Extracto
Antecedentes
Muchas alteraciones genéticas diferentes se observan en las células cancerosas. los genes del cáncer de las pantallas de mutaciones puntuales, tales como cambios de bases, inserciones y deleciones que inician y promueven el crecimiento y propagación del cáncer. hipermutación somática es un mecanismo poderoso para la generación de mutaciones diferentes. Se ha demostrado previamente que hipermutabilidad somática de los proto-oncogenes puede inducir el desarrollo de los linfomas.
Metodología /Principales conclusiones
Hemos encontrado una incidencia excepcionalmente alta de mutaciones de una sola base en los genes supresores de tumores
RASSF1
y
RBSP3 (CTDSPL)
ambos localizados en 3p21.3 regiones, Luca y AP20, respectivamente. Estas regiones contienen grupos de genes supresores de tumores implicados en múltiples tipos de cáncer como el de pulmón, riñón, mama, cervical, de cabeza y cuello, nasofaringe, próstata y otros carcinomas. En total, en 144 secuenciado
RASSF1A
clones (exones 1-2), se detectaron 129 mutaciones (frecuencia de mutación, MF = 0,23 por 100 pb) y en 98 clones de los exones 3-5 encontramos 146 mutaciones (MF = 0,29). En 85 secuenciados
RBSP3
clones, se encontraron 89 mutaciones (MF = 0,10). Las mutaciones no se citidina-específico, como sería de esperar de alteraciones generados por AID /APOBEC enzimas de la familia, y aparecieron
de novo
durante la proliferación celular. Ellos disminuyen la capacidad de los transgenes correspondientes para suprimir el crecimiento celular y tumor que implica una pérdida de la función. Estos altos niveles de mutaciones somáticas se encuentran tanto en biopsias de cáncer y líneas celulares de cáncer.
Conclusiones /Importancia
Este es el primer reporte de altas frecuencias de mutaciones somáticas en
RASSF1
y
RBSP3
en diferentes tipos de cáncer que sugiere que puede subyacer el fenotipo mutador de cáncer. hypermutations somáticas en los genes supresores de tumores implicados en los cánceres malignos humanos ofrecen una visión novedosa en el desarrollo del cáncer, la progresión y diseminación
Visto:. Kashuba VI, Pavlova TV, Grigorieva EV, Kutsenko A, Yenamandra SP, Li J, et Alabama. (2009) de alta mutabilidad de los genes supresores de tumores
RASSF1
y
RBSP3 (CTDSPL) Hoteles en cáncer. PLoS ONE 4 (5): e5231. doi: 10.1371 /journal.pone.0005231
Editor: G. Maria Masucci, Karolinska Institutet, Suecia |
Recibido: 9 de diciembre de 2008; Aceptado: March 18, 2009; Publicado: 29 de mayo de 2009
Derechos de Autor © 2009 Kashuba et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de la Sociedad del cáncer de Suecia, el Consejo Sueco de investigación, la Fundación sueca para la Cooperación Internacional en investigación y Educación Superior (STINT), el Instituto Sueco, la Real Academia sueca de Ciencias, INTAS y el Instituto Karolinska. ALASKA. le gustaría reconocer el Consejo Sueco de Investigación para la subvención de proyectos para jóvenes investigadores. EB fue apoyado con la Fundación Rusa para la Investigación Básica (Grant 07-04-00097-a). IK y MIL fueron financiados por el Programa de Investigación Intramural del NIH, Instituto Nacional del Cáncer, Centro de Investigación del Cáncer. VNS y LLK fueron apoyados por la Fundación Rusa para la Investigación Básica y por el Ministerio de Educación y Ciencia (subvención para el apoyo de las principales escuelas de científicos rusos). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Hemos llevado a cabo un estudio exhaustivo de la eliminación 3p en más de 400 de pulmón, renal, de mama, cervical y carcinomas de ovario (principales cánceres epiteliales) usando un conjunto definido de marcadores, la combinación de LOH convencional con cuantitativa en tiempo real PCR (QPCR), microarrays genómicos comparativos y NotI hibridaciones [1], [2], [3], [4], [5]. Se identificaron dos 3p21.3 regiones más frecuentemente afectados, LUCA (pulmón cáncer) en la centromérica y AP20 en la frontera telomérica de 3p21.3. se detectaron aberraciones de cualquiera de región en más de 90% de los tumores estudiados lo que sugiere que albergan múltiples genes supresores de tumores (TSG) [5], [6], [7].
Uno de ellos es
RASSF1
gen (de región LUCA) que pueden existir en diferentes formas de corte y empalme alternativo (al menos 7 isoformas diferentes). En este trabajo se estudió la más importante
RASSF1A
, la forma más grande de empalme [8]. Varios estudios han demostrado que la pérdida de
RASSF1A
expresión se produce a causa de adquirido tumor metilación del ADN promotor en muchos tipos de cáncer diferentes. Por ejemplo,
RASSF1A
es silenciado por la hipermetilación del promotor en más del 90% de los carcinomas pulmonares de células pequeñas (SCLC) y carcinomas de células renales de células claras (RCC) y en aproximadamente el 40% de los carcinomas no microcíticos de pulmón no microcítico (CPNM ). El gen es capaz de suprimir el crecimiento de las células de cáncer de pulmón y renal en la cultura y la formación de tumores en ratones [6]. Además, España se han notificado mutaciones sin sentido ocasionales en
RASSF1A.
RASSF1A Código de descuento de 340 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de
RASSF1A
contiene un diacilglicerol predicho (DAG) dominio de unión y un dominio de asociación de Ras. RASSF1A puede inducir la detención del ciclo celular mediante la participación en el ciclo celular Rb familiar puesto de control [9]. Estos y otros resultados sugieren fuertemente que RASSF1A es una importante proteína supresora de tumores humanos que actúan a diferentes niveles de la progresión del tumor [6].
Otro gen es
RBSP3
también llamado
HYA22
y
CTDSPL
. Existe en dos formas de empalme (A, 265 aminoácidos y B, 276 aminoácidos) que se asignan a región AP20 y pertenece a una familia de genes de pequeñas fosfatasas dominio C-terminal que pueden controlar la ARN polimerasa II transcripción maquinaria [10]. La expresión del gen se redujo en gran medida en varias líneas celulares de SCLC y NSCLC.
RBSP3
mostraron la supresión del crecimiento con transgenes reguladas en la cultura y la supresión de la formación de tumores en ratones SCID. Se demostró que la expresión transitoria de las dos formas A y B resultó en una reducción drástica de la forma fosforilada de la proteína RB, presumiblemente, que conduce a un bloque del ciclo celular en la transición G1 /S límite. Después de este hallazgo, el gen fue renombrado (proteína fosfatasa serina RB del cromosoma 3). Todas estas características son consistentes con las características clásicas de una ETG
Curiosamente, ambos
RASSF1
y
RBSP3
podría colaborar en la detención del ciclo celular:. El anterior mediante la inhibición de la ciclina D1 [ ,,,0],9] y la segunda por dephosphorylating RB [10]. Esto apoya la hipótesis de que ETG en estas dos regiones podrían actuar sinérgicamente [4], [5]. Por otra parte otros dos ETG de estas regiones podrían causar el aumento de las frecuencias de mutación en los tumores (
MLH1
de AP20 y
G21 /NPRL2 En venta LUCA) [11], [12], [13].
es bien sabido que el cáncer es el resultado de cambios genéticos y epigenéticos y mutaciones puntuales es uno de los mecanismos más importantes para el desarrollo del cáncer [14], [15].
Anteriormente, otros y hemos detectado numerosos cambios de una sola base /mutaciones en
RASSF1A Windows que se creía que eran SNPs [8], [16], [17]. Por otra parte,
se detectaron mutaciones en RBSP3
los 14 tumores de diferentes orígenes que expresan el gen [10].
Para estudiar las altas frecuencias de mutación aparentemente de TSG (s) en estas regiones 3p21. 3, se realizó un análisis de la mutación completa de
RASSF1A
[18], [19] y
RBSP3 /HYA22
[10] en varios tipos de cáncer. Aquí mostramos que las mutaciones de una sola base excepcionalmente frecuentes se producen en estos genes en múltiples tipos de cáncer. Las mutaciones no fueron citidina-específica como sería de esperar si se generan por la AID [20] o de otra familia APOBEC [21], [22] enzimas. Estas mutaciones no se debieron a la edición de ARN, y aparecieron
de novo
durante las divisiones celulares.
Resultados
Bioinformática análisis de clones de cDNA EST revela una alta frecuencia de mutación del
RASSF1 Opiniones y
RBSP3
primero examinamos los datos disponibles públicamente secuencia EST para
RASSF1A
y
RBSP3 gratis (para
RASSF1A
nº de acceso NM_007182;
RBSP3A
, Nº de Acceso AJ575644, y por
RBSP3B
, Nº de Acceso AJ575645). Las secuencias con homología por debajo del umbral (ver Materiales y Métodos), es decir que contienen múltiples desajustes distintos a los genes anotados y nucleótidos desconocidos (N) no fueron consideradas. Secuencias cerca del final de lecturas también fueron excluidos. Los datos presentados en la Tabla 1 muestran que el
RASSF1A
y
RBSP3
genes fueron mutados a tasas extremadamente altas. Para el
RASSF1A
hemos considerado sólo 17 clones (frecuencia de mutación por 100 pb, MF = 0,22). Seis de ellos se obtuvieron de los tejidos de cáncer y todos ellos contenían mutaciones (MF = 0,42). Once secuencias eran de tejidos normales (cuatro clones con una mutación) y MF = 0,1, es decir, las frecuencias de mutación eran estadísticamente significativa (p = 0,025).
El ochenta por el uno por ciento de la
RBSP3
secuencias (63 de 79) contenían mutaciones /desajustes. MF para
RBSP3
EST fue de 0,63. De nuevo, fue mucho más alta en clones aislados de cáncer (MF = 1,05) que los de los tejidos normales (MF = 0,45). Esta diferencia también fue significativa (P & lt; 0,001). La diferencia fue aún más pronunciada para las mutaciones que cambian las secuencias de aminoácidos (MF 0,72 frente a 0,24) y similar para los clones RASSF1A (MF 0,33 frente a 0,1).
El número de secuencias EST disponibles (y mutados) fue significativamente mayor para ambos
RASSF1A
y
RBSP3
, pero debido a las muy estrictas muchos fueron excluidos del análisis.
Es importante destacar que, también hemos detectado hypermutations en otros exones de
RASSF1A
, compartida con
RASSF1C gratis (recientemente demostrado ser un TSG con una especificidad tisular diferente a
RASSF1A
, ver [23]. MF para los exones 3-6 fue de 0,43 y para las mutaciones que cambian los aminoácidos MF = 0,25 y por lo tanto
RASSF1C
está también hypermutated.
Un análisis bioinformático similar fue realizado para el gen de la insulina (333 pb, ORF completo). No se detectaron mutaciones en más de 1000 clones secuenciados aisladas de líneas celulares y tejidos somáticos. en 20 disponibles
p16 /INK4a gratis (exones 1-3, 447 pb) secuencia clones de las células cancerosas y normales no se encontraron mutaciones y en 6 clones
GPR14 gratis (1170 pb) solamente 1 mutación se encontró en las células cancerosas (MF = 0,01). En nuestros experimentos descritos a continuación (véase la siguiente sección y en la sección "Diferentes frecuencias de mutaciones en otros genes") en 31 secuenciado
GPR14
clones no se encontraron mutaciones que indica que esta mutación es más bien raro. La frecuencia de mutación para GPR14 fue estadísticamente significativamente diferente en comparación tanto a la RASSF1A y RBSP3 (P = 0,01).
mutaciones frecuentes en
RASSF1A
en carcinomas humanos, el cáncer y las líneas celulares hematopoyéticas
Durante el análisis de los
RASSF1A
hemos aislado varios clones mutantes, incluyendo un doble mutante [16]. Esta alta frecuencia de mutaciones fue sorprendente, ya que para
RASSF1A
y otros genes candidatos en las regiones AP20 y Luca se informaron las frecuencias de mutación que ser bajo a ninguno [6], [19]. Al mismo tiempo, se registraron muchos polimorfismos de
RASSF1A
y en muchos casos no estaba claro si se trataba de un verdadero polimorfismo de nucleótido simple o mutación somática en células de cáncer porque las células normales de control no estaban disponibles [8]. Es importante destacar que, en todos estos estudios se utilizó el polimorfismo de un solo capítulo conformación (SSCP) y la secuenciación directa de productos de PCR. La mezcla de estroma, los vasos sanguíneos, linfocitos y otras células normales obstaculizaría la detección de mutaciones utilizando estos métodos (ver M /M). la heterogeneidad del tumor crea problemas adicionales para el reconocimiento de las mutaciones. Por lo tanto, decidimos volver a investigar el estado mutacional de
RASSF1A Hoteles en múltiples tipos de tumores incluyendo tumores primarios y líneas celulares de cáncer. En primer lugar,
RASSF1A
ADNc se aisló a partir de una biopsia de RCC (T356) y el parénquima renal normal mirando circundante (N356). Se secuenciaron varios clones de ADNc. En seis clones derivados de parénquima renal normal, no se encontraron mutaciones. Sin embargo de los siete clones de tejido tumoral, se detectaron mutaciones en tres (P = 0,14). Todos eran de A a G sustituciones. Para excluir la edición de ARN, el ADN genómico se aisló a partir del mismo paciente y los dos primeros exones (dominio DAG) de
RASSF1A
fueron amplificados por PCR. a continuación, se secuenciaron varios clones derivados de tejido normal y tumoral: los seis clones de la biopsia del tumor mostraron mutaciones, mientras que de los catorce clones analizados a partir de tejido normal sólo uno fue mutado (P & lt; 0,001). Las mutaciones observadas en el ADNc a partir de células tumorales no fueron creados por la edición de ARN debido a que las mutaciones se detectaron también en el nivel de ADN genómico. la contaminación normal de las células y la alta expresión de
RASSF1A
en las células normales, en comparación con las células cancerosas, pueden explicar las diferentes relaciones entre mutado y normal
RASSF1A
clones de ADNc y ADN genómico. Lo más sorprendente era el hecho de que, con la excepción de dos clones genómicos de la biopsia del tumor con la supresión de C en la posición 254 (Nº de Acceso NM_007182), todas las otras mutaciones detectadas fueron en diferentes posiciones.
Como control se amplificado
GPR14
del mismo paciente y se secuenciaron 10 clones de cáncer y desde el tejido normal circundante. No se encontraron mutaciones demostrando que la alta tasa de mutación es específica para el
RASSF1A
gen.
Para comprobar si los diferentes mutaciones en el mismo tumor se produjo debido a la heterogeneidad del tumor o algún otro mecanismo (s) , hemos aislado y secuenciado
RASSF1A
clones (sólo el exón 1 y 2; 391 pb) a partir de ADN genómico de las cuatro líneas celulares de RCC. En TK164 los tres, y en KRC /Y (2 + 2) de los cuatro clones secuenciados contenían mutaciones. En TK10, entre 22 clones, 9 se mutaron. Es importante destacar que la mayoría de los clones contenía diferentes mutaciones. Solamente un clon se secuenció a partir Caki1, y se mutó.
También secuenciado este gen a partir de ADN genómico de cuatro líneas de células linfoides (BL2 y RAMOS son líneas de células de Burkitt, y IARC171 y MutuIII son líneas de células linfoblastoides) y los resultados fueron muy similares a las líneas celulares de RCC (Tabla 2). En total, entre 84 clones secuenciados contenían 55 mutaciones que en la mayoría de los casos se diferenciaban. MF en
RASSF1A
en estos experimentos fue de entre 0,14 y 0,70.
En todos los experimentos posteriores, se analizó el ADN genómico (exón 1 y 2 para
Opiniones y RASSF1A el conjunto
RBSP3
transgén en Pete vector) si no de una mención especial.
las mutaciones en
RASSF1A
pueden generarse
de novo
Para distinguir entre la posibilidad de que diferentes mutado
RASSF1A
genes se mutaron a la vez ( "explosión de mutaciones") o se generaron constantemente con el tiempo, hemos realizado experimentos con células individuales. En este experimento las células BL2, (que anteriormente mostró la más alta tasa de mutación: 10 clones con 25 mutaciones), se diluyeron y se sembraron en los pocillos con una frecuencia esperada de 0,3 células por pocillo. Tres pozos seleccionados al azar (designado como BL2-cl.1, 2 y 3) que contiene las células individuales se expandieron y se analizaron adicionalmente. Se aisló el ADN de estos clones después de 10 días (aproximadamente 10 divisiones, 10
3 células)
Los resultados fueron los siguientes:.-BL2 para cl.1, cinco de los 10 clones secuenciados fueron mutados (mutación frecuencia por 100 pb (MF), fue de 0,14), por BL2-CL.2, cinco de los 13 clones (MF = 0,15; dos clones contenían mutaciones T43T con codón cambiado desde ACA a ACG) y para BL2-cl.3, tres de 17 clones fueron mutados (MF = 0,07; dos clones contenían mutaciones N70G). En total se detectaron 16 mutaciones de pares de bases individuales, todos eran transiciones y sólo cinco de ellos mostraron mutado G o C. Este experimento muestra claramente que las mutaciones en el
RASSF1A
locus se podrían generar
de novo
durante la proliferación celular.
La lista completa de las 129 mutaciones (111 mutaciones eran diferentes) que se encuentra en los exones 1 y 2 de
RASSF1A
en todos los experimentos se muestra en la Tabla S1 a. Ver también la Tabla 2 y 3 y la Figura 1
Un
. En total, se secuenciaron 144 clones (56,3 KB) y la frecuencia media de mutaciones fue de 0,23 /100 pb para secuencias transcritas y 0,17 /100 pb para secuencias de codificación. Entre ellos, hubo cuatro cambios de nucleótidos que se produjeron en no codificante 5 ', a tres paradas (sin sentido) y (deleciones) mutaciones de desplazamiento del marco de cinco. De los 127 mutaciones restantes, 82 eran de sentido erróneo y 35 sinónimos.
Posición de las mutaciones detectadas en
RASSF1A
y
RBSP3
se muestra en A y B, respectivamente. Ejemplos de mutaciones se muestran en C. Para
RASSF1A
sólo se muestran las mutaciones en las secuencias de los exones 1 y 2 de codificación. se muestran mutaciones en toda la parte de codificación de RBSP3. Rojo "X" detener las mutaciones sin sentido o supresiones.
RBSP3
también se hypermutated en diversos cánceres
Durante los análisis previos de carcinoma de pulmón de células pequeñas células pequeñas (SCLC) "Z" designa mutaciones sinónimas. N417 línea, dos RCC, un carcinoma de mama (CM) y dos biopsias de carcinoma de ovario (OC) que todos expresados
RBSP3
, que detecta mutaciones en el
RBSP3
ADNc en los seis casos [10 ; ver Tabla S2A].
Para probar si la función de hipermutación es una característica única de la
RASSF1A
gen o de un fenómeno más general, se analizaron de forma similar el gen supresor de tumores múltiples identificado recientemente
RBSP3
encuentra en AP20, 3p21.3 región telomérica [10].
el uso de RT-PCR, cDNA se aisló de dos de cada CCR, BC y OC biopsias y la línea celular SCLC N417. Se secuenciaron múltiples clones. Los resultados, presentados en la Tabla S2A, la Tabla 3 y la Figura 1B, mostraron que casi todos los clones aislados sufrieron mutaciones. Como la transcriptasa inversa utilizado en RT-PCR tiene una tasa de error significativamente más alta que otras polimerasas utilizadas en PCR, se intentó reproducir la alta tasa de mutación observada a nivel del ADN genómico, como en el caso con
RASSF1A
. Por desgracia, era difícil de realizar este experimento en la genómica
RBSP3
debido al gran tamaño del gen (más de 120 kb), numerosos exones pequeñas (por lo menos 9), y alto contenido de GC (alcanzando 100 % en algunas regiones). Sin embargo, este problema se resuelve utilizando clonado
RBSP3
en ratones SCID.
RBSP3
reveló gran capacidad de mutar en ratones SCID en el nivel genómico
línea de células de SCLC ACC -LC5 y la línea celular RCC KRC /y fueron transfectadas con
RBSP3A
y
RBSP3B
isoformas de empalme en el vector de Pete y clones celulares estables fueron aislados. Cuatro de estos clones (AHA1 y AHB1 para ACC-LC5 y KHA4 y KHB9 para KRC /Y) se inocularon en ratones SCID (ver M /M).
Los clones celulares KHA4 y KHB9, que contiene
RBSP3A
o
RBSP3B
se cultiva
in vitro Hoteles en paralelo con tumores en ratones SCID. Después de 8 semanas se aisló el ADN de los tumores que crecen y líneas celulares, y el
RBSP3A
y
B Opiniones genes se amplificaron por PCR a partir del vector y se clonaron Pete. Una vez más múltiples clones se secuenciaron y los resultados del experimento se muestran en la Tabla 4 y la Tabla S2B. Sólo 30% de
RBSP3
KHA4 y se mutaron KHB9 clones plasmídicos
in vitro
, en comparación con 85% clones mutados después del crecimiento en ratones SCID. Esta diferencia según la prueba de Fischer es estadísticamente significativa (P & lt; 0,001).
En resumen, en
RBSP3
experimentos se identificaron 89 mutaciones entre los cuales 79 fueron distinta forma individual (ver Tablas S2A y S2B). La frecuencia media de mutaciones fue de 0,10 /100 pb para secuencias transcritas. Esta frecuencia es de más de 0,11 /100 pb para secuencias (véase la Tabla 3 y la Figura 1B) de codificación. Entre ellos, siete cambios de nucleótidos se produjeron en las regiones no codificantes, y cinco eran desplazamiento del marco (deleciones) mutaciones. De las 77 mutaciones restantes, 68 eran de sentido erróneo y 9 sinónimos.
Por lo tanto, la frecuencia de mutación era 2,5 veces menor que para los dos primeros exones del
RASSF1A gratis (véase más arriba). La diferencia significativa en las frecuencias de mutación podría explicarse por las diferencias en la composición de nucleótidos de los genes, o podría reflejar diferencias intrínsecas en las tasas de hipermutación de los genes. También podría ser importante que para el
RBSP3
todo el gen fue secuenciado, mientras que para el
RASSF1A de
sólo su extremo 5 '.
Opiniones y RASSF1A
RBSP3
amplificado por PCR a partir de
E. coli
ADN no muestran alta frecuencia de mutaciones
Hemos llevado a cabo la amplificación por PCR de
E. Coli DNA
que contiene plásmidos (es decir, ADN total aislado de
E. coli que contiene
mezcla de ADN genómico y plásmido) con estos dos genes. Para cada gen diez y cuatro ng de DNA se utilizó. Desafortunadamente menor cantidad de
E. coli
ADN no produjo cantidad suficiente de productos de PCR para la clonación adicional. Diez clones en cada experimento se secuenciaron y se detectaron mutaciones. Estos resultados indican que la tasa observada de hipermutación
RASSF1A
y
RBSP3
no puede explicarse por errores de polimerasa PCR.
Búsqueda de mutaciones fundadoras en
RASSF1A
en clones de células individuales
la idea principal de este experimento fue la siguiente. Si una mutación se origina en la célula y no en el tubo
in vitro
entonces en la población de células obtenidas de una célula alguna fracción (dependiendo del número de alelos presentes en la célula individual) de clones de plásmido debe contener la misma (es decir, uno de los fundadores) mutación. Para llevar a cabo este experimento se aislaron 15 clones de células individuales KRC /Y como se describe en la sección "mutaciones generadas de novo". En este caso hemos crecido las células durante tres semanas para obtener más ADN y generar clones más mutados. Se utilizaron células KRC /Y en lugar de las células BL2, ya que era más fácil de detectar que tenemos una célula en el pozo. Sin embargo, nosotros, por supuesto, no podemos excluir que en algunos de los 15 pozos seleccionados hubo más de una celda.
RASSF1A
exones 3-5 se ensayaron en este experimento (véase M /M), ya que fueron más fácilmente aislado que los exones 1 y 2 y contenían más información de la secuencia (516 nt vs. 391 nt). Por otra parte, de acuerdo con datos de secuencias EST esta parte de
RASSF1A
tiene mayor MF. A partir de cada reacción de PCR se seleccionaron 10 clones de plásmido y se aisló el ADN. Sin embargo, debido a diferentes problemas técnicos (sin inserto o reorganizado, mala calidad del ADN o secuenciación, etc.) por lo general sólo se analizaron más de seis y siete clones de plásmidos. Totalmente 98 plásmido clones fueron secuenciados (Tabla 5). Una mutación fundadora se detectó en todos los clones celulares y en 46 (47%) de clones de plásmidos. Fue un cambio de la A a la G (nt26735, nº de acceso AC002481) justo en la frontera del intrón 2 y el exón 3. Esta mutación destruyó el sitio aceptor de empalme AG /G y por lo tanto el gen inactivado. Como esta mutación fundadora apareció en todos los clones de células individuales, muy probablemente se originó antes de empezar a hacer este experimento. También se detectaron otras mutaciones fundadoras Cuarenta específicos para cada clon de células (véase la Tabla 5 y la Tabla S1B). Curiosamente, en un caso que era posible construir un árbol que muestra cómo se acumulan mutaciones fundadoras. Primero fue sólo una mutación de dos y luego mutaciones independientes adicionales (Figura 2).
sinónimo mutación Pro122Pro fue causado por el cambio de nucleótido ATC → AAC. La mutación GTC → GTA también no dio lugar a ningún cambio de aminoácido (Val174Val).
Las diferentes frecuencias de mutación en otros genes
experimentos similares de secuenciación se realizaron con insulina y los genes aislados de albúmina línea de células KRC /Y (ver M /M). En contraste con
RASSF1A
y
RBSP3
resultados, sólo uno de los 21 clones genómicos secuenciados de insulina (999 pb incluyendo completa ORF) y uno de 19 clones de ADNc de albúmina (700 bp, exones 12-15 ) se mutaron (MF para ambos genes fue menor que 0,01). Sin embargo, en ambos casos, no podríamos excluir la posibilidad de polimorfismos. Además, dos más genes se ensayaron para determinar mutaciones en el ADN genómico.
GPR14 gratis (G receptor acoplado a proteína 14, 1018 pb) y factor de elongación de la transcripción A (SII)
TCEA1 gratis (1066 pb) se amplificaron por PCR (ver M /M) a partir del ADN de KRC se secuenciaron /células y y 11 clones para cada gen. Todos los clones contenían copias normales del gen. No se encontraron mutaciones en otros genes candidatos 3p21.3:
BLU gratis (15 clones fueron secuenciados),
101F6 gratis (6 clones),
PL6 gratis (6) después de los clones KRC /Y clones estables que contienen estos genes se inocularon en ratones SCID. Por otra parte, para mut ya mutado
FUS1 gratis (10 clones) y mut
P53 gratis (6 clones) no se encontraron mutaciones adicionales (datos no mostrados).
Las mutaciones en
RASSF1A
,
RBSP3A
y
RBSP3B
no son generadas por los mecanismos de ayuda o APOBEC relacionados
se ha demostrado recientemente que la citidina deaminasa inducida por activación ( AID) es responsable de hypermutations somáticas en células B activadas. Por otra parte hypermutations generados por esta enzima en oncogenes pueden causar tumores malignos en las células hematopoyéticas [24]. Aunque queda mucho por aprender respecto a la ayuda, se han identificado varios motivos de secuencias objetivo para las mutaciones, es decir, CMR, RGYW y DGYW causando mutaciones C /G. La gran familia de genes APOBEC, también mostrado recientemente para mutar los genes en el nivel de ADN [21], [22], sobre todo dirigido a los motivos que causan mutaciones en RCW C /G. Por lo tanto, hemos comprobado si estos motivos fueron atacados o más frecuente en
RASSF1
y
RBSP3
secuencias en comparación con el gen de la insulina estables. La frecuencia del motivo CMR por 100 pb varía de 12.3 a la 14.3 para
RASSF1
y
RBSP3
genes, y el gen de la insulina contiene 16,5 tales motivos por 100 pb. Otros motivos mostraron la misma distribución (también mayor en el gen de la insulina), argumentando en contra de la participación de estas enzimas en la hypermutating
RASSF1
y
RBSP3
genes descritos aquí. De hecho, la APOBEC y enzimas AID causan mutaciones casi exclusivamente en C nucleótidos /g, mientras que se observó mutaciones de los 4 nucleótidos (Figura 3). Los resultados mostraron que en realidad mutaciones en A /T fueron aún más frecuente que en C /G. Hemos tratado de encontrar un motivo de reconocimiento. Estudiamos todas las mutaciones (Figura 3A) o un subconjunto de mutaciones (Figuras 3B y 3C), pero no hay motivos obvios hemos sido identificados aún.
En
RASSF1A
todas las mutaciones se analizaron. Para
RBSP3
mutaciones encontradas en el TGI (
B Opiniones) y en el cáncer humano (
C
) se analizaron por separado. gráficos de burbujas representan la proporción de las sustituciones se producen en cada una de las cuatro bases en el
RASSF1A
y
RBSP3
, en función de la distancia desde el nucleótido mutado (No. 0). N, cualquier nucleótido; B = C, G o T; D = A, G o T; S = G o C; V = A, C, o G; W = A o T.
Se necesitan más estudios para resolver esta cuestión ya que este patrón puede ser diferente en las células normales y cancerosas y podría depender de la composición de nucleótidos de un gen. Estas pequeñas diferencias en los patrones podrían enmascarar el motivo de reconocimiento.
RASSF1A
y
RBSP3
mutantes de la biopsia y RCC línea celular de cáncer de pulmón han reducido significativamente la actividad inhibidora del crecimiento
Hemos probado un
RASSF1A
genes, aislado de una biopsia por RCC que contenía dos mutaciones (Cys65Arg y Val211Ala), para la inhibición del crecimiento en condiciones de cultivo celular después de la transfección en el KRC /y y de próstata LNCaP células del cáncer . En las células KRC /Y el gen mutado tenía una actividad de supresión del crecimiento reducido significativamente (Figura 4A), mientras que en LNCaP que casi no tenía actividad supresora (igual que el vector vacío, véase [16], [17]).
A. El crecimiento de células KRC /Y RCC transformadas de manera estable con el tipo salvaje y mutante
RASSF1A
(Cys65Arg y Val211Ala) sin doxiciclina (el gen está en) se presenta en A. En el día 6, el número de células con peso
RASSF1A
fue de 3 × 10
5 y el número de células con mutante
RASSF1A
fue de 5 × 10
5 (1,7 veces más que en peso). En el día 10, el número de células con peso
RASSF1A
fue de 6 × 10
5 y el número de células con mutante
RASSF1A
fue de 1,8 × 10
6 (3 veces más de peso). El efecto de la expresión de tipo salvaje y mutante
RBSP3A
y
RBSP3B
en la eficiencia de formación de colonias en células KRC /Y se muestra en B. Los mutantes fueron aisladas de la línea celular N417 SCLC (His139Tyr) , la T4 biopsia del tumor de ovario (tres mutaciones: Asn31Asp, Pro79Ser y Glu87Lys) y la línea de células KRC /y (tres mutaciones: Lys35Met, Asp103Gly y Leu181Pro). El número de colonias blasticidina resistente en comparación con el Pete vacío fueron: 90% para el mutante de N417, 15% para el mutante de T4 biopsia y 25% para el mutante de KRC /Y. El número de colonias para wtRBSP3A fueron 5-10% en comparación con las colonias Pete.
En otro experimento, se utilizó
RBSP3
clones aislados de la línea celular N417 SCLC con una mutación His139Tyr . Una vez más se observó disminución significativa en la actividad supresora de crecimiento (Figura 4B) .Clearly, no todas las mutaciones encontradas en este estudio podría inactivar los
RBSP3
y
RASSF1
genes, y esto puede ser especialmente cierto para las mutantes aisladas de células normales algunos de los cuales podrían ser polimorfismos. De hecho, diferentes mutantes de
RBSP3
tenía significativamente diferente actividad supresora de crecimiento (Figura 4B).
Conclusiones
Mediante la secuenciación de 327
RASSF1A
y
RBSP3
clones, se detectaron 364 mutaciones con frecuencias alcanzando 0,70 por 100 pb. Curiosamente muchos clones contenían más de 1 mutaciones (véase la Tabla S3A, B, C). Sólo se detectó un SNP en
RASSF1A
diez clones (exon1α - AAG → CAG, K21Q) y fue excluido de la lista de mutaciones [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi? LocusID = 11186]. Sin SNP se encontraron en las secuencias RBSP3.
La frecuencia de mutaciones fue similar a otros casos reportados de hypermutations somáticas se encuentran en Rho /TTF, MYC y BCL6 en los linfomas de células grandes (MF fue de 0,12 a 0,69 para MYC para BCL6). Sin embargo, fue significativamente menor que para los genes de inmunoglobulina (12.7 mutaciones por 100 pb, véase [25]. Sin embargo, para la primera vez que encontramos alta frecuencia de mutaciones somáticas en diferentes tejidos, incluyendo genes supresores no hematopoyéticas y en tumor en contra de la anterior informes donde se estudiaron los oncogenes.
Como AccuPrime ™
Crea Pfx
ADN polimerasa se admite un error en 3 × 10
6 pb, nuestros resultados demostraron que las frecuencias de hipermutación observados en los experimentos podrían no se explica por la actuación errónea de polimerasas. En nuestro experimento con ratones SCID cuando AccuPrime ™
Pfx
ADN polimerasa y 25 ciclos fueron utilizados, el 85% de
RBSP3
clones contenían mutaciones.
Durante el crecimiento de las mismas líneas celulares
in vitro
, el 30% de los
RBSP3
clones (también 25 ciclos y AccuPrime ™
Pfx
ADN polimerasa) eran mutante .
En experimentos con
RASSF1A gratis (391 pb de la primera y segunda exones), el 65% de los clones contenían mutaciones (experimentos con células normales no están incluidos).