Extracto

La anemia de Fanconi (FA) de los pacientes son muy susceptibles para tumores sólidos en múltiples sitios anatómicos, incluyendo la cabeza y el cuello. Un subgrupo de cánceres de cabeza y cuello (HNCS) se asocia con los VPH de "alto riesgo", en particular HPV16. Sin embargo, la correlación entre los oncogenes VPH y el cáncer en pacientes con AF no está aún clara. Anteriormente hemos aprendido que la deficiencia de FA en ratones predispone HPV16 E7 ratones transgénicos para HNCS. Para hacer frente a potencial oncogénico de HPV16 E6 con deficiencia de FA en HNCS, hemos utilizado ratones HPV16 E6-transgénicos (
K14E6
) y los ratones HPV16 E6 /E7-bi-transgénico (
K14E6E7
) sobre fondos genéticos suficiente o deficiente para uno de los
fanc
genes,
FANCD2 Opiniones y monitoreados su susceptibilidad a HNCS.
K14E6
los ratones no desarrollaron tumores. Sin embargo, E6 y
FANCD2
-deficiency aceleraron E7-impulsado el desarrollo de tumores en
K14E6E7
ratones. El aumento de la incidencia de tumores fue mayor correlación con el daño del ADN impulsada por el E7 de proliferación. También se encontró que la deficiencia de proteínas de bolsillo, pRb, p107, p130 y que son objetivos de E7 bien establecida, podría recapitular la inducción de daño en el ADN de E7. Nuestros resultados apoyan la hipótesis de que el E7 induce HNCS asociados al VPH mediante la promoción de daño en el ADN a través de la inactivación de proteínas de bolsillo, lo que explica por qué una deficiencia en la reparación del daño en el ADN aumentaría la susceptibilidad al cáncer impulsada por el E7. Nuestros resultados demuestran una vez más el hallazgo inesperado de que la deficiencia de FA no predispone E6 ratones transgénicos para HNCS, lo que indica una especificidad en la sinergia entre la FA y la deficiencia de VPH oncogenes en la causa de HNCS

Visto:. Parque JW, Shin MK, de Pitot HC, Lambert PF (2013) alta incidencia de VPH asociados a cáncer de cabeza y cuello en ratones deficientes FA se asocia con la inducción de E7 del daño del ADN a través de su inactivación de proteínas de bolsillo. PLoS ONE 8 (9): e75056. doi: 10.1371 /journal.pone.0075056

Editor: Joseph S Pagano, La Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, Estados Unidos de América

Recibido: 15 Julio, 2013; Aceptado: 6 Agosto de 2013; Publicado: 23 Septiembre 2013

Derechos de Autor © 2013 Park et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. La fuente de financiación de este trabajo fue Institutos nacionales de Salud (NIH) (CA098428, CA022443). NIH tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Anemia de Fanconi (FA), que es una enfermedad genética heterogénea y recesiva rara, muestra defectos de desarrollo y anormalidades en las células madre hematopoyéticas tales como insuficiencia de la médula ósea y la leucemia mieloide aguda, los principales fenotipos que se muestran en la primera infancia de los pacientes . Hasta la fecha, 15 genes celulares (
fanc
genes) han sido identificados por el cual las mutaciones homocigóticas se asocian con la enfermedad FA.
fanc
productos génicos (Fanc) están componiendo una vía de reparación del ADN llamada ruta Fanconi con varias otras proteínas celulares para ayudar a reparar el ADN dañado, específicamente entre cadenas de ADN enlaces cruzados (ICL) daños. Ocho de las proteínas Fanc (FANCA, B, C, E, F, G, L y M) interactuar entre sí y formar un complejo proteico llamado el núcleo complejo FA. FANCL en el complejo, que tiene un
E3
actividad de ubiquitina ligasa poner mono-ubiquitina en FANCD2 /I en la respuesta de los daños del ADN [1]. Además, estancadas horquillas de replicación de ADN en fase S activa la vía de FA [2]. El mono-ubiquitina FANCD2 /I se localizan en sitios de daño en el ADN que interactúan con otras proteínas que se sabe están involucrados en la reparación del ADN dañado, como el BRCA1, FANCD1 /BRCA2, FANCN /PALB2 y Rad51 que conducen a la reparación del ADN [3, 4]. La interrupción de esta vía FA conduce a aumento de la sensibilidad al ADN reticulantes, inestabilidad cromosómica, intercambio de cromátidas hermanas espontánea, y perturbaciones del ciclo celular [5,6]. Estudios recientes mostraron que el mono-ubiquitinated FANCD2 recluta moléculas efectoras críticas tales como la nucleasa FAN1 (o SLX4) a través de sus dominios de unión a ubiquitina-[7,8]. Por lo tanto, mono-ubiquitinación de FANCD2 es fundamental para no sólo su localización de la cromatina pero que también actúa como un andamio para factores de reparación de ADN específicos. La vía de FA actúa junto con el sistema de reparación de recombinación homóloga (HR) para mantener la inestabilidad genómica [9]. El agotamiento de FANCD2 inhibe la respuesta de la HR, lo que indica que la HR actúa aguas abajo de FANCD2 [10]. El aumento de la inestabilidad genómica se cree que contribuye a la mayor susceptibilidad de los pacientes de AF con el cáncer. Trasplante de progenitores hematopoyéticos (TPH) podría ser una solución para ayudar a los defectos en las células hematopoyéticas. Incluso después de la exitosa TPH, carcinomas de células escamosas (SCC) en las regiones de cabeza y cuello se convierten en un alto riesgo de los pacientes [11-15].

Un subgrupo de cánceres de cabeza y cuello (HNCS) (~ 25%) , principalmente entre los tumores de la orofaringe en la población general es positivo para el virus del papiloma de alto riesgo humano (VPH), en particular HPV de tipo 16 (HPV16) que codifica los tres oncogén, E5, E6, y E7 [16,17]. En particular, los pacientes con AF de América del Norte un alto porcentaje (84%) de HNC que surge en varios sitios de la región de la cabeza y el cuello (es decir, no se limita a la orofaringe) resultaron ser positivos para VPH de alto riesgo [18]. Consistente con un papel de VPH en estos tipos de cáncer, las mutaciones en p53, un supresor de tumor que se inactiva por HPV16 E6, no se encontraron en HNCS de estos pacientes. Sin embargo, en los pacientes de los países europeos, HNCS fueron ADN de VPH negativo y más del 50% de estos tumores tenían mutaciones de p53 [18,19]. Teniendo en cuenta estos datos clínicos en conflicto, no queda claro si los VPH juegan un papel importante en HNCS que surgen en los pacientes con AF. Varios estudios apuntan a una contribución de la deficiencia de FA en la enfermedad asociado al VPH en el nivel molecular. En cultivo de tejidos, la expresión de HPV16 E7 se demostró para estimular la transcripción de
FANCD2
[20] y activar la vía FA [21]. En otro estudio haciendo uso de cultivos organotípicos de queratinocitos humanos para recapitular el ciclo de vida del VPH, HPV16 y HPV18 hiperplasia epitelial inducida se incrementó en
FANCA
células deficientes en células o derribados en su expresión; mientras que, la restauración de
FANCA
expresión atenúa este efecto [22]. Estos estudios indican que hay una interacción entre el VPH y la vía de FA.

Nuestro laboratorio desarrollado un modelo animal para HNCS asociados al VPH utilizando HPV16 ratones transgénicos oncogén cuando se tratan con un carcinógeno químico, 4NQO, que induce aductos de ADN similar a las causadas por agentes carcinógenos tabaco asociada sinergia con oncogenes HPV16 para inducir HNC [23]. Los cánceres que se originan en nuestra histopatológico cuota de modelo animal y las propiedades moleculares con HNCS VPH positivas en los seres humanos. El sitio en el que surgen los tumores es menos restrictiva que en los seres humanos, presumiblemente reflectantes del patrón de expresión HPV transgén en todo el epitelio GI bucal /superior del ratón. Entre E6 y E7, HPV16 E7 tiene un mayor potencial para causar HNC en modelos animales [23,24] con E6 contribuir al aumento de la incidencia en combinación con E7 [25]. La contribución de HPV16 E5 a HNC en este modelo de ratón no se ha evaluado completamente, pero parece ser mucho menor que la de E7 (Strati y Lambert, resultados no publicados).

Se evaluó previamente la influencia de la ruta Fanconi en la incidencia de HNCS en ratones que expresan sólo el oncogén HPV16 E7. La deficiencia en la vía de FA altamente aumentó la incidencia de tumores impulsado-E7 de HPV16 [26]. Sin embargo, en los cánceres humanos positivos al HPV, E7 se encuentra siempre a ser co-expresada junto con E6. Por lo tanto, realizó estudios descritos en este documento a las influencias de direcciones vía FA en cabeza y cuello la carcinogénesis en el contexto de ratones que expresan E6 solo o junto con E7. En concreto, hemos generado
K14E6
y
K14E6E7
ratones transgénicos en
FANCD2
fondos -sufficient y deficientes. Se observó un aumento significativo en la incidencia de tumores y la severidad de la enfermedad neoplásica en el
K14E6E7
/
FANCD2


- /- ratones
en comparación con el
K14E6E7
/
FANCD2


+ /+ ratones
; Sin embargo,
FANCD2
-deficiency no aumentaron, ya sea en esta lectura de la tumorigénesis en los
K14E6
ratones que expresan E6 solo. Tanto HPV16 E6 y E7 causó un aumento en la frecuencia de las células de soporte de síntesis de ADN y esto fue aumentada en el fondo FA-deficiente. De hecho deficiencia FA solo condujo a un aumento en la proliferación celular. Pero esta inducción de la proliferación de células no se correlacionó con la influencia de la vía de FA en la tumorigénesis. Por otro lado, la frecuencia en el epitelio de la lengua y el esófago de células positivas focos nucleares γ-H2AX, un marcador de respuesta al daño del ADN, se correlacionó con la incidencia de tumores. Este marcador se indujo en los tejidos que expresan el oncogén E7; mientras que, E6 no indujo la expresión de este marcador de respuesta al daño del ADN. Además, dos biomarcadores, MCM7 y p16, utilizados para distinguir HNCS VPH positivas de HNCS VPH-negativos resultaron ser altamente regulado en
K14E6E7
ratones independientemente de
FANCD2
estado del gen , lo que indica que podrían ser útiles para determinar el estado de VPH HNCS que surgen en los pacientes con AF. Por último, se observó que la deficiencia en la expresión de las proteínas de bolsillo, pRb, p107, p130 y, que se establecen los objetivos de E7, podría recapitular la inducción de respuestas al daño de ADN de E7 en el epitelio de cabeza y cuello. Nuestro estudio apoya la hipótesis de que E7 induce HNC mediante la promoción de daño en el ADN a través de la inactivación de proteínas de bolsillo. Estos datos pueden explicar por qué la deficiencia en la vía FA aumenta la susceptibilidad al cáncer impulsada por el E7.

Materiales y Métodos

Ratones


K14E6
transgénico
ratones
[27]
y K14E7
ratones transgénicos [28] en el fondo genético FVB, se cruzaron a
FANCD2
nocaut (
FANCD2


- /-
) ratones [29], en el fondo genético 129S4, para generar F
1 ratones,
K14E6 /FANCD2


+/-
y
K14E7 /FANCD2


+/- gratis (FVB /129S4 fondo mixto). Todos los ratones experimentales (
NTG /FANCD2


+ /+
,
NTG /FANCD2

- /-,
K14E6 /FANCD2


+ /+
,
K14E6 /FANCD2


- /-
,
K14E6E7 /FANCD2


+ /+
, y
K14E6E7 /FANCD2


- /- ratones
) eran varones generadas por cruzamiento F
.
K14Cre /Rb


f /f
,
Rb f

/f /
p130


- /-
, y
K14Cre /Rb
f /f /p130


- /-
fueron generados en el mismo
FVB /129 /C57
mezcla de antecedentes genéticos como se describe anteriormente [30].
Rb f

/f /
p107


- /- Opiniones y
K14CreER /Rb
f /f /p107


- /-
fueron generados en el mismo
CD1 /129 /C57
mezcla de antecedentes genéticos como se describe anteriormente [30]. Todos los ratones fueron genotipados por PCR. Los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con 0,3 ml de bromodesoxiuridina (BrdU; 12,5 mg /ml) 1 hora antes de la eutanasia para medir la tasa de síntesis de ADN. Lenguas y esófagos se recogieron y procesaron como se describe anteriormente [23]. Los animales fueron alojados en la Asociación para la Evaluación de la Unidad de McArdle Laboratory Animal Care aprobado por el Cuidado de Animales de Laboratorio. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo aprobado por animal de la Universidad de Wisconsin Institucional Cuidado de Animales y el empleo.

4-nitroquinolina-1-óxido (4NQO) inducida por la cabeza y el estudio de carcinogénesis del cuello y el análisis histológico

El tratamiento y directrices para el análisis histológico de los tumores fueron descritas anteriormente [26]. Brevemente, los ratones se trataron con 4-nitroquinolina-1-óxido (4NQO; 10 mg /ml) en su agua potable durante 8 semanas y después se mantuvo fuera de tratamiento durante 16 semanas adicionales. En el punto final o cuando se convirtió en ratones moribundos, se les practicó la eutanasia, los tumores manifiestos en la lengua y el esófago se anotó, y se recogieron los tejidos para los análisis histopatológicos.

Se realizó inmunofluorescencia

La inmunofluorescencia como se ha descrito anteriormente [31]. Los anticuerpos utilizados incluyen anti-p16 (01:50 en 5% de leche sin grasa /5% de suero de caballo; M156, Santa Cruz Biotech.), Anti-Mcm7 (1: 200 en 5% de suero de caballo; Neomarkers), anti-citoqueratina 14 conjugado a FITC (CK14; 1: 100 en suero de caballo al 5%; CBL 197F, Millipore), anti-bromodesoxiuridina (BrdU; 1:50 en 5% de suero de caballo; Calbiochem), y anti-γ-H2AX (1: 100 en 5 % de suero de caballo; Millipore)

células positivas Cuantificación de núcleos BrdUrd positivos y γ-H2AX focos

Al menos tres ratones de cada genotipo,
NTG /FANCD2


+ /+
,
NTG /FANCD2


- /-
,
K14E6 /FANCD2


+ /+
,
K14E6 /FANCD2


- /-
,
K14E6E7 /FANCD2


+ /+
, y
K14E6E7 /FANCD2


- /-, fueron seleccionados y ~ 8 a 10 fotogramas (400x) de las células dentro de la suprabasal (citoqueratina 14 negativos) y los ratones basales
(citoqueratina 14 positivo) capas de la lengua y el epitelio del esófago fueron cuantificados para cada ratón.

el análisis estadístico

unilateral se utilizó la prueba exacta de Barnard para determinar la significación de las diferencias en la incidencia de tumores abierta entre cada grupo de ratones. Se utilizó a dos caras prueba de suma de rangos de Wilcoxon para determinar la significación de las diferencias en la gravedad de la lesión abierta en la lengua de los animales y el esófago. Para determinar la importancia de núcleos positivos BrdUrd y células positivas focos nucleares γ-H2AX entre cada grupo de ratones, se utilizó una prueba de suma de rangos de Wilcoxon de dos lados.

Resultados

La interrupción de la vía FA aumenta significativamente la incidencia de tumores asociados al VPH oncogén en E6 /E7 ratones bi-transgénicos, pero no en ratones transgénicos E6

Para abordar el papel de la E6 y la deficiencia de la ruta de FA en la cabeza y el cuello carcinogénesis , HPV16 E6 transgénico (
K14E6
) y transgénico HPV16 E7 (
K14E7
) los ratones fueron cruzadas a
FANCD2
-null ratones para generar cuatro genotipos diferentes;
K14E6
/
FANCD2


+ /+
,
K14E6
/
FANCD2


- /-
,
K14E6E7
/
FANCD2


+ /+
, y
K14E6E7
/
FANCD2


- /- ratones
. Los ratones se trataron con 4NQO, un carcinógeno químico soluble de agua que actúa como un co-carcinógeno en la inducción de HNCS en nuestra HPV16 ratones transgénicos [23], durante 8 semanas y después se mantuvo durante 16 semanas adicionales. En el punto final de 24 semanas, se recogieron las lenguas y esófagos, anotaron para los tumores manifiestos, y los tejidos se fijaron, incluido en parafina, se seccionaron y se sometieron a análisis histopatológico para evaluar la peor etapa de la enfermedad neoplásica.


FANCD2
fondo -sufficient, sólo dos de 26
K14E6 /FANCD2


+ /+ ratones
(8%) desarrollaron tumores de cabeza y cuello manifiestos, que no era significativamente diferente de la observada en ratones no transgénicos (NTG) (Tabla 1). Esto es consistente con nuestro estudio anterior [25]. En la página
FANCD2
fondo-deficiente, dos de cada 22
K14E6 /FANCD2


- /- ratones
(9%) desarrollaron tumores manifiestos (Tabla 1) , que no fue significativamente diferente de la observada en el
FANCD2
fondo -sufficient (
K14E6 /FANCD2


+ /+
vs
K14E6 /FANCD2


- /-
,
P
= 0,52). Por lo tanto,
FANCD2
deficiencia no dio lugar a un aumento de la susceptibilidad de los ratones transgénicos E6 a los tumores de cabeza y cuello.

Tamaño Genotipo
Grupo, n
tejidos animales con tumoral abierta, n (%)
Lengua & amp; Esophagus
Tongue
Esophagus


*

NTG/FancD2


+


/


+
240 (0) 0 (0) 0 (0)

*

NTG /FANCD2


- /-
260 (0) 0 (0) 0 (0)

*

K14E7 /FANCD2


+


/


+
204 (20) 2 (10) 3 (15)

*

K14E7 /FANCD2


- /-
2111 (52) 5 (24) 6 (29)
K14E6 /FANCD2


+


/


+
262 (8 ) 0 (0) 2 (8)
K14E6 /FANCD2


- /-
222 (9) 0 (0) 2 (9)
K14E6E7 /FANCD2


+


/


+
146 (43) 4
a (29) 4
a (29 )
K14E6E7 /FANCD2


- /-
1411 (79) 9
b (64) 7
b (50) Tabla 1. Comparación de 4NQO inducida abierta la incidencia de tumores. en la lengua del ratón y los tejidos del esófago
NOTA:
K14E6E7 /FANCD2

+ /
+ ratones muestran un aumento significativo de la incidencia de tumores en comparación con
K14E6 /FANCD2

+ /
+ ratones (
P
= 0,01). La diferencia en la incidencia de tumores entre los
K14E6 /FANCD2


+ +
y
K14E6 /FANCD2


/- /- Barcelona Grupos no muestra significación estadística (
P
= 0,52). Sin embargo, la diferencia en la incidencia de tumores entre los
K14E6E7 /FANCD2


+ /+
y
K14E6E7 /FANCD2


- /-
grupos es estadísticamente significativa (
P
= 0,03). Todas las comparaciones estadísticas se realizaron mediante la prueba exacta de un Barnard unilateral.
a dos de los
K14E6E7 /FANCD2


+ /+
ratones tenían tumores en el tanto la lengua y el esófago.
b Cinco de los
K14E6E7 /FANCD2


- /-.
Ratones tenían tumores en la lengua y el esófago tanto
* incidencia de tumores manifiestos de
NTG /FANCD2

+
/

NTG /FANCD2

- /-
K14E7 /FANCD2


+ /+
y
K14E7 /FANCD2


- /- ratones son
de nuestro estudio anterior [26] Descargar CSV CSV
a continuación analizamos la influencia de la FA por deficiencia en la cabeza y el cuello tumorigénesis en ratones que expresan tanto E6 y E7. En la página
FANCD2
fondo -sufficient,
K14E6E7 /FANCD2


+ /+ ratones
desarrollado un mayor número de tumores de cabeza y cuello manifiestos en comparación con
K14E7 /FANCD2


+ /+ ratones
(Tabla 1), consistente con nuestros estudios previos demostrando una capacidad de E6 para aumentar la eficiencia de la cabeza impulsado por E7 y tumorigénesis cuello [25]. En la página
FANCD2
fondo-deficiente, se observó un aumento significativo en la incidencia de tumores manifiestos en
K14E6E7
ratones, de 43% a 79% (
K14E6E7 /FANCD2


+ /+
vs
K14E6E7 /FANCD2


- /-
,
P = 0,03
en la Tabla 1). La magnitud del aumento en la frecuencia de los tumores manifiestos en la
FANCD2
fondo deficiente en visto con los ratones E6 /E7 bi-transgénico no fue mayor que la observada con E7 solamente ratones transgénicos (tabla 1). Estos datos indican que la vía de FA influye en el potencial oncogénico de E7 pero no E6.

deficiencia en la vía de FA llevó a enfermedad asociado al VPH neoplásica más agresivo

Se realizó el análisis histopatológico del tejido detallada cosechado de estos ratones para evaluar el grado de la enfermedad neoplásica en estas cohortes de ratones. Se recogieron tejidos con tumores manifiestos, se fijaron en parafina y las secciones se sometieron a histopatología. Específicamente, cada sección de 5μm décimo de la lengua y el esófago se tiñó con hematoxilina y eosina (H & amp; E) y se analizaron para determinar la peor etapa de la enfermedad neoplásica en cada animal (Tabla 2). los ratones transgénicos por oncogenes HPV16 desarrollan una enfermedad progresiva, que van desde epitelio normal y del papiloma benigno a cáncer invasivo (es decir, carcinoma) [24,26]. Basado en el nivel de diferenciación (queratinización) dentro de los carcinomas, los cánceres eran sub-clasifican en grados I, II, y III. En la lengua, sólo se observaron cuatro papilomas benignos en
K14E6E7
/
FANCD2


+ /+
ratones, mientras que en el
K14E6E7
/
FANCD2


- /-
ratones se observaron tres papilomas benignos, carcinomas de cuatro de grado I, y dos carcinomas de grado II. Este aumento en la gravedad de la enfermedad fue estadísticamente significativa (
P
= 0.02 en la Tabla 2). Mientras FA-deficiencia también dio lugar a un aumento de la gravedad de la enfermedad en el esófagos de ratones con tumores, este aumento no fue estadísticamente significativa (
P = 0,25
en la Tabla 2).
Tejido

Genotipo
#de los ratones, n
enfermedad de grado de la lesión abierta, n (%)
Ninguna enfermedad
Papiloma del tour de carcinoma

I
II III

Lengua
K14E6 /FANCD2


+ /+
2626 (100) ----
K14E6 /FANCD2


- /-
2222 (100) ----
K14E6E7 /FANCD2


+ /+
1410 (71) 4 (29) ---
K14E6E7 /FANCD2


- /-
145 (36) 3 (21) 4 (29) 2 (14) -Esophagus
K14E6 /FANCD2


+ /+
2624 (92) 2 (8) ---
K14E6 /FANCD2


- /-
2220 (91) 2 (9) ---
K14E6E7 /FANCD2


+ /+
1410 (71) 3 (21) -1 (7) -
K14E6E7 /FANCD2


- /-
147 (50) 5 (36) 2 (14) -Tabla 2. El análisis histopatológico de . las muestras con lesiones abiertas en la lengua de los animales y los tejidos del esófago
NOTA: la calificación global de la enfermedad en
K14E6E7 /FANCD2


- /- ratones
grupos es estadísticamente más grave que en
K14E6E7 /FANCD2


+ /+
grupos de ratones en el tejido de la lengua de los animales (
P
= 0,02), pero no en el tejido animal esófago (
P
= 0,25). Todos los análisis estadísticos se realizaron mediante el uso de una prueba de suma de rangos de Wilcoxon de dos lados. Descargar CSV CSV
dos biomarcadores, MCM7 y p16, son altamente expresado en los tumores en ratones K14E6E7 independientemente del estado del gen FANCD2

En la población general, HNCS VPH positivos son más sensibles a la radiación, la terapia de VPH HNCS-negativos [32]. Sin embargo, este tratamiento estándar para los pacientes con HNCS no es aplicable a los pacientes con AF, debido a los graves efectos secundarios de esta terapia en estos pacientes [33]. La identificación del VPH-estado HNCS de los pacientes con AF podría ayudar a los médicos buscan soluciones más seguras y mejores para la cura de estas enfermedades malignas. Varios estudios previos incluyendo el nuestro han demostrado dos biomarcadores moleculares, MCM7 y p16, son útiles para distinguir el VPH-positivo de HNCS VPH-negativas tanto en ratones [23,26] y en los seres humanos [34,35]. Queríamos supervisar si HPV16 E6 y E7 doble expresión en el fondo deficientes ruta Fanconi también aumenta los niveles de proteína p16 Mcm7 y en los tumores de
K14E6E7
/
FANCD2


- /-
ratones. Las secciones de tejido de tumores que surgen en
K14E6E7
/
FANCD2


+ /+
y
K14E6E7
/
FANCD2


- /-
ratones fueron sometidos a inmunohistoquímica para anti-MCM7 y -p16 anticuerpos específicos. No se observaron lesiones neoplásicas se observaron en
NTG /FANCD2


+ +
y
NTG /FANCD2


/- /- ratones
. Como se informó anteriormente [23], E6 no aumentaron los niveles de expresión de estos marcadores y
FANCD2
-deficiency no alteró este resultado (Figura 1). Los dos biomarcadores fueron altamente expresado en los núcleos de todos los tumores benignos y malignos en
K14E6E7
ratones independientemente de
FANCD2
estado de expresión (Figura 1). Además,
FANCD2
knockout no cambiar el patrón de expresión de estos marcadores biológicos en el epitelio normal de la lengua y el esófago (datos no mostrados). Estos resultados nos llevan a sugerir que estos dos biomarcadores será de gran valor para el diagnóstico de VPH-estado en los cánceres de pacientes con AF.

Se muestra son imágenes representativas de inmunohistoquímica de secciones teñidas con anti-MCM7 (núcleos marrones) y anti-p16 (núcleos marrones) y anticuerpos contraste con hematoxilina (núcleos azules). Barra de escala, 50 micras.

La proliferación celular inducida por oncogenes HPV16 se incrementa en la FANCD2 deficientes fondo

La proliferación celular tiene que ser estrictamente regulado para mantener la homeostasis del tejido, y sus contribuye desregulación a las enfermedades neoplásicas. En nuestro estudio previo aprendimos que HPV16 E7 y
FANCD2
-deficiency aumentó de forma aditiva y de forma independiente de la frecuencia de las células en el epitelio basal de la lengua y el esófago de someterse a la síntesis de ADN [26]. Un
in vitro
estudio demostró que la deficiencia de FA condujo a hiperplasia en el contexto de las culturas balsa organotípicos de queratinocitos humanos inmortalizados por la combinación de oncogenes E6 y E7 [22]. Para evaluar si
in vivo
deficiencia FA tenían ninguna influencia sobre la proliferación celular en presencia de E6 solo o E6 y E7 juntos, los ratones de lo anterior estudio cáncer de cabeza y cuello se intraperitonealmente inyectados con BrdUrd (12,5 mg /ml), un análogo de timidina sintético, 1 hora antes del sacrificio de inmunofluorescencia y BrdUrd-específica se realizó para identificar células de soporte de síntesis de ADN en el epitelio que recubre la lengua y el esófago de los ratones (Figura 2A). La frecuencia de células BrdU-positivas se cuantificó para proporcionar un índice de proliferación para cada tejido (Figura 2B).

A, para marcar el ADN recién sintetizado en las capas epiteliales de la lengua y los tejidos del esófago, los ratones fueron por vía intraperitoneal inyectados con BrdU antes del sacrificio y sus tejidos fueron teñidas con anti-BrdU (rojo) y anti-citoqueratina 14 proteínas (CK14) (verde) anticuerpos. DAPI (azul) se usa para una contratinción nuclear. Barra de escala, 20μm. B, al menos, tres ratones de cada genotipo,
NTG /FANCD2


+ /+
,
NTG /FANCD2


- /-
,
K14E6 /FANCD2


+ /+
,
K14E6 /FANCD2


- /-
,
K14E6E7 /FANCD2


+ /+
, y
K14E6E7 /FANCD2


- /- ratones
, fueron seleccionados y ~ 8 a 10 cuadros de células en las capas epiteliales de la lengua y el esófago epitelios se cuantificaron para cada ratón. La cantidad de núcleos BrdU positivos sobre el número de células totales se representa en cada caso (columnas); bares, Dakota del Sur. El asterisco (*) significa que la deficiencia de
FANCD2
gen causó un aumento significativo en la síntesis de ADN entre los genotipos (
P
& lt; 0,05). Todas las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando una prueba de suma de rangos de Wilcoxon de dos lados.

En el
FANCD2
fondo -sufficient, E6 solo o junto con E7 aumentó significativamente el número de BrdU células positivas en el epitelio de la lengua o el esófago (
NTG /FANCD2


+ /+
vs
K14E6 /FANCD2


+ /+
o
K14E6E7 /FANCD2


+ /+
,
P Hotel & lt; 0,05 en la Figura 2B). La combinación de E6 y E7 condujo a un aumento significativo del número de células epiteliales de BrdU-positivas en
FANCD2
fondo -sufficient que hizo E6 sola (
P Hotel & lt; 0,05 en la Figura 2B). Es importante destacar que la frecuencia de las células de soporte síntesis de ADN fue significativamente mayor en las células epiteliales de la lengua o el esófago de todos los ratones que eran deficientes para
FANCD2
, independientemente del estado de HPV16 oncogén (
NTG /FANCD2


+ /+
vs
NTG /FANCD2


- /-
,
K14E6
/
FANCD2


+ /+
vs
K14E6
/
FANCD2


- /-
, y
K14E6E7
/
FANCD2


+ /+
vs
K14E6E7
/
FANCD2


- /-
; todos los
P Hotel & lt; 0,05 en la Figura 2B). Hemos mejorado aún más nuestro análisis de la influencia de oncogenes HPV16 y la deficiencia de FA en la inducción de la síntesis de ADN a dos diferentes sub-compartimientos de los epitelios: el compartimiento basal, que es la citoqueratina 14 (CK14) positiva, y el compartimiento suprabasal, que es negativo CK14 (Figura 2A). La influencia anteriormente indicado de ambos factores (oncogenes HPV16 y FA-estado) se observó de manera más uniforme en el compartimiento basal, tanto de la lengua y el esófago (Figura S1). En resumen, la deficiencia en
FANCD2
ha llevado a la inducción de la síntesis de ADN celular en el epitelio de la lengua y el esófago sin importar su estatus oncogén HPV16. Estos resultados apoyan la hipótesis de que FANCD2 juega un papel de la regulación del ciclo celular en fase S [6,36,37]. Sin embargo, el hecho de que FA-deficiencia no causó un aumento de la susceptibilidad a la cabeza y la tumorigénesis cuello en los ratones transgénicos E6 pero causó un aumento en la proliferación celular en estos mismos ratones indica que la inducción de hiperplasia epitelial no explica cómo la deficiencia de FA impulsa la tumorigénesis .

La ruta Fanconi suprimir específicamente el daño del ADN impulsada por el E7

Tanto HPV16 E6 y E7 oncogenes se han argumentado para inducir daño en el ADN basada en el ensayo del cometa realizadas en células en cultivo de tejidos [38,39 ]. Teniendo en cuenta que la ruta Fanconi participa en la reparación del ADN dañado, sería razonable que el nivel de daño del ADN causado por la E6 y E7 se incrementaría en un fondo deficiente FA. La presencia de daño en el ADN en las células puede ser indirectamente obtuvo mediante el control de la presencia de focos nuclear positiva para 2AX histona fosforilada en la serina-139 (γ-H2AX) [40,41]. Habíamos demostrado anteriormente que en
K14E7
ratones, E7 condujo a un fuerte incremento de la frecuencia de células positivas focos nucleares γ-H2AX en el epitelio de la lengua y el esófago, y la frecuencia se incrementó aún más en el
FANCD2
fondo deficiente en [26]. En el presente estudio, hemos querido determinar el papel de HPV16 E6 en respuesta al daño del ADN en los
FANCD2
fondos -sufficient y deficientes. Con este fin, se realizó la tinción de inmunofluorescencia específica para γ-H2AX en las secciones de la lengua y el esófago de
NTG
,
K14E6
, y
K14E6E7
ratones en el
fancD2-
suficiente o
FANCD2
antecedentes deficientes (Figura 3A).

A. Para evaluar la respuesta al daño del ADN inducido por HPV16 E6 y E7 en la deficiencia de
FANCD2
gen, los tejidos de cada grupo fueron teñidas con anti-γ-H2AX (rojo) y la proteína anti-citoqueratina 14 (CK14) (verde ) anticuerpos. DAPI se utiliza para una contratinción nuclear. Barra de escala, 20μm. γ-H2AX células positivas focos están resaltados con flechas verdes en las imágenes. B. Al menos tres ratones de cada genotipo,
NTG /FANCD2


+ /+

, NTG /FANCD2


- /-
,
K14E6 /FANCD2


+ /+
,
K14E6 /FANCD2


- /-
,
K14E6E7 /FANCD2


+ /+
, y
K14E6E7 /FANCD2


- /- ratones
, fueron seleccionados y ~ 8 a 10 cuadros de células en las capas epiteliales de la lengua y el esófago se cuantificaron para cada ratón. La cantidad de células con γ-H2AX células focos positivos sobre el número de células totales se representa en cada caso (columnas); bares, Dakota del Sur. El asterisco (*) significa que las diferencias en el número de células con focos γ-H2AX entre los grupos se compararon estadísticamente (
P
& lt; 0,05). Todas las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando una prueba de suma de rangos de Wilcoxon de dos lados. Nota: Los tiempos de exposición usados ​​fueron los mismos para todas las muestras analizadas. Algunas células en los tejidos de
K14E6E7 /FANCD2


+ /+
y
K14E6E7 /FANCD2


- /- ratones tenían
muy brillante γ-H2AX específicos de tinción nuclear en la exposición utilizada. de exposición más cortos confirmó que estas células conservan punctuate tinción nuclear reflectante de daño en el ADN focos respuesta.

En el epitelio de la lengua y el tejido de esófago, E6 ratones transgénicos mostró células positivas focos muy pocos γ-H2AX, similar a la observada en el
NTG
ratones. bares, Dakota del Sur. bares, Dakota del Sur.