2 + afluencia en el citosol [17] - [20].
el uso de dosis sub-tóxica de α-TOS con concentraciones sub-tóxicos de VK3 + AA previamente identificados [12], se evaluó el efecto de la α-TOS en la autofagia mediada por ROS provocada por VK3 y AA. También se investigó el mecanismo (s) implicado en la muerte celular inducida por la combinación del agente. Nos informan de que VK3 más AA indujeron la formación de ROS temprana asociada con la inducción de la autofagia en respuesta al estrés oxidativo. La inhibición de la autofagia al descubierto el papel protector de la autofagia inducida por AA VK3 + en las células PC3. α-TOS fue encontrado para reducir la formación de ROS inducida por AA + VK3 deroga la ROS desencadena la formación de autofagosomas. Sin embargo, ROS producidas eran suficiente para inducir la activación de PARP1, lo que resulta en la liberación del factor de AIF pro-apoptóticos, la promoción de la muerte celular que se manifiesta por características de la apoptosis, incluyendo condensación de la cromatina. La relevancia clínica de esta investigación es proporcionado por la supresión sustancial de cáncer en los ratones tratados con la combinación de los tres agentes.
Resultados
α-TOS inhibe la autofagia provocada por ROS genera en respuesta a VK3 y el tratamiento AA
se ha informado de que las dosis sub-tóxicos de la combinación de VK3 (3 M) con AA (0,4 mM) dio lugar a la generación intracelular de ROS, pero las células murieron sólo en presencia de α -TOS (30 M) [12]. Para dilucidar el papel del estrés oxidativo en el tratamiento de combinación, la formación de ROS y las respuestas celulares al estrés oxidativo (autofagia) se evaluaron con el tiempo. El tratamiento de células PC3 con VK3 y AA resultó en la formación de moléculas relacionadas con peróxido dentro de 30 min, después de lo cual la señal fluorescente asociado-ROS volvió a su nivel basal. Mientras α-TOS solo indujo una formación tardía de moléculas relacionadas con peróxido, que se observó después de 120 minutos de incubación, se redujo el incremento temprano en sus niveles en respuesta al tratamiento de las células con VK3 y AA solo (Fig. 1A, panel izquierdo). Para investigar si las mitocondrias son la principal fuente de generación de ROS, los niveles de superóxido se evaluaron utilizando dihydroetidium (DHE). Tras la interacción con el superóxido, DHE produce bromuro de etidio (EtBr) que se acumula en el núcleo y produce fluorescencia roja [21]. Higo. 1A (panel derecho) los documentos aumentan los niveles de superóxido dentro de 20-60 minutos de tratamiento de las células con VK3 y AA que se redujo en presencia de α-TOS. El EtBr tinción nuclear DHE derivados se detectó en el tiempo utilizando microscopía de fluorescencia, e indica que después del tratamiento con VK3 y AA, se formaron las vesículas apoptóticas que contienen componentes nucleares en la superficie celular después de 60 a 120 min; 36-46% de las células eran EtBr-negativo (células pálidos) como consecuencia de la pérdida de la cromatina. se observó Reducción del número de células con blebs nuclear (18% de las células pálidos) en incubación prolongada. Las células se recuperaron después de 180 minutos de incubación, lo que indica un proceso reversible. La presencia de α-TOS marcadamente inhibida la "recuperación" de las vesículas como lo demuestra el aumento de las células pálido (66%), la promoción de las células de la muerte (fig. 1B).
(A) se trataron células PC3 con un-TOS (30 mM), VK3 y AA (3 M VK3, AA 0,4 mM) y evaluado para la generación de ROS mediante DCF (un indicador de peróxido de hidrógeno) o DHE (un indicador de superóxido), expresado como intensidad media de fluorescencia. Se evaluaron las células para el aumento de la fluorescencia utilizando citometría de flujo. (B) la visualización microscópica de células PC3 DHE-manchado siguientes tratamientos farmacológicos a través del tiempo. Tras la interacción con el superóxido, DHE (puntuar azul) se obtiene bromuro de etidio (EtBr) que se acumula en el núcleo y da fluorescencia roja (panel superior). Las ampollas que contienen la cromatina nuclear dañada reducen tinción EtBr nuclear (células claras). La citometría de flujo cuantificación de células pálido (células EtBr-negativas, panel inferior) se realizó en células PC3 tratadas como se indica. Los datos mostrados son los valores medios ± S. D. (N = 3), las imágenes de microscopio son representativos de tres experimentos independientes. Magnificación × 600, barra de escala = 10 micras.
Después de haber documentado que la generación inducida por el tratamiento farmacológico de ROS, el próximo examinado sus efectos sobre la autofagia en las células PC3 por la evaluación del patrón de expresión de los microtúbulos proteína-1 -asociado (LC3), por microscopía electrónica de transmisión (TEM), y mediante la formación de orgánulos vacuolar ácidas [22]. existe LC3 en dos formas, LC3-I (18 kDa) y LC3-II (16 kDa), estando este último unido a la membrana y el aumento durante la autofagia mediante la conversión de la primera [23]. células PC3 tratadas con VK3 y AA mostraron un nivel más alto de la proteína LC3-II en 60 a 120 min después del tratamiento, que se inhibe en presencia de α-TOS (Fig. 2A). TEM se realizó en células PC3 siguientes varias combinaciones de tratamiento. Las células de control y tratadas con α-TOS presentaron mitocondrias con crestas bien definido, doble membrana intacta, la densidad homogénea y forma cilíndrica. La aparición de un gran número de autofagosomas con una estructura de doble membrana en el citoplasma se observó por TEM después de 120 min de tratamiento con VK3 + AA, con poco efecto sobre la morfología mitocondrial. En contraste, cuando VK3 y AA se combinaron con α-TOS, prominente mitocondrias anormal con crestas desorganizado, disminución de la densidad de electrones y el aumento en el eje menor se observaron consistentes con hinchamiento mitocondrial, mientras que la formación de autofagosomas no fue detectado (Fig. 2B). La captación de la fluorescencia roja AO apoya aún más el efecto inhibidor de α-TOS en la autofagia inducida por AA VK3 + (Fig. 2C).
células PC3 (A) fueron tratados con los fármacos como indicado y el nivel de la proteína LC3-II normalizado a a-actina se expresan como media ± SD del LC3-II /LC3-I densitometría relación. (B) células PC3 se trataron con los fármacos, como se indica por 2 h y se evaluó la morfología por TEM. 4.000 × magnificación, barra de escala = 0,5 micras (imágenes superiores), ampliación de 9.000 ×, bar = 0,5 m; N = núcleo, m = mitocondrias, a = autofagosomas. células PC3 (C) fueron tratados como se indica, y la formación de los AO-acumulan orgánulos vesiculares ácidos (fluorescencia naranja-rojo) fue detectado mediante citometría de flujo. (D) células PC3 se trataron como se indica en presencia o ausencia de inhibidores de la autofagia (3 mA y CQ), y la viabilidad celular se assed después de 24 h de incubación. (E) La formación de autofagosomas en células de control (1) y en la presencia 3MA (2) y CQ (3) se evaluó por transferencia Western como la expresión de LC3-II después de 2 h de los tratamientos farmacológicos. Los datos se expresan como un cambio con respecto a los controles no tratados, y son valores medios ± S. D. (N = 3), las imágenes son representativos de tres experimentos independientes. * P & lt;. 0,05, en comparación con los controles
A continuación se preguntó si la autofagia afecta a la muerte celular. Para abordar esta cuestión, la autofagia fue suprimida con el 3MA inhibidor farmacológico (inhibición de fase temprana) y CQ (inhibición de fase tardía). PC3 células fueron tratadas con α-TOS o VK3 + AA y α-TOS + VK3 + AA. Como se muestra en la Fig. 2D, la inhibición de proceso de reducción de la viabilidad celular autophagic temprano en las células tratadas con AA VK3 + en un grado comparable a lo observado cuando α-TOS se combinó con VK3 + AA. Este efecto no se encontró cuando el bloqueo de la última etapa de la vía de la autofagia. La formación de autofagosomas en ausencia o presencia de los inhibidores autofágicas 3 mA y CQ se evaluó como expresión de LC3-II después de los tratamientos de drogas (2 h). La expresión mezcla de AA + inducida VK3 LC3-II que fue inhibida en presencia de 3MA pero no CQ (Fig. 2E). Esto indica que la autofagia es una respuesta protectora a VK3 + muerte celular AA inducida, y la inhibición de la autofagia en la primera fase es una estrategia para inducir la muerte celular.
Mecanismo de α-TOS, VK3 y AA- inducida por la muerte celular
Para investigar el mecanismo (s) involucrado en la muerte celular inducida por la combinación α-TOS con VK3 + AA, hemos evaluado el papel de la FIA. fraccionamiento subcelular mostró que sólo cuando a-TOS (30 mM) se combinó con VK3 (3 M) y AA (0,4 mM), AIF re-distribuido desde la mitocondria al citoplasma y al núcleo (Fig. 3A). Para probar si AIF re-distribución está involucrado en la muerte celular inducida por la combinación de los tres agentes, la proteína fue silenciado y la viabilidad celular evaluada. Como se muestra en la Fig. 3B, siRNA dirigidos FIA silenciado de manera eficiente la expresión FIA que, a su vez, la muerte celular inducida atenuado por la combinación de α-TOS, VK3 y AA. La eficacia de la AIF siRNA se documenta en la Fig. 3C.
El panel (a) muestra imágenes microscopio de fluorescencia de FIA translocación al núcleo después de 180 minutos de tratamiento con un-TOS (30 mM), VK3 y AA (3 M VK3, AA 0,4 mM) solo o en combinación (panel izquierdo). La translocación nuclear de AIF se demuestra por distribución similar del rojo (AIF-TRITC) y la señal de color azul (núcleo); magnificación × 600, barra de escala = 10 micras. El panel derecho muestra el análisis de transferencia Western de FIA translocación en las fracciones celulares. Orgánulos (org), citoplasma (cito) y (Nucl) fracciones nucleares se obtuvieron a partir de células PC3 tratadas con los medicamentos como anteriormente y el nivel de AIF evaluado. células PC3 se transfectaron con ARNsi NS o AIF siRNA, y se evaluó su nivel de proteína AIF (C). Las células transfectadas se trataron como anteriormente para 24 h de incubación y se evaluó su viabilidad usando el ensayo de MTT (B). Los datos mostrados son los valores medios ± S. D. (N = 3), las imágenes son representativos de tres experimentos independientes. El símbolo "*" indica estadísticamente diferentes resultados para las células transfectadas con siRNA-FIA siRNA- y NS con p. & Lt; 0,05
Para determinar la relación directa entre el aumento de los niveles de ROS intracelular y la muerte celular mediada por la FIA inducida por el tratamiento combinatorio, las células PC3 se trataron previamente con el antioxidante NAC, que de manera eficiente bloqueado translocación citoplasmática y nuclear de AIF inducida por los tres agentes, lo que indica el papel de ROS (Fig. 4A, B). La inhibición de la AIF translocación nuclear se asoció con una abrogación de la muerte celular inducida por fármacos (Fig. 4 C, D). Además, para comprobar si el re-distribución de AIF se produce es una manera independiente de caspasas, las células fueron expuestas a los tres agentes en presencia del inhibidor de pan-caspasa z-VAD-fmk, que ni bloqueado AIF translocación ni ejerce cualquier efecto protector contra el tratamiento combinatorio (Fig. 4 A-D).
el panel (A) documenta FIA-TRITC visualizó mediante microscopio de fluorescencia, magnificación × 600, barra de escala = 10 micras. (Panel izquierdo), y las imágenes de Western Blot (panel derecho) de FIA translocación al citosol y el núcleo after180 min tratamiento con un-TOS (30 mM), VK3 y AA (3 M VK3, AA 0,4 mM) en ausencia o presencia de NAC (10 mM) o z-VAD-fmk (10 M). La densidad de la banda FIA se normalizó el uso â-actina o lamina, y se expresa como media ± S. D. FIA
cito-FIA
nucl /FIA
org relación densitometría. (SEGUNDO). efecto citotóxico del tratamiento combinatorio en células PC3 en ausencia o presencia de NAC (10 mM) y z-VAD-fmk (10 M) se evaluó como la viabilidad celular después de 24 h de exposición de las células a los fármacos (C), y micrografías de contraste de fase de la célula tratada correspondientemente se representan (D); magnificación × 200, barra de escala = 100 micras. Los datos mostrados son los valores medios ± S. D. (N = 3), las imágenes son representativos de tres experimentos independientes. El símbolo "*" indica resultados estadísticamente diferentes para no tratada
vs tratado
células PC3 en ausencia o presencia de NAC o zVAD- FMK con p & lt;.
0,05
La entrada ha sido previamente informó de que el daño del ADN mediada por ROS desencadena la activación de PARP1 y posterior muerte celular [24]. activación PARP1 genera el polímero PAR en el núcleo y se translocan a las mitocondrias para mediar la liberación AIF [20]. Para aclarar la relación entre la FIA y PARP1, se evaluó la liberación FIA y la actividad PARP1 en las células PC3 después de la exposición a alfa-TOS, VK3 y AA en diferentes puntos temporales. AIF translocación al citoplasma era detectable dentro de 5 a 60 min del tratamiento combinatorio de las células, y la liberación citoplásmica de AIF era concomitante con la activación PARP1. En contraste, la translocación de FIA entre el núcleo se retrasó por al menos 60 min (Fig. 5A, B). La inhibición de PARP1 por 3ABA atenúa tanto la translocación nuclear AIF (Fig. 5C, D) y la inducción de muerte celular (Fig. 6 E, F).
El panel A muestra la cinética de la actividad de liberación y el panel B AIF de PARP1 en PC3 células expuestas a alfa-TOS (30 mM), VK3 (3 M) y AA (0,4 mm). El panel C muestra micrografías de fluorescencia utilizando PARP1-FITC y FIA-TRITC (magnificación de 600 ×, barra de escala = 10 micras) (panel izquierdo), y las imágenes de Western blot (panel derecho) de PARP1 y el AIF translocación al núcleo después de 180 minutos de tratamiento con á-TOS + VK3 + AA en ausencia o presencia de 3ABA (2 mM). (D) La densidad de banda FIA se normalizó a A-actina o lamina y se expresan como media ± S. D. del FIA
cito-FIA
nucl /FIA
org relación densitometría. (E) Efecto citotóxico del tratamiento combinatorio en células PC3 en ausencia o presencia de 3ABA se evaluó como la viabilidad celular después de 24 h de exposición de las células a los fármacos. Panel F muestra micrografías de contraste de fase de las células tratadas con los tres fármacos con o sin 3ABA; magnificación × 200, barra de escala = 100 micras. Los datos mostrados son los valores medios ± S. D. (N = 3), las imágenes son representativos de tres experimentos independientes. El símbolo "*" indica resultados estadísticamente diferentes para no tratada vs células PC3 tratadas en la ausencia o presencia de 3-ABA con p & lt; 0,05
El tratamiento con α-TOS + VK3 + AA suprime la progresión del tumor.
con el fin de evaluar el efecto anticancerígeno de los tres fármacos, Balb-c ratones desnudos con xenoinjertos PC3 fueron tratados por vía oral con dosis sub-tóxicos de VK3 (3 mg /kg), AA (400 mg /kg), y con α-TOS (15 mg /kg) administrada por vía intraperitoneal, y con las combinaciones VK3 + AA, o α-TOS + VK3 + AA. Una inhibición del crecimiento tumoral significativa se observó en el grupo de VK3 más el tratamiento AA; este efecto se ha mejorado considerablemente en tiempos prolongados de tratamiento cuando los dos agentes se combinaron con α-TOS (Fig. 6A). La terapia combinatoria con los tres fármacos inducidos ADN capítulo romper la formación (TUNEL positividad), que corresponde a un proceso de apoptosis, que se asoció con la translocación nuclear FIA (Fig. 6B). zonas de muerte mayores de células tumorales se encontraron en ratones expuestos a la terapia de tri-combinatoria con respecto a los ratones no tratados (85 ± 16 × 10
3 m
2
vs
238 ± 45 × 10
3 m
2, respectivamente,
p Hotel & lt; 0,05). Este tratamiento parece ejercer ninguna toxicidad detectable lado, ya que los ratones no mostró pérdida de peso, así como no hay signos de citotoxicidad en el riñón y el hígado como se detecta por la evaluación histológica y por análisis bioquímicos (datos no mostrados).
(a) Balb-c ratones desnudos con xenoinjertos derivados células PC3 se trataron mediante administración oral de VK3 (3 mg /kg) andAA (400 mg /kg), y la inyección intraperitoneal de un-TOS (15 mg /kg) solo o en combinación, como se indica, a 5 veces por semana, y el volumen del tumor (mm
3) se cuantificó por pinzas. (B), secciones de tumores incluidas en parafina fijadas con formalina (5 micras) fueron inspeccionados para TUNEL positividad (verde salpicado células) (magnificación de 200 ×, barra de escala = 100 m) y fueron manchados de inmuno con anti-FIA IgG (flechas blancas indica translocación nuclear de FIA-TRITC y núcleos picnóticos detectado usando DAPI); magnificación × 400, barra de escala = 50 micras. Los datos de volumen de los tumores son la media ± SEM (n = 8), no se encontraron diferencias significativas entre los ratones de control y ratones individuales tratados con el fármaco, mientras que no se encontraron diferencias significativas entre los ratones de control y los animales VK3 + AA tratados en los días 22-31 ( p = 0,034) y α-TOS + + VK3 animales tratados con AA en los días 43-49 (p = 0,043).
Discusión
se utilizó la administración oral de AA y VK3 en el tratamiento de pacientes con cáncer de próstata [25]. Este enfoque era beneficioso cuando la combinación de fármacos se administra conjuntamente con agentes quimioterapéuticos conocidos [26]. De acuerdo con ello, la co-administración de dosis subletales de AA + VK3 (sistema redox-activo) con el redox silencioso α-TOS dio lugar eficiente
vitro
la muerte celular en. La combinación de VK3 + AA se muestra de forma sinérgica para promover la producción de peróxido de hidrógeno en el medio extracelular [12], [27].
De acuerdo con las observaciones anteriores, se encontró que la combinación de AA + VK3 causó rápida generación tanto de peróxido de hidrógeno (DCF fluorescencia) y superóxido (fluorescencia DHE), alcanzando un máximo de 10 a 20 min y 30 a 60 min de exposición de las células a los dos fármacos (
cf
la Fig. 1A). En respuesta a este estrés oxidativo, las células activan la vía de la autofagia. Esto se evidencia por la formación de vesículas nucleares y vesículas autofágicas (orgánulos vacuolar ácidos), así como aumento de los niveles de la proteína LC3-II (
cf
la Fig. 2A-C). Sin embargo, después de 180 min de este tratamiento, las células se recuperaron completamente. Esto se demuestra por tinción nuclear DHE EtBr la oxidación inducida, que documenta que el aumento del índice de las células pálidas observados después de 60 minutos de tratamiento con VK3 + AA disminuyó notablemente durante períodos de tiempo prolongados (
cf
Fig. 1B). El 3MA inhibidor de la autofagia (proceso autophagic temprano) desencadena la muerte celular inducida por AA VK3 + indica que la autofagia es un mecanismo de protección en el contexto de las células PC3 (
cf
Fig. 2D). Estos hallazgos indican que el estrés oxidativo temprana da lugar a una respuesta adaptativa de las células cancerosas que permite su recuperación de la lesión. Por otra parte, las dosis sub-apoptóticos de α-TOS indujo una reducción en la formación de ROS provocada por VK3 + AA (
cf
la Fig. 1A). Podemos plantear la hipótesis de que la hidrólisis de α-TOS por esterasas en las células conduce a la generación de α-tocoferol (α-TOH), que actúa como un eliminador de ROS [28]. Como se encuentra anteriormente [29], se observó que el ROS generado en respuesta a alfa-TOS consisten principalmente de especies relacionadas con peróxido, pero no superóxido. En contraste, se informó de α-TOS para inducir la producción de superóxido a través de la interacción con el complejo II de la cadena respiratoria mitocondrial [30]. No podemos excluir que en nuestras condiciones experimentales, las dosis sub-tóxicos ofα-TOS conducen a la generación de bajas cantidades de superóxido, que pueden ser dismutated rápidamente y escapar a la detección.
No hay formación de autofagosomas o la morfología alterada de orgánulos se observó en las células tratadas α-TOS- y VK3 + AA (
cf
la Fig. 2A-C). Esto vincula la reducción de la tensión de oxidación "adaptable" temprano con la prevención del proceso de autofagia inducida por la combinación de solo VK3 + AA, y se ve corroborada por TEM, revelando la ausencia de autofagosomas en las células tratadas por la combinación de los tres drogas (
cf
Fig. 2B). La inhibición de la autofagia inducida byα-TOS promovido aparición de un mayor subconjunto de células pálidas, formación de ampollas nuclear y mitocondrial hinchazón con crestas desorganizado y disminución de la densidad de electrones, todas las características de la muerte celular. Por lo tanto, la inclusión de α-TOS en el tratamiento combinatorio de células PC3 inhibe los mecanismos de adaptación y la supervivencia que lleva a la inducción de la muerte.
La inducción de la autofagia se ha informado para promover la supervivencia de las células tumorales, de ese modo contrarrestar o limitar la eficacia de la inducción de muerte celular por agentes quimioterapéuticos, poniendo en peligro el resultado de la terapia del cáncer [31]. De acuerdo con esta idea, nuestros datos muestran un papel protector de la autofagia tras la exposición de las células PC3 a VK3 y AA. Se encontró que las células tratadas, las cuales tuvieron una morfología que recuerda a (autofagia) la muerte celular, una importante recuperación, y sólo una pequeña fracción de las células con el potencial transmembrana mitocondrial alterada estaba más allá de rescate y murieron en estas condiciones.
se encontró anteriormente que la apoptosis se retrasa en células que carecen de las proteínas Bax y Bak que son necesarios para mitocondrial permeabilización de la membrana exterior (MOMP), que es una característica de la muerte celular apoptótica y un requisito previo para que la célula cruzar el "punto de no retorno "[32]. Se encontró que α-TOS induce la translocación de Bax en la mitocondria en células de cáncer de mama [33] - [36]. Otro informe documentado α-TOS para inducir la apoptosis mitocondrial que implica el eje FoxO1-Noxa-Bak [37], [38]. Una vía intrínseca independiente de caspasas mediada por AIF a través de Bak se ha descrito anteriormente [39]. El fragmento soluble FIA es liberado de las mitocondrias sobre la permeabilización de la membrana externa a través de Bax /Bak poros [40]. Mostramos que la liberación de AIF de las mitocondrias es necesario para la muerte celular inducida por el tratamiento combinatorio de las células de cáncer de próstata con α-TOS + VK3 + AA en dosis sub-tóxicos de los agentes individuales. Silenciando la proteína FIA de siRNA atenuado considerablemente la muerte de las células PC3 inducidos por el tratamiento combinatorio (
cf
Fig. 3).
producción de ROS juega un papel clave en la liberación de AIF y el posterior promoción de la muerte celular. Se documenta que esta premisa se cumple para nuestro sistema, lo que demuestra que el eliminador de ROS NAC completamente derogada la muerte de las células PC3 expuestos a la combinación de α-TOS + VK3 + AA (
cf
Fig. 4). Documentamos además que la activación PARP1 ROS dependiente está asociada con la liberación de AIF de la mitocondria al núcleo (
cf
Fig. 5). En respuesta al daño del ADN, PARP1 cataliza la síntesis y transferencia de unidades PAR a las proteínas aceptoras, en el que la modulación de sus actividades y la regulación de la reparación del ADN [41], [42]. Sin embargo, el daño del ADN excesiva activa un programa de muerte celular dependiente de PARP1 único, que es independiente de caspasas pero dependiente de AIF [43]. Incluso si en menor medida con respecto a VK3 + AA, la combinación AA α-TOS + VK3 + inducida formación temprana ROS, que se encontró previamente para inducir daño en el DNA temprana [12]. El daño en el ADN inducido por ROS provocó un aumento robusto en la actividad PARP1, que resultó en la liberación de AIF de la mitocondria en el citoplasma, y en relación con el núcleo. Por lo tanto, como consecuencia de la activación sa PARP1, la proteína AIF transloca desde el citoplasma al núcleo, dando como resultado la inducción de la condensación de la cromatina con la consiguiente muerte celular (
cf
Fig. 5).
otros han observado que las dosis altas de la autofagia inducida por AA en las células del cáncer de próstata, que no se recuperaron y se cometieron a morir [10], [44]. Diferentes dosis de los fármacos ejercen diferentes efectos sobre las células mediante la producción de cantidades variables de ROS. Basado en el insulto ROS, las células responden de manera diferente por la inducción de su supervivencia o programa de muerte. Aquí, las dosis sub-tóxicos de VK3 + AA indujo un insulto ROS no es capaz de desencadenar la muerte celular, pero sin causar daños de los orgánulos celulares con la activación posterior del proceso autophagic supervivencia. La presencia de α-TOS reduce el insulto oxidativo inducido por AA + VK3, inhibiendo así la respuesta de supervivencia celular. Sin embargo, el ROS formados fueron suficientes para inducir la activación PARP1 resulta en la liberación FIA y la muerte celular subsiguiente.
Teniendo en cuenta la posible actividad anticancerosa de los tres agentes, el efecto de la combinación de α-TOS + VK3 + AA sobre el crecimiento tumoral se examinó en ratones desnudos. La administración oral de la mezcla de VK3 + AA redujo significativamente el crecimiento del tumor en los días 22 a 31 (p = 0,034). No TUNEL positividad se encuentra en las secciones de los tumores tratados con AA VK3 +, lo que sugiere que la reducción en el tamaño del tumor inducida por VK3 + AA era debido a la inhibición del crecimiento tumoral en lugar de la muerte celular (
cf
Fig 6A). Esto es corroborado por el hecho de que en el momento de la prolongada exposición al fármaco (días 35-49) los tumores re-comenzaron a crecer. El tratamiento con α-TOS + VK3 + AA crecimiento significativamente inhibido tumor (días 43-49, p = 0,04), la inducción de amplias zonas de la muerte celular asociada con AIF translocación nuclear en comparación con los animales de control y los tratados con los fármacos individuales (
cf
Fig. 6A, B). En particular, el efecto anti-tumor de la α-TOS + VK3 + combinación AA se asoció con ningún signo de efectos deletéreos secundarios. Estos hallazgos apoyan la
in vitro
datos que muestran que α-TOS inhibe la recuperación de las células del cáncer y la supervivencia después del tratamiento AA VK3 +, induciendo la muerte celular eficiente en tiempos prolongados de exposición a la combinación de los tres agentes.
Conclusiones
Muchos factores tales como la vascularización del tumor y la captación celular de cáncer afecta las concentraciones de fármaco dentro de la masa tumoral. Por lo tanto, a nivel del tumor, los fármacos contra el cáncer podrían ser no en el nivel de matar incluso cuando se administra en altas concentraciones. Así, en lugar de inducir la muerte celular, los bajos niveles de fármacos contra el cáncer podría inducir una respuesta adaptativa que conduce las células cancerosas para proliferar. Aquí, se encontró que la respuesta celular adaptativa al estrés oxidativo inducido por el sistema redox-activo de VK3 + AA fue superado por la combinación con el agente redox-silencioso α-TOS, lo que provocó un cambio de la supervivencia autophagic a la muerte celular (Fig . 7). Dado que los niveles séricos de la anti-cáncer agentes estaban por debajo del límite de detección, su farmacocinética no se evaluó, por lo tanto, la concentración efectiva de los agentes que podrían traducirse en entornos clínicos no son conocidos con precisión. En la práctica clínica, las dosis bajas de AA y VK3 se pueden conseguir fácilmente mediante la administración oral. Desde α-TOS convierte completamente a la ineficiente α-tocoferol después de la aplicación oral, la administración intravenosa o transdérmica representa una manera plausible de alcanzar sus niveles farmacológicos y el efecto anti-cáncer. A pesar de los métodos clínicos de la administración, que aún no se ha probado, este informe demuestra el uso potencial de la combinación de fármacos dirigidos en el tratamiento del cáncer de próstata.
La combinación VK3 + AA induce la formación de ROS (i), a