Extracto
El papel de la capa mesotelial en el peritoneal propagación de las células cancerosas se aclara sólo parcialmente. Aquí hemos tratado de definir mejor la contribución mesotelial a la adhesión de células tumorales usando una prueba de adhesión directa aplicado a cultivos primarios humanos de células mesoteliales (HPMC) derivados de los lavados peritoneales de los pacientes con cánceres gástricos y colorrectales. células de carcinoma gástrico y de colon fueron sembradas en diferentes monocapas mesoteliales y se realizó el análisis de fluorescencia cuantitativa para analizar su crecimiento y propiedades adhesivas. La adhesión de las células cancerosas no se vio afectada por el origen de las HPMCs cuando se derivan de pacientes con diferentes tipos de cáncer o con enfermedad benigna. Por el contrario, los altos niveles de expresión ICAM1 y la producción de ROS, que caracterizan estas células mesoteliales senescentes, mejoran la adhesión de células tumorales. Estos resultados sugieren que las propiedades adhesivas mesoteliales son dependientes de la senescencia celular, mientras que no se ven afectadas por el ambiente del tumor. La sucesión de lavados peritoneales como fuente para aislar HPMC ofrece una herramienta práctica y fiable para el análisis in vitro de las condiciones mesoteliales que afectan a la carcinomatosis peritoneal
Visto:. Ranieri D, S Raffa, Parente A, Rossi Del Monte S, V Ziparo, Torrisi MR (2013) de alta adhesión de células tumorales a mesoteliales monocapas derivados de Lavado peritoneal de los cánceres gastrointestinales diseminada. PLoS ONE 8 (2): e57659. doi: 10.1371 /journal.pone.0057659
Editor: Giuseppe Viglietto, Universidad Magna Grecia, Italia |
Recibido: 9 Octubre, 2012; Aceptado: 24 Enero 2013; Publicado: 25 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Ranieri et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue parcialmente apoyado por becas de MIUR y de AIRC - Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 10272), Italia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El peritoneal difusión de los cánceres gástricos y colorrectales representa un evento frecuente que ocurre después de la resección curativa [1] - [3]. Crítica para la recurrencia peritoneal es la adhesión de las células libres diseminadas de cáncer a la capa mesotelial y muchos diferentes mecanismos moleculares implicados directamente en este proceso han sido identificados [4]. Para carcinomatosis peritoneal, las células cancerosas deben ser capaces de sobrevivir en la cavidad peritoneal, una vez separado del tumor primario, y deben mostrar un comportamiento proliferativa e invasiva, una vez adherido a la mesotelio. Aunque muchos estudios se han dirigido al análisis de la expresión y activación de las vías moleculares responsables de los cambios biológicos secuenciales de los diferentes tipos de células cancerosas [5] - [7], sólo un número limitado de informes se han centrado en la contribución de [8] la capa mesotelial en la adhesión y peritoneal difusión del cáncer -. [10]
Para el análisis detallado de los mecanismos moleculares que afectan a la fase de adhesivo, diferente en modelos in vitro o ex vivo se han desarrollado [11] - [13] y se han obtenido cultivos primarios de células mesoteliales para poner a prueba la adhesión de células de cáncer en presencia de promover o interferir agentes [8], [12]. La mayoría de estos modelos utilizan bien establecido líneas celulares o cultivos primarios humanos de las células mesoteliales aisladas a partir de fragmentos de epiplón [10], [14] - [15]. Sin embargo, se ha propuesto que también los lavados peritoneales, siendo el estándar de oro para evaluar la presencia de diseminación peritoneal del cáncer gástrico y colorrectal [16] - [18], son una fuente buena y más práctico de las células mesoteliales para ser reproducido in vitro [19], aunque su uso en modelos de co-cultivo no ha sido explorado.
las moléculas de adhesión desempeñan un papel importante en la etapa que implica la unión de las células de cáncer libres a la superficie peritoneal [4] y citoquinas, tales como interleucina 1ß (IL1ß) y factor de necrosis tumoral α (TNF) dio a conocer en el microambiente inflamatorio, se sabe que promueven su expresión [20], [21]. Entre las moléculas de adhesión que juegan un papel clave en la propagación de las células neoplásicas a la monocapa mesotelial, varios estudios señalaron la función específica de la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM1) presente en las células mesoteliales en la promoción del proceso [10], [21]; Además, se ha demostrado que la sobre-modulación de su expresión, como resultado del estrés oxidativo y la senescencia de las células peritoneales, promueve la adhesión de células neoplásicas de los cánceres de ovario, gástrico y de colon [22] - [24], lo que demuestra la función general y crucial de ICAM1 en la difusión.
en el intento de definir mejor la contribución mesotelial a la adhesión de las células cancerosas y, en particular, el posible papel de la activación mesotelial en un entorno canceroso imitando in vitro lo más posible las condiciones in vivo, se utilizó aquí una prueba de adhesión directa a cabo en cultivos primarios humanos de células mesoteliales (HPMC) derivados de los lavados peritoneales de los pacientes con tumores gástricos y colorrectales o de pacientes con enfermedades benignas, con el fin para imitar in vitro lo más posible las condiciones in vivo. Con el objetivo de minimizar las posibles variaciones atribuibles a la contraparte tumor, que se correspondía con diferentes HPMCs aisladas, cultivadas también en diferentes niveles de la senescencia, con dos líneas celulares de cáncer bien conocidos. Nuestros resultados muestran que el comportamiento adhesivo de las células cancerosas no se ve afectada por el origen de los HPMC de pacientes con diferentes tumores. Sin embargo, nuestras observaciones confirman el papel de la senescencia peritoneal, a través de la mayor producción de especies reactivas de oxígeno y de expresión ICAM1, en la promoción de la adhesión de células tumorales [22] - [24] y sugieren que el uso de los lavados peritoneales como fuente para aislar y propagar HPMC se pueden aplicar fácilmente para evaluar in vitro el estado del mesotelio en pacientes con cáncer.
Materiales y Métodos
las líneas celulares
el mesotelial humana Met línea celular 5A [25] se cultivó en Modificado de Dulbecco /F12 Medio de Eagle (DMEM /F12) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) más antibióticos e hidrocortisona (0,1 mg /ml), insulina (2,5 mg /ml), transferrina (2,5 mg /ml) y selenio (2,5 ng /ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MD, EE.UU.). La línea humana colorectal adenocarcinoma de células Caco2 [18], [26] se cultivó en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con 10% de FBS más antibióticos (Sigma). El adenocarcinoma gástrico humano línea de células AGS [18] se cultivó en medio F12 de Ham (Sigma) suplementado con FBS al 10% más antibióticos (Sigma).
cultivos primarios y co-cultivos
Los cultivos primarios de Human peritoneal células mesoteliales (HPMC) se obtuvieron de lavados intraoperatoriamente peritoneal [18] de los pacientes afectados por carcinomatosis peritoneal por cáncer colorrectal (# 062) o cáncer gástrico (# 219), así como de los pacientes afectados por la enfermedad no cancerosa (# 002), que se sometió a una cirugía en la Unidad de cirugía a del hospital de San Andrés. Las características de los donantes clinicopatológica se describen en la Tabla 1. Todos los pacientes fueron informados ampliamente y dieron su consentimiento por escrito para la investigación. El protocolo del estudio fue aprobado por el Consejo de Ética del Hospital de San Andrés, Roma.
Para evitar la posible activación de las células peritoneales por el proceso quirúrgico, los lavados peritoneales fueron obtenidos en las etapas iniciales de la cirugía. De cada paciente, 40 ml de lavado peritoneal se recogieron en EDTA (50 mM). Los lavados peritoneales se centrifugaron a 1100 rpm durante 5 minutos a TA y se aglomeraron. Las muestras se volvieron a suspender para el etiquetado magnético en 80 l de tampón de separación MACS® (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). Para eliminar el componente de las células epiteliales del lavado peritoneal y en consecuencia para enriquecer la porción mesotelial, el agotamiento inmunomagnética usando microperlas anti-CD326 /EpCAM (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, columnas de separación MS (MACS®, Miltenyi Biotec) había sido equilibrada con tampón de separación 0,5 ml de MACS® y las microperlas células marcadas se someten a través del campo magnético el paso de la columna. Las células CD326 negativos se lavaron fuera de la columna, y se sembraron en DMEM /F12 que el anterior.
Para los experimentos de adhesión, Met-5A o HPMC se cultivaron hasta la confluencia y después de Caco2 24h o células AGS se sembraron en la monocapa.
el análisis morfológico de HPMC
Para el análisis morfológico HPMC, se observaron las muestras de cultivo en un Zeiss Axiovert 200 microscopio invertido equipado con contraste de fase (DIC) óptica (Zeiss, Oberkochen , Alemania). El análisis cuantitativo de células multinucleadas y multivacuoladas se realizó por recuento, para cada cultivo de células, un total de al menos 250 células observadas en cinco campos microscópicos tomada al azar de tres experimentos diferentes. Todos los resultados se expresaron como valores medios ± SE. La significación se calculó mediante la prueba de Kruskal-Wallis o emparejado prueba de la t de Student.
P
valores & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos
inmunofluorescencia
Para las células de caracterización HPMC se cultivaron en cubreobjetos y se fijaron con paraformaldehído al 4% seguido de tratamiento con 0,1. M glicina durante 20 minutos a 25 ° C y con 0,1% Triton X100 durante otros 5 minutos a 25 ° C para permitir la permeabilización. Las células fueron incubadas durante 1 hora a 25 ° C con los siguientes anticuerpos primarios: anti-citoqueratinas (reconocimiento de CK8 y CK19 entre otras CKs) (1:100 en PBS; clon MNF116; Dako, Glostrup, Dinamarca) anticuerpo monoclonal; anti-vimentina (1:100 en PBS; clon V9; Dako) anticuerpo monoclonal; anti-calretinina (1:100 en PBS; clon DAK Calret 1; Thermo Fisher Scientific Inc., Fremont, CA, EE.UU.) anticuerpo monoclonal; anti-CEA (1:100 en PBS; Zymed, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) anticuerpos policlonales; anti-EpCAM (1:10 en PBS; Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemania) anticuerpo monoclonal conjugado directamente con PE; anti-ICAM1 (1:10 en PBS; STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canadá) anticuerpo monoclonal conjugado con FITC directamente
Los anticuerpos primarios conjugados se visualizaron, después de un lavado con PBS apropiada, usando cabra anti-ratón. FITC (1:50 en PBS; Research Products Cappel, Durham, Carolina del Norte), de cabra anti-ratón rojo de Texas (1:200 en PBS; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, EE.UU.), de cabra anti-conejo FITC (1: 400 en PBS; Cappel Investigación). Para identificar las células en ciclo, la inmunotinción se realizó con anticuerpos policlonales de conejo anti-Ki67 (1:50 en PBS; Zymed Laboratories, San Francisco, CA). Los núcleos se tiñeron con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1:10.000 en PBS; Sigma). Los cubreobjetos se montaron finalmente con 90% de glicerol en PBS para la observación. Las señales de fluorescencia se visualizaron con el sistema de ApoTome (Zeiss) conectado con un microscopio Axiovert 200 invertido (Zeiss) y análisis de imágenes se llevó a cabo por el software Axiovision (Zeiss) y el software de analizador de imágenes KS300 (Zeiss).
Porcentaje de se analizaron las células EpCAM /Ki67 positivos en co-cultivos de Met-5A y células AGS o Caco2 contando un total de 500 células observadas al azar en 5 campos microscópicos para cada uno de los diferentes puntos de tiempo (1h, 24h, 48h) durante el transcurso del tiempo de el experimento. Porcentaje de células ICAM1-positivas en HPMC se analizó el recuento para cada cultivo primario de un total de 300 células, observado al azar en 10 campos microscópicos de tres experimentos diferentes. El análisis cuantitativo de la intensidad de fluorescencia ICAM1 se realizó mediante el análisis de 100 células para cada muestra en cinco campos diferentes, tomada al azar de tres experimentos diferentes. Todos los resultados se expresaron como valores medios ± SE. La significación se calculó mediante la prueba de Kruskal-Wallis o la prueba de la t de Student;
p & lt
valores; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Ensayo de adhesión
Subconfluent Caco2 o células AGS se trataron con tripsina y se resuspendieron en DMEM libre de suero y se marcaron con 5 l /ml de solución Vybrant®DiI (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) mediante incubación durante 30 minutos a 37 ° C. Las células marcadas con DiI se lavaron tres veces y se resuspendieron en DMEM /F12 que el anterior. Las células marcadas se sembraron directamente sobre la monocapa mesotelial (25 × 10
3 /cm
2 de monocapa) y se incubaron durante 1, 24, 48 horas. En los ensayos de adhesión con el anticuerpo de bloqueo anti-ICAM1 (StemCell Technologies), la incubación se realizó en presencia de diferentes diluciones (1:10, 1:5 y 1:2) del anticuerpo. Un anticuerpo no relacionado (anti-citoqueratinas; clon MNF116; Dako) se utilizó como control negativo a la dilución 1:02. Las células no adherentes se eliminaron mediante abundantes lavados con medio libre de suero, y las células y HPMC adherentes monocapas se fijaron con paraformaldehído al 4%, seguido de tratamiento con 0,1 M de glicina durante 20 minutos a 25 ° C y con 0,1% Triton X-100 para 5 minutos más a 25 ° C para permitir la permeabilización. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Los núcleos se tiñeron con DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) (1:10.000 en PBS; Sigma). El análisis cuantitativo de DiI-positivas células /mm
2 se realizó contando el número de células positivas en 10 campos ópticos diferentes de 2,24 mm
2, tomadas al azar de tres experimentos diferentes. Los resultados se han expresado como valores medios ± SE. Los valores de p se calcularon utilizando la prueba de nivel y la importancia de Kruskal-Wallis se definió como p. & lt; 0,05
detección de especies reactivas del oxígeno detección
Para las especies reactivas de oxígeno (ROS), las células se incubaron con HPMC 2 ', 7'-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA, Fluka) (5 mM) durante 10 min a 37 ° C, se lavó extensamente con PBS e inmediatamente se observa bajo un microscopio Axioskop 2 equipado con Pascal LSM 5 de exploración láser confocal (Zeiss, Oberkochen , Alemania), utilizando un láser de argón con una banda de excitación 488 nm. El pase largo emisión era un 505 filtro: constante la intensidad del láser, se mantuvieron la configuración del agujero de alfiler de diámetro y fotomultiplicadores para cada experimento [27]. Para la optimización del método, HPMC#062 en el paso 2 se trataron con los pro-oxidante hidroperóxido de cumeno (Fluka Chemika, AG, Buchs, Suiza) a diferentes dosis (100 y 200 mM) en presencia o no de la anti-oxidante la vitamina E (15 mg /ml) antes de la adicción de DCFH-DA. La intensidad de fluorescencia (FUI, Intensidad de fluorescencia unidades) se midió por Zeiss KS300 software analizador de imagen (Zeiss) la evaluación de por lo menos 200 células para cada condición en tres campos microscópicos diferentes. Los datos presentados se expresan como valores medios ± error estándar de tres experimentos diferentes. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t pareada nivel y la importancia del estudiante ha sido definida como
p Hotel & lt; 0,05
La generación de ROS intracelular basal fue también medido por el ensayo de cytofluorimetric.. Los HPMCs#062, tratados con DCFH-DA que el anterior, se tripsinizaron, se sedimentaron, se resuspendieron en medio de pre-calentado y recogidos con el flujo de MACSQuant® analizador FACSCalibur (Miltenyi Biotec GmbH). Longitudes de onda de excitación y emisión fueron 488 y 525 nm, respectivamente (canal FL2). La señal de fluorescencia verde se analizó mediante software MACSQuantify® (Miltenyi Biotec GmbH) y se visualizó en una escala logarítmica de tres décadas. La intensidad media de fluorescencia (MFI) se calculó a partir de tres experimentos independientes con la evaluación de por lo menos 20.000 acontecimientos para el ensayo y se expresó como intensidad de fluorescencia relativa (media ± SE). Se realizó un análisis estadístico mediante el emparejado prueba t de Student con un nivel de significación definida como
p
. & lt; 0,05
Resultados
Optimización de la prueba in vitro para la evaluación de la adhesión de las células cancerosas a las monocapas mesoteliales
Uno de los primeros paso clave en la diseminación metastásica peritoneal de los tumores gastrointestinales es la adhesión de las células cancerosas a la monocapa mesotelial [4]. Para estudiar el comportamiento biológico del cáncer y las células mesoteliales y evaluar sus propiedades de adherencia, primero seleccionadas y adaptadas a nuestras condiciones de un sistema de co-cultivo y un ensayo in vitro para la adhesión (fig. 1A), utilizado anteriormente para el cáncer de ovario [12]. La línea de células mesoteliales humana Met-5A se hizo crecer a confluencia y células de adenocarcinoma gástrico humano (línea celular AGS) o células de carcinoma de colon humano (línea celular Caco2) fueron sembradas en co-cultivo a una densidad de 25.000 células /cm
2 de la monocapa mesotelial
a) dibujo esquemático del sistema de co-cultivo y el ensayo de adherencia utilizada durante todo el estudio:. células cancerosas se siembran en una monocapa mesotelial para evaluar la adhesión celular. B) Met-5A línea de células mesoteliales se hizo crecer a confluencia y AGS o células Caco2 se sembraron en la monocapa mesotelial en co-cultivo (25.000 células /cm
2). Después de 24 horas desde la siembra, el co-cultivo se fijaron, permeabilizaron y se tiñeron con un anticuerpo primario dirigido contra vimentina, seguido de un Ab secundario marcado con el fluorocromo FITC (verde) para identificar las células mesoteliales. inmunofluorescencia doble con anticuerpo α-EpCAM PE (rojo) se realizó para reconocer las células epiteliales cancerosas. núcleos celulares se tiñeron con DAPI (azul). El análisis de inmunofluorescencia revela los diferentes tipos de células en nuestro modelo de co-cultivo. La señal correspondiente a la vimentina en la monocapa celular es compatible con la de los filamentos intermedios, como paquetes citoplasmáticos perinuclear, mientras que la tinción de EpCAM se asocia con la membrana plasmática de las células cancerosas. Ambos AGS y células Caco2 aparecen ya sea en pequeños grupos o aisladas y estrictamente adherente a las células mesoteliales. Bar: 10 micras. C) La microscopia de contraste de fase se utiliza para verificar la integridad de la monocapa mesotelio. Después de 48 horas desde la siembra, las células Caco2 adherentes muestran un patrón de crecimiento en islas compactos, mientras que las células que se adhieren AGS muestran una forma más aplanada y un patrón de aislados de crecimiento. Bar: 100 micras. ensayo D) Proliferación realizado por la tinción de inmunofluorescencia con un anticuerpo primario anti-Ki67, que identifica ciclo de las células, seguido de un secundario marcado con FITC Ab (verde). Las células tumorales se marcaron con el anticuerpo anti-EpCAM PE Ab como anteriormente. Después de 48 horas desde la siembra, la distribución de las células cancerosas positivas para la señal nuclear Ki67 revela un comportamiento diferente del crecimiento del tumor: a diferencia de las células AGS aislados, el Ki67
+ células Caco2 se encuentran en la periferia de las islas. Bar:. 100 micras
Para identificar los diferentes tipos de células en nuestro modelo de co-cultivo, se utilizó inmunofluorescencia (IF) de microscopía. Después de 24 horas desde la siembra, para reconocer las células mesoteliales que componen la monocapa Met-5A, teñidas los co-cultivos con un anticuerpo primario dirigido contra vimentina, un componente de los filamentos intermedios del citoesqueleto, seguido de un Ab secundario marcado con el fluorocromo FITC (verde): la señal era compatible con la estructura y localización de la vimentina, que aparece como haces de citoplasma perinuclear de filamentos (Fig 1B.). Las células cancerosas se marcaron con anticuerpo α-EpCAM PE, el reconocimiento de una molécula de adhesión epitelial humano y directamente conjugado con el PE fluorocromo (rojo): la señal correspondiente se asoció con la membrana plasmática de las células adherentes a la monocapa (Fig. 1B) . Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (azul). Ambos AGS y células Caco2 aparecieron ya sea en pequeños grupos o aislado y estrictamente adherente a las células mesoteliales (Fig. 1B).
Para la evaluación de las propiedades adhesivas de las células cancerosas, se utilizó la microscopía de contraste de fase, que permitido para verificar la monocapa mesotelio y eliminado cualquier duda sobre la posibilidad de que las células cancerosas se adhieren al soporte de vidrio o plástico. El análisis morfológico después de 48 horas desde la siembra mostró que las células Caco2 adherentes muestran un patrón de crecimiento en islas compactos (Fig. 1C). En contraste, las células AGS adheridas se caracterizan por una forma más aplanada y un patrón más aislados de crecimiento (Fig. 1C).
Para entender mejor el comportamiento biológico observado en microscopía de contraste de fase y para evaluar la tasa de proliferación de las células adherentes, se utilizó el análisis de SI con el marcador Ki67 que identifica células en bicicleta. Después de 48 horas desde la siembra, los co-cultivos se tiñeron con un anticuerpo anti-Ki67 primaria, seguido de un Ab secundario marcado con FITC (verde). Las células tumorales se marcaron con el anticuerpo anti-EpCAM PE Ab como anteriormente. Mientras que la tasa de proliferación de los tipos de células dos se adhieren, evaluada como el porcentaje de las células positivas para la señal nuclear Ki67 era comparable (21% ± 2 y 23% ± 2 para las células Caco2 y AGS, respectivamente; prueba de Kruskal-Wallis:
p
= NS), su distribución reveló un comportamiento diferente de las células cancerosas (Fig. 1D). De hecho, a diferencia de las células AGS, el Ki67
+ células Caco2 se encuentran en la periferia de las islas, como se espera de su capacidad espontánea para diferenciar in vitro [26].
Para una evaluación cuantitativa de la adhesión de las dos líneas celulares de cáncer a la monocapa de Met-5A, que utiliza los trazadores Dil celular lipófilos para etiquetar las células cancerígenas antes de la prueba de adhesión [12]. La Figura 2A muestra los resultados obtenidos por el uso contemporáneo de DiI y tinción con DAPI de los co-cultivos en diferentes puntos de tiempo (1 h, 24 h, 48h) de la siembra. Imágenes de 10 campos ópticos diferentes se tomaron al azar como se describe en materiales y métodos. Los números de DiI
+ células cancerosas por mm
2 se calcula entonces y se analizaron estadísticamente como se describe en materiales y métodos. Los resultados de la Figura 2B mostraron que tanto las células AGS Caco2 y se adherían a la monocapa mesotelial en cantidad igual a la 1 h de co-cultivo. Sin embargo, la adhesión de las células Caco2 tenía la tendencia a doblar después de 24 y 48 horas, mientras que las células AGS, aunque ligeramente, pero significativamente el aumento en número durante el intervalo de tiempo, fueron menos numerosas que las células Caco2, ya sea en puntos de tiempo (
p
& lt; 0,05). Debido a que la tasa de proliferación de los dos tipos de células a las 48 horas, como se describió anteriormente, no reveló diferencias que pueden explicar el mayor número de células Caco2 que se adhieren a la monocapa en comparación con las células AGS, los resultados de la prueba basada en DiI aparecieron para reflejar real de diferentes propiedades adhesivas.
a) Met-5A monocapa mesotelial se cultivó como se describe anteriormente. Caco2 y las células AGS se marcaron con el trazador de DiI y luego sembradas en la monocapa como anteriormente. Después de 1, 24 y 48 horas, se lavaron los cocultivos, se fijaron y permeabilizaron. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Bar: 200 micras. B) Análisis cuantitativo de la cantidad de adherente DiI
+ células /mm
2 se realizó como se describe en materiales y métodos. Mientras que después de 1 hora de sembrar tanto Caco2 y las células AGS se adhieren a la monocapa en cantidad igual, en los puntos 24 y 48 horas de tiempo el número de células Caco2 es casi el doble en comparación con la de AGS, lo que aumenta sólo ligeramente, pero significativamente en el tiempo . Los resultados se expresan como valores medios ± IC 95%. Estadística: prueba de la t de Student:
* p & lt; 0,01 vs
AGS 1 hora;
** p
& lt; 0,001 frente a Caco2 1 hora y AGS 24 horas; ***
p Hotel & lt; 0,01 frente a AGS 1 hora y
p = NS vs
AGS 24 horas; ****
p
. & Lt; 0,001 frente a Caco2 24 horas
La adhesión de las células cancerosas a monocapa mesotelial humana primaria derivados de lavados peritoneales
Para evaluar la posible papel del mesotelio en el proceso de adhesión de las células cancerosas en nuestro sistema de co-cultivo, se utilizó la prueba anterior con cultivos primarios de células mesoteliales obtenidos del lavado peritoneal de pacientes afectados por carcinomatosis peritoneal por cáncer gástrico o colorrectal y la no enfermedad carcinoma. De hecho, el lavado peritoneal representa una fuente práctica de las células mesoteliales [19], en lugar de la utilización de fragmentos de epiplón.
Para caracterizar las células humanas peritoneales mesoteliales (HPMC), obtenido como se describe en materiales y métodos, se utilizó microscopía de inmunofluorescencia (Fig. 3). Para reconocer las células mesoteliales primarias de otros tipos de células presentes en el lavado peritoneal, tales como los fibroblastos y las células cancerosas epiteliales, teñidas los cultivos con una combinación de anticuerpos dirigidos contra marcadores mesoteliales conocidos, tales como la vimentina, citoqueratinas (CK8 y CK19) y calretinina. Para asegurarse de que las células eran de origen mesenquimal y no epitelial, que se utilizó en paralelo los mismos anticuerpos en células Caco2. Los resultados mostraron que las HPMCs fueron positivas tanto para vimentina y citoqueratina tinción, que apareció como paquetes citoplasmáticos perinuclear de los filamentos intermedios (paneles de la Fig. 3, izquierda). Como era de esperar, las células se tiñeron negativamente Caco2 para vimentina y se marcaron positivamente para citoqueratinas (Fig. 3, paneles de la derecha). Para discriminar de manera inequívoca las HPMCs de fibroblastos posiblemente presentes en nuestros cultivos, las células se marcaron con anticuerpos contra calretinina, una proteína de unión a calcio intracelular perteneciente a la troponina-C superfamilia expresado en células mesoteliales: la señal era en citosólicas puntos calientes (Fig. 3, panel derecho). Una vez más, las células Caco2 epiteliales fueron negativos (Fig. 3, panel izquierdo). Por el contrario, HPMC fueron negativos para el EpCAM marcador epitelial que se expresó en las membranas plasmáticas de las células Caco2 (Fig. 3, los paneles inferiores, la señal de rojo) y para el antígeno carcinoembrionario marcador tumoral CEA, cuya señal era visible ya sea en puntos intracelulares o en las superficies de las células (Fig. 3, paneles de fondo, señal verde).
los cultivos primarios de células mesoteliales peritoneales humanas (HPMC) fueron aisladas de lavados peritoneales como se describe en materiales y métodos. Se utilizaron células de cáncer de colon Caco2 como control. El análisis de inmunofluorescencia usando anticuerpos dirigidos contra mesotelial (vimentina, CK8 y citoqueratinas CK19 y calretinina) y epitelial (EpCAM y CEA) marcadores de muestra que HPMCs son positivas para vimentina y la tinción de citoqueratina, que aparece como haces perinuclear de filamentos, así como para el caliente señal calretinina -spotted, pero son negativos para la tinción de EpCAM membrana plasmática y para la señal de CEA intracelular y la superficie. células Caco2 son positivas para citoqueratinas y doble positivo para el EpCAM y CEA marcadores epiteliales visibles en las superficies celulares (EpCAM, señal verde) o en las membranas plasmáticas y en lugares intracelulares (CEA, la señal de color rojo). Los núcleos se tiñeron con DAPI. Bar: 20 micras
Para una evaluación cuantitativa de la capacidad de las dos líneas celulares de cáncer (células AGS y Caco2) para adherirse a diferentes monocapas de HPMC, hemos utilizado el trazador Dil como antes para marcar el. las células cancerosas antes de la prueba de adhesión. Para el análisis se utilizó tres cultivos primarios de células mesoteliales, derivados de los lavados peritoneales de pacientes sin enfermedad carcinoma (Fig. 4A), con cáncer colorrectal (Fig. 4B) o con el cáncer gástrico (Fig. 4C) y pudimos comparar la contribución de las diferentes monocapas mesoteliales a la adhesión del mismo tipo de células de cáncer en diferentes puntos de tiempo (1 h, 24 h, 48h). El análisis cuantitativo de la adhesión de DiI
+ células a las monocapas de HPMC (Fig. 4A-C) mostraron niveles de adhesión reducida en intervalo de tiempo para las dos líneas celulares tumorales en comparación con el ensayo de adherencia realizado en Met-5A (ver fig. 2B). En estas monocapas de cultivo primario, las células Caco2 eran más adherentes que las células AGS en 24 o 48 horas, independientemente del origen de los lavados peritoneales. Sin embargo, mientras que la adhesión de las células Caco2 era comparable a todas las capas mesoteliales, independientemente de su fuente de pacientes con enfermedad neoplásica o benigno, las células AGS muestran diferencias significativas en su comportamiento, que muestra mayor adhesión a las HPMCs de paciente con cáncer de colon (# 062) respecto a los HPMC de cualquiera de los pacientes de cáncer gástrico (# 219) o de enfermedades no-carcinoma (# 002). Por lo tanto, mientras que las propiedades de adhesión de las monocapas mesoteliales aparecen independiente sobre el medio ambiente cáncer, nuestro modelo de co-cultivo es capaz de detectar diferencias entre las HPMCs
.
HPMCs aislado del lavado peritoneal de un paciente no cáncer ( a,#002), de la de un paciente de cáncer de colon (B,#062) y de la de un paciente de cáncer gástrico (C,#219), fueron cultivadas a monocapa confluente como anteriormente. Caco2 y las células AGS se marcaron con Dil, se sembró en las capas de HPMC, dejaron adherir durante diferentes puntos de tiempo (1, 24 y 48 horas) y luego se lavaron, se fijaron y se permeabilizaron. Los núcleos se tiñeron con DAPI. El análisis cuantitativo de la cantidad de adherente DiI
+ células /mm
2 se realizó como se describe en materiales y métodos. Independientemente del origen de los lavados peritoneales, las células Caco2 muestran niveles más altos de adhesión al respecto AGS a las 24 y 48 horas. Sin embargo, mientras que la adhesión de las células Caco2 es similar a todas las capas mesoteliales, las células AGS muestran diferencias significativas, mostrando mayor adhesión al respeto capa#062 al#219 y la#002. Los resultados de los análisis cuantitativos se expresan como valores medios ± IC del 95%. Kruskal-Wallis prueba: A)
* p & lt; 0,05 frente a
la hora AGS 1; **
p Hotel & lt; 0,01 vs Caco2 1 hora,
p Hotel & lt; 0,01 frente a AGS 24 horas; ***
p Hotel & lt; 0,05 frente a la hora de AGS 1 y
p = NS vs
el AGS 24 horas; ****
p Hotel & lt; 0,01 vs Caco2 24 horas. B)
* p & lt; 0,01 vs
la hora AGS 1; **
p Hotel & lt; 0,01 vs Caco2 1 hora,
p = NS vs
AGS 24 horas; ***
p Hotel & lt; 0,01 frente a la hora de AGS 1,
p = NS
AGS 24 horas; ****
p Hotel & lt; 0,01 vs Caco2 24 horas. C)
* p & lt; 0,01 vs
la hora AGS 1; **
p Hotel & lt; 0,01 vs Caco2 1 hora,
p Hotel & lt; 0,01 frente a AGS 24 horas; ***
p Hotel & lt; 0,05 frente a la hora de AGS 1,
p = NS
24 horas AGS; ****
p
. & Lt; 0,001 frente a Caco2 24 horas
Papel de HPMC senescencia en el proceso de adhesión
Para analizar por nuestro modelo la contribución de posibles mecanismos celulares y moleculares que pueden jugar un papel en las diferentes propiedades adhesivas de las HPMC, nos centramos nuestra atención en la senescencia mesotelial. De hecho, entre las características fisiológicas de la monocapa mesotelial, se cree que el nivel de la senescencia de HPMC para promover la adhesión de células tumorales [22] - [24]. Curiosamente, nuestros HPMC, se derivan de los lavados peritoneales en lugar de a partir de muestras epiplón, ya aparecen en la primera in vitro pasaje las características bien conocidas de la senescencia, como una morfología ampliada, múltiples núcleos y vacuolización citoplásmica [14].