Extracto
Algunas
Escherichia coli producen toxinas
cepas cyclomodulins designados (CMS) que interfieren con el ciclo celular eucariota de las células huésped, lo que sugiere una posible relación entre estas bacterias y cánceres. Hay relativamente pocos datos disponibles sobre la colonización de los tumores de colon por
E cyclomodulin- y productoras genotóxico. coli
. Se realizó un análisis cualitativo y filogenética de
E asociado a la mucosa. coli
albergar genes que codifican cyclomodulin de 38 pacientes con cáncer colorrectal (CRC) y 31 con diverticulosis. La funcionalidad de estos genes se investigó en cultivos de células y se investigó la actividad genotóxica de cepas desprovistas de gen que codifica CM conocido. Los resultados mostraron una mayor prevalencia de B2 filogrupo
E. coli
que alberga los genes colibatin productoras de biopsias de pacientes con CCR (55,3%) que en los pacientes con diverticulosis de (19.3%), (p & lt; 0,01). Del mismo modo, una mayor prevalencia de B2
E. coli
que alberga los genes que codifican CnF1 en biopsias de pacientes con CCR (39,5%) que en los pacientes con diverticulosis de (12.9%), (p = 0,01). Análisis funcional reveló que la mayoría de estos genes eran funcionales. Análisis de la capacidad de los
E. coli
para adherirse a las células epiteliales intestinales Int-407 se indica que muy adherente
E. coli
cepas pertenecían en su mayoría a phylogroups A y D, cualquiera que sea el origen de las cepas (CRC) o diverticulosis, y que la mayoría
E. coli
cepas pertenecientes a filogrupo B2 muestran niveles muy bajos de adherencia. Además, el 27,6% (n = 21/76)
E. coli
cepas carentes de los genes que codifican cyclomodulin conocidos inducen daños en el ADN
in vitro
, según lo evaluado por el ensayo cometa. En contraste con cyclomodulin productoras de
E. coli
, estas cepas pertenecían principalmente a A o D
E. coli
phylogroups, y exhibieron una diferencia no significativa en la distribución de las muestras de CRC y diverticulosis (22%
frente
32,5%, p = 0,91). En conclusión, cyclomodulin productoras de
E. coli
la mayoría pertenecientes a filogrupo B2 coloniza la mucosa del colon de pacientes con CRC
Visto:. Buc E, D Dubois, Sauvanet P, Raisch J, J Delmas, Darfeuille-Michaud A, et al. (2013) alta prevalencia de asociado a mucosas
E. coli productora de
Cyclomodulin y genotoxin en el cáncer de colon. PLoS ONE 8 (2): e56964. doi: 10.1371 /journal.pone.0056964
Editor: John R. Battista, Universidad del Estado de Louisiana y A & amp; M College, Estados Unidos de América
Recibido: 12 de mayo de 2012; Aceptado 18 de enero de 2013; Publicado: 14 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Buc et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio Francés de Educación nacional, de la Recherche et de la Technologie, l'Institut National de la Santé et de la Recherche médicale (INSERM U1071), l'Institut National de la Recherche Agronomique (USC-2018) y la Ligue contre le cancer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es actualmente el tercer cáncer más común en hombres y mujeres, y la cuarta causa principal de muerte por cáncer en el mundo, con 1,2 millones de casos estimados y 609.000 muertes estimadas por año [1]. cuentas CRC esporádicos de alrededor del 95% de los casos colorrectales [2]. Los factores genéticos son por lo general cree que representan aproximadamente el 20% de las causas del cáncer con el medio ambiente que contribuye al riesgo restante 80% [3]. CRC es, por tanto, fuertemente asociado con exposiciones ambientales, incluidas las bacterias que contribuyen significativamente al entorno del colon. Se ha acumulado evidencia que muestra que la composición de la microbiota intestinal humana influye en el estado de salud del huésped. disbiosis microbiana se observa en pacientes con CRC y la evidencia de interacciones bacterianas en el CCR se ha informado de
Streptococcus bovis
,
Enterococcus spp.
,
Helicobacter pylori
,
Bacteroides fragilis
y
Escherichia coli gratis (para revisión ver [4]). Diversos estudios demuestran claramente un vínculo entre la mucosa adherente
E. coli Opiniones y CRC. Los estudios de pacientes con cáncer en el Reino Unido y Alemania revelaron que
E asociado a la mucosa. coli
identificados con más frecuencia en tejido de colon de pacientes con adenocarcinomas que en la de los controles [5], [6]. Swidsinski
et al.
Informó que sólo el 3% de las biopsias de la mucosa del colon de los controles asintomáticos analizadas fueron positivas para
E. Coli
con una PCR universales bacteriana [5]. En contraste, las biopsias de 92% de los pacientes con adenomas colónicos o carcinomas bacterias albergadas, con
E. coli sobre ser predominante en el 70% de los pacientes [5]. Del mismo modo, Martin
et al. Hola, ha encontrado que el 70% de los pacientes con CCR tenía bacterias asociados a la mucosa, y que una proporción significativa de bacterias pertenecían a la
E. coli
especies. Curiosamente, BRONOWSKI
et al.
Mostró que algunos
E. coli
cepas portadoras de genes de virulencia previamente clasificados como específicos para Uropatógena
E. coli gratis (UPEC) [7]. Tal
E. coli
cepas pueden desencadenar la proliferación celular en el tracto intestinal [8], como se ve con otras bacterias [9], [10].
E. coli
es la especie Gram-negativas aero-anaerobia predominantes de la flora intestinal normal y participa en la promoción de la estabilidad de la flora microbiana luminales y en el mantenimiento de la homeostasis intestinal normal [11]. Como comensal,
E. coli
coexiste con su huésped mamífero en buena armonía y rara vez causa la enfermedad. Sin embargo, algunas cepas tienen una combinación de genes de virulencia que les permiten causar intestinal (InPEC, enterobacterias presentes
E. Coli
) y extra-intestinales (ExPEC, Extraintestinal patógena
E. Coli
) infecciones (para revisiones, véase [12] - [14]). El análisis filogenético ha demostrado que
E. coli
se compone de cuatro principales grupos filogenéticos (A, B1, B2, y D) [15], [16]. Las cepas patógenas pertenecen principalmente a los grupos B2 y D, mientras que la mayoría de las cepas fecales pertenecen a los grupos A y B1. Las cepas de los grupos B2 y D llevan a menudo factores de virulencia que faltan en el grupo A y las cepas B1 [17] - [19].
Entre
E. coli
factores de virulencia, varias toxinas, llamados cyclomodulins, están atrayendo cada vez más atención, ya que son genotóxicas y /o modulan la diferenciación celular, la apoptosis y la proliferación (para revisión ver [4]). el factor necrotizante citotóxico (CNF) activa Rho GTPasas, que conduce a alteraciones citoesqueleto y afecta el ciclo celular. El factor de ciclo de inhibición (CIF) Objetivo cullins NEDD8 conjugado para secuestrar señalización de células huésped vías [20], [21]. El colibactin genotoxina es un compuesto híbrido de poliquétido de no péptido ribosomal [22]. Su mecanismo de biosíntesis está codificada por los
PKS
isla genómica. Colibactin causa de ADN doble hebra se rompe y una inestabilidad cromosómica en células eucariotas humanos [22], [23]. La toxina de hinchamiento citoletal (CDT) también induce daño en el ADN, probablemente a través de la actividad ADNasa, y una enzima estrechamente relacionados, producidos por
Helicobacter hepaticus
promueve la progresión de la hepatitis para pre-maligna, lesiones displásicas y aumenta la proliferación de hepatocitos, proporcionando la primera evidencia de que el CDT tiene potencial carcinogénico
in vivo
[24] - [26]
en el presente estudio, se comparó la prevalencia de los genes cyclomodulin- y genotoxin codifica en la mucosa. -asociado
E. coli
cepas de muestras de resección de los CRC y la diverticulosis. También se investigó la actividad genotóxica de
E asociado a la mucosa. coli
carente de genes conocidos que codifican genotoxin y su capacidad para adherirse a las células epiteliales intestinales.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
La aprobación ética para el estudio fue otorgado por el comité de ética de investigación Clermont-Ferrand. Esta IRB permitió la suspensión de la autorización por escrito y aprobado el proceso de obtener su consentimiento verbal de los sujetos potenciales, debido a que la investigación implica ningún procedimiento para el que normalmente se requiere el consentimiento por escrito fuera del contexto de la investigación y no presenta ningún riesgo de daño a los sujetos. Las muestras biológicas se obtuvieron de resección del colon, que se requieren para el tratamiento de pacientes. Los investigadores explicaron que el estudio del sujeto potencial verbalmente, proporcionando toda la información pertinente, como propósito, los procedimientos, los riesgos putativos. Después de esta explicación verbal, el sujeto potencial se le proporcionó una hoja de información del estudio. Después de permitir que el potencial de tiempo siempre que lea la hoja de información del estudio, el investigador respondió a las preguntas adicionales del sujeto potencial puede haber tenido. Se obtuvo un acuerdo verbal para participar en la investigación de todos los pacientes incluidos en el estudio. Las fechas de consentimiento verbal fueron rastreados en una forma no identificable.
Los pacientes
Con el fin de estudiar muestras macroscópicas de la resección de especímenes de colon, se compararon los pacientes con CCR y pacientes con diverticulosis como grupo sin cáncer. Sesenta y nueve pacientes fueron estudiados entre marzo de 2007 y noviembre de 2009 en el hospital universitario de Clermont-Ferrand, Francia. Treinta y ocho tenían CRC, y 31 habían complicado diverticulosis (Tablas S1, S2, S3). Los pacientes del grupo de CRC tenían cáncer de colon sin complicaciones y resecable desarrollado ya sea en el colon proximal (desde el ciego hasta el ángulo hepático del colon ascendente) o en el colon distal (colon sigmoide). CRC de la transversal o el colon descendiente fueron excluidos debido a su baja incidencia, y para evitar los riesgos de sesgo. En todos los casos, la operación consistió en la resección segmentaria del colon involucrado por el tumor con anastomosis inmediata y sin desviación del estoma. Los pacientes con CRC complicado (obstrucción, perforación o infección) fueron excluidos del estudio. Los pacientes del grupo de la diverticulosis tenían diverticulosis involucrando el colon sigmoide y requiere cirugía debido a una historia de complicaciones (diverticulitis recurrente, abscesos, peritonitis). Se excluyeron los pacientes con inflamación aguda o crónica en el momento de la cirugía, y aquellos con estenosis. En el caso de un reciente ataque de diverticulitis, los antibióticos fueron detenidos al menos 3 semanas antes de la cirugía. La proporción de sexos fue de 1,05 y 0,72 para los pacientes con CRC y DIV respectivamente. El rango de edad fue de 35-95 años para los pacientes con cáncer (edad media, 71 años y la edad media, 67 años) y 34-81 años para los pacientes con diverticulosis (edad media, 58 años y la edad media, 60 años). Las muestras se tomaron en el colon resecado, en el sitio de los tumores malignos de pacientes con CRC y en la mucosa normal para pacientes diverticulosis. análisis anatomopatológico confirmó las características neoplásicas de las muestras en pacientes con CRC, y la falta de inflamación o displasia en pacientes diverticulosis. La serie CRC compuesto 21 proximal y 17 muestras de colon distal. estadio TNM se informa en las Tablas S1 y S2. Preparación intestinal fue por picosulfato de sodio oral o polietilenglicol oral, la noche antes de la cirugía. Todos los pacientes habían recibido resección cefoxitina (2 g por vía intravenosa) en el momento de la incisión y ninguno había recibido antibióticos en las 4 semanas antes del muestreo.
Tratamiento de la muestra
Las muestras de mucosa se pusieron en 10 ml de fosfato estéril solución salina tamponada de pH 7,4 (PBS) y se transporta en hielo al laboratorio. Se pesaron las muestras (50 a 100 mg cada uno) y se lavaron a fondo tres veces en 10 ml de PBS para eliminar la mayor parte de las bacterias fecales. Cada etapa de lavado fue seguida de centrifugación a 900 g durante 5 minutos. Las muestras fueron entonces aplastados (Ultra-Turrax, IKA) y se incubaron durante 15 minutos en un rotador de tubo a temperatura ambiente en presencia de Triton 0,1X. diluciones decimales del lisado se sembraron en agar Drigalski y agar cromogénico chromID CPS3® (bioMérieux), lo que permite la identificación de los
E. coli
.
E. coli
colonias se recogieron después de 24 horas de incubación a 37 ° C y la identificación de bacterias se confirmó con el sistema automatizado Vitek II® (bioMérieux). Cuando sea posible un máximo de 96
E. coli
colonias por muestra se recogieron para la tipificación molecular. Las bacterias se subcultivaron durante 24 horas a 37 ° C en placas de 96 pocillos en medio Luria Bertani suplementado con 15% de glicerol y se almacenó a -80 ° C.
tipificación molecular y agrupación filogenética
Diez colonias por muestra fueron mecanografiadas con métodos moleculares para identificar el
E. coli cepas
(
E. coli
genotipos) colonizando las muestras. Se utilizaron dos métodos de genotipado, una secuencia de "Enterobacterial repetitiva consenso intergénica" (ERIC)-PCR usando el cebador ERIC2 (5'-AAG ACT GGG GTG GTG TAA AGC G-3 ') un "ADN polimórfico amplificado al azar" y (RAPD) - PCR utilizando el cebador 1283 (5'-GCG ATC CCC A-3 ') [27], [28]. Una cepa representativa se analizó posteriormente y se almacenó a -80 ° C en medio Luria-Bertani suplementado con 15% de glicerol.
E. coli
cepas fueron clasificados de acuerdo a la
E. coli
sistema de colección de referencia (ECOR) [16] en grupos filogenéticos A, B1, B2, y D usando una técnica de PCR múltiple [29]. RS218 Strain, que alberga todos los genes dirigidos por el PCR multiplex, se utilizó como control positivo.
Detección e identificación de genes cyclomodulin productoras
Cyclomodulin-codificación de los genes fueron detectados por dot-blot los experimentos de hibridación de ADN en todos los
E. coli
cepas. Las sondas se obtuvieron por PCR como se describe anteriormente [30] (Tablas S4 y S5) utilizando el kit de síntesis de sonda PCR DIG (Roche Applied Sciences, Switserland) según las instrucciones del fabricante. muestras de ADN de dos microgramos se fijaron a membranas de nylon cargadas positivamente por iluminación UV durante 20 min. La hibridación se realizó con el etiquetado y detección kit Roche (Roche Applied Sciences) como se indica por el fabricante. Cada punto se comprobó con una sonda del gen 16S rRNA. El
PKS
isla, que contiene el grupo de genes colibactin productoras, se rastreó con una sonda de la superposición de los
clbK
y
clbJ
genes. El
CNF
genes fueron detectados con una mezcla de sondas específicas de
CnF1
,
CnF2
, y
cnf3
. El
cdtB
genes fueron detectados por dos experimentos de hibridación con el
cdtB-II-III-cdtB-cdtBV Opiniones y
cdtB-I-IV-cdtB
mezclas de sondas. El
cif
gen se detectó utilizando una sonda específica interna. La sensibilidad y especificidad de las sondas se comprueban en cada membrana mediante la detección de los extractos de ADN de todas las cepas de control cylomodulin. hibridaciones positivas con una sonda cyclomodulin se sometieron a ensayos de PCR de confirmación como se informó anteriormente [30]. La mezcla de reacción contenía 50 ng muestra de ADN, 0,2 mM cada desoxinucleósido trifosfato (dNTP), 0,4 M de cada cebador, MgCl2 3 mM, y 1,0 U de ADN RedGoldStar polimerasa (Eurogentec, Bélgica) en el tampón de reacción correspondiente. Cebadores localizados en las regiones de la isla PKS (los genes CLBA y clbQ) 5 'y 3' se utilizaron para confirmar la presencia plena de la isla colibactin productoras.
ensayos citopáticos
HeLa células (derivadas de cáncer cervical) comprados a ATCC (ATCC® CCL-2
TM) se mantuvieron en una atmósfera que contiene 5% de CO2 a 37 ° C en un medio apropiado. Las células se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% (vol /vol) de suero de ternera fetal (Lonza, Walkersville, MD EE.UU.), 1% de L-glutamina (Life-Technologies), 200 U de penicilina, 50 mg de estreptomicina, 0,25 mg de amphoterocin B por litro, y 1% de HEPES solución salina tamponada (Lonza). Fueron sembradas en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos a 5 x 10
4 células /pocillo durante 24 H. Se investigaron los efectos citopáticos del CNF y CDTs en todas las cepas de lisado celular, como se describe anteriormente [31]. En pocas palabras, los efectos de la CDT y CNF se detectaron mediante un ensayo de lisado celular que interacciona. Después de 48 cultura H a 37 ° C con agitación en medio de caldo Luria-Bertani, las células bacterianas se sometieron a ultrasonidos y esterilizada por filtración por separado utilizando filtros de 0,22-micras de tamaño de poro. células HeLa se trataron con los lisados estériles sonicadas (concentración final de proteína: 4 g /ml) hasta su análisis. Los efectos de colibactin y Cif se detectaron mediante un ensayo de células de bacteria de interacción, basado en la interacción entre las células HeLa y bacterias. Noche a la mañana Luria-Bertani caldos de cultivo de
E. coli
se lavaron tres veces y se diluyó en un medio de interacción. cultivos de células HeLa se infectaron a multiplicidades de infección (MOI, el número de bacterias por célula en el inicio de la infección) de 100 y 200. Las células se lavaron 4 H después de la inoculación y se incubaron en medio de cultivo celular con 200 g /ml de gentamicina hasta que el análisis . Después de 72 horas de incubación a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5%, se retiró el medio de tres lavados de las monocapas de células HeLa. Se observaron los cambios morfológicos característicos de la CDT, CNF, colibactin, y CIF después de teñir con tinción de Giemsa. La identificación se basa en la capacidad de cualquiera de lisado bacteriano que contiene CNF y CDT o bacterias vivas enteras que producen colibatin y CIF para inducir un efecto citopático en las células epiteliales analizados a los 3 días después de la infección. Colibactin, CDT y CIF inducen efectos citopáticos, como se evidencia por los núcleos agrandados y distensión celular (megalocitosis), mientras que CNF inducida multinucleación, y ampliación de las células HeLa. Multinucleación se observa en & gt; 50% de células infectadas por bacterias productoras de CNF y en alrededor de 10% de las células no infectadas o células infectadas con otras cepas productoras de CM. Para CNF y CDT, el efecto citopático sólo es observable con lisados bacterianos. En contraste, para colibactin y CIF, se requiere el contacto entre las bacterias y las células huésped. La detección de alfa-hemolisina se realizó para todas las cepas estudiadas por el crecimiento durante la noche a 37 ° C en Columbia con sangre de oveja (5%) de agar (Oxoid, Dardilly, Francia).
E. coli
25922 (ATCC) se utilizó como cepa de referencia para la producción de alfa-hemolisina.
electroforesis en gel de celda única
La actividad genotóxica de
E. coli
cepas carentes de los genes que codifican CM conocidos se investigaron mediante electroforesis en gel de una sola célula (ensayo cometa). cultivos de células HeLa se infectaron a MOI de 500 con
E. coli
cultivaron durante la noche en caldo Luria-Bertani. Las células se lavaron dos veces 3 H después de la inoculación y se incubaron durante la noche en medio de cultivo celular con 200 g de gentamicina /ml a 37 ° C bajo un 5% de CO
2 atmósfera. Posteriormente fueron lavadas con medio de PBS y se combinan con 0,5% de bajo punto de fusión de agarosa (Bio-Rad, Marnes la Coquette, Francia) disuelta en PBS estéril a 37 ° C. La mezcla de células de agarosa se aplicó a un portaobjetos de microscopio pre-revestido con agarosa punto de fusión normal de 1,5% (Molecular Biology Grade, Bio-Rad) disuelto en PBS estéril a 37 ° C. Una hoja de cubierta se aplicó y se dejó solidificar a 4 ° C durante 60 min. Los portaobjetos se colocaron en 50 ml de tampón de lisis (10 mM Tris-HCl, 2,5 M NaCl, EDTA 100 mM que contiene 1% de Triton X-100, 10% de DMSO, pH 10) durante 2 horas a 4 ° C en la oscuridad. Los portaobjetos se sumergieron en tampón de electroforesis (NaOH 1 mM EDTA 300 mM pH 13) durante 1 hora a 4 ° C y un campo eléctrico se aplicó (1 V /cm) durante 40 minutos. Los portaobjetos se neutralizaron con 400 mM Tris-HCl pH 7,5 y se seca. 40 l de una dilución 1: 10.000 de SybrGreen se aplicó directamente a la diapositiva. Las células individuales o cometas han sido vistas por microscopio de fluorescencia Zeiss Axioplan2. El B2
E. coli cepa
IHE3034 y
E. coli
DH10β pBACpks se utilizaron como controles positivos [22]. El B2
E. coli cepa
IHE3034 Δ
CLBP
y
E. coli
DH10β pBAC se utilizaron como controles negativos [22].
ensayo de adhesión
Int-407 células (derivado de yeyuno embrionario intestinal humano y el íleon) comprado de ATCC (CCL ATCC® -6
TM) se mantuvieron en una atmósfera que contiene 5% de CO2 a 37 ° C en un medio apropiado. Ellos se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% (vol /vol) de suero de ternera fetal (Lonza, Walkersville, MD EE.UU.), 1% de L-glutamina (Life-Technologies), 200 U de penicilina, 50 mg de estreptomicina, 0,25 mg de amphoterocin B por litro y 1% HEPES solución salina tamponada (Lonza). Brevemente, las células se sembraron a una densidad de 2 × 10
5 células /cm2 en placas de cultivo de 48 H. Se realizó la infección a una multiplicidad de infección de 10 bacterias por célula. Las células infectadas se centrifugaron a 900 g durante 10 min a 25 C y se colocaron a 37 ° C durante 3 H. Las células se lavaron tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7,2). Las células epiteliales se lisaron con 1% de Triton X-100 (Sigma) en agua desionizada. Las muestras se diluyeron y se sembraron en medio Luria-Bertani (LB) placas de agar para determinar el número de CFU que corresponde al número total de bacterias asociadas a células. Las cepas
E. coli K12
y
E. coli
LF82 se utilizaron como controles negativos y positivos, respectivamente [32]. Los resultados se expresan como número de bacterias adheridas por célula después de un período de infección 3H.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó mediante la exacta de Fisher y pruebas de chi-cuadrado. Para las comparaciones de múltiples grupos, se realizó una prueba inicial de chi-cuadrado para la heterogeneidad, y sólo si, se produjeron un valor de P & lt; 0,05 se probaron las comparaciones por pares individuales
Resultados
E. coli
cepas en el cáncer de colon, diverticulosis muestras
El análisis de los
E. coli
cepas indicaron que el número de muestras sin
E. coli
fue significativamente mayor en los pacientes diverticulosis (19,4%, n = 6/31) que en aquellos con CRC (2,6%, n = 1/38), p = 0,04 (Tabla 1). Muchos especímenes colónicos albergaban sólo un
E. coli
genotipo. Esto se observó en 42,1% (n = 16/38) de las muestras de CRC y sólo en 25,8% (n = 8/31) de la diverticulosis pero la diferencia no fue significativa (p = 0,12). La mayoría de las cepas aisladas de CRC pertenecían a la filogrupo B2 (73,7%, n = 28/38) en contraste con los aislados de diverticulosis (41,9%, n = 13/31), p & lt; 0,01 (Tabla 2). No hubo diferencias significativas en
E. Se observó coli
distribución filogrupo, incluso para B2
E. coli
cepas aisladas de proximal (82,4%, n = 14/17) y los tumores de colon distal (66,7%, n = 14/21), p = 0,23 (Tabla 2). En general
E. coli
cepas pertenecientes a los tumores de colon B2 filogrupo colonizados con mayor frecuencia que lo hicieron muestras diverticulosis.
Distribución de CM-codificación de los genes de acuerdo con
E. coli
grupos filogenéticos
La distribución de CM-codificación de los genes en
E. coli
cepas se muestran en la Tabla 3 y en las Tablas S1, S2, S3. El rasgo más frecuente fue el colibactin-codificación
PKS
isla (80% de
E-CM producir.
Coli, n = 28/35 y el 24,1% del total de
E. Coli
cepas, n = 28/116). Todas las cepas asociadas con la mucosa del colon de pacientes con CRC o diverticulosis que alberga el colibactin-codificación
PKS
isla pertenecían a filogrupo B2 (p & lt; 0,001 para el grupo B2
frente
grupos A, B1 y D, individuales o combinados). Además, el 16,4% (n = 19/116) de las cepas poseían el
CNF
gen; de estos, sólo uno era
CnF2
-positivo y ninguno fue
cnf3
-positivo, lo que indica que estas cepas no eran de origen animal [33], [34]. Todos los
CnF1
cepas -harboring pertenecían también a filogrupo B2, y representaron el 36,7% (n = 18/49) de las cepas de este filogrupo. En cuanto a la
PKS
isla, la asociación
CnF1
con filogrupo B2 era fuerte (p & lt; 0,001 para el grupo B2
grupos frente a
A, B1 y D, individuales o combinadas ), y el 33% (n = 16/49) de las cepas B2 poseían tanto el
PKS
isla y el
CnF1
gen (p & lt; 0,001 para el grupo B2 frente a los grupos a, B1 y D , individuales o combinados), como se ha observado anteriormente [30], [35]. Todos menos tres cepas que albergan
CnF1
gen exhibieron el fenotipo alfa hemolítico. Sin embargo, los tres no hemolítica
CnF1
cepas positivas a albergaban el gen
hlyC
. Se observaron el
cdtB
genes en seis cepas. A pesar de que cuatro de los seis
cdt
cepas -positivos pertenecían a filogrupo B2, no se observó una asociación significativa con un grupo filogenético en particular, incluso con los diferentes
cdtB
subtipos de genes.
cdtB-I
/
cdtB-IV
genes (n = 5) con mayor frecuencia se observó que las del
cdtB-II-III-cdtB-cdtBV
grupo de genes (n = 1). La única
cdt-III
cepa -positivo también albergaba el
CnF2
gen, una combinación de genes reportados con frecuencia en el plásmido pVir y sobre todo visto en las cepas de origen bovino [36], [37 ]. El
cdtB
genes no mostraron ninguna relación particular con el colibactin-codificación
PKS
isla o el
CnF1
gen. Desde
genes CDT
han sido ampliamente estudiado en Shiga
E productora de la toxina. coli gratis (STEC) de las cepas [38] - [40], se decidió investigar
cdtB
-positivo cepas de
STX
y
eae
genes. No
STX
o
eae
gen se detectó en
cdtB
cepas -positivos. Se detectó la
cif
gen en tres cepas que pertenecían a phylogroups A (n = 1) y B1 (n = 2) y albergado no hay otros genes que codifican CM-. CIF es un efector del sistema de secreción de tipo 3 codificada por el locus de enterocito effacement (LEE) observada en enteropatógena
E. coli gratis (EPEC) y enterohemorrágica
E. coli gratis (EHEC) [41], [42] y las tres cepas positivas en este estudio poseía el
eae
gen pero ni los
Stx1
ni
stx2
genes , y por lo tanto pertenecía al patotipo EPEC.
detección fenotípica de cyclomodulins
lisado celular que interacciona con las pruebas se utilizaron para investigar la producción de CNF y CDT en todas las cepas. La detección de colibactin y producción CIF, que requieren pruebas de células de la bacteria de interacción, sólo fue posible en las cepas no hemolíticas, porque las cepas de producción de hemolisina, en contraste con los lisados correspondientes, inducida por la muerte celular rápida. Los resultados se dan en las Tablas S1, S2, S3. Colibactin, CDT y CIF inducen efectos citopáticos, como se evidencia por los núcleos agrandados y distensión celular (megalocitosis), mientras que CNF inducida multinucleación en ≥50% de las células y ampliación de las células HeLa (Figura 1). Para CNF y CDT, el efecto citopático fue sólo observable con lisados bacterianos, mientras que se requiere un contacto entre las bacterias y células huésped para colibactin y CIF, como se informó anteriormente (Figura 1) [22], [31], [42]. La observación de un efecto citopático se asoció a la presencia de genes que codifican CM. Tres cepas que albergan un
PKS
isla aislada de la diverticulosis, distal y proximal especímenes de colon no indujo ningún efecto citopático. Una cepa aislada de una muestra de la diverticulosis no funcional tenía un
CnF1
gen y dos
cdt
cepas positivas a no mostró ningún efecto citopático. Para la cepa que alberga el
CnF2
y
cdt
-III genes, & gt; 50% de células multinucleadas fe de la producción de CNF y la amplia megalocitosis atribuido a la producción CNF o su combinación con CDT-III . Se observó un efecto citopático para las cepas que albergan el
cif
gen. En general, la mayoría de los genes que codifican CM-eran funcionales, en particular
CNF
y
cif gratis (93% y 100%, respectivamente).
Para CNF y CDT, el efecto citopático sólo es observable con lisados bacterianos. En contraste, para colibactin y CIF, se requiere un contacto entre las bacterias y las células huésped. Colibactin, CDT y CIF inducen efectos citopáticos como se ve por los núcleos grandes y distensión celular (megalocitosis), mientras que indujo CNF multinucleación y ampliación de las células HeLa.
Distribución de CM-codificación de los genes en función del origen de muestras y la phylogroupe
los resultados se muestran en la Tabla 4, la Figura 2 y en las Tablas S1, S2, S3. Veinticinco muestras de CRC entre 38 (65,8%) contenían
E-CM positivo. coli Opiniones y sólo 6 muestras diverticulosis entre 31 (19,4%), lo que indica que las cepas que albergan CM-se asociaron preferentemente con CRC (p & lt; 0,01). Esta diferencia se asoció con un alto número de B2 CM-positivo
E. especímenes coli
en CRC en comparación con la observada en especímenes diverticulosis (Figura 2). En consecuencia, cepas portadoras de colibactin-codificación
PKS
isla estaban presentes en el 55,3% de las muestras de CRC (n = 21/38) y sólo en el 19,3% de las muestras diverticulosis (n = 6/31), lo que indica que
PKS
cepas positivas fueron significativamente (p & lt; 0,01) más frecuente en CRC. En menor medida,
CNF
y
cdt
positivo
E. coli
fueron significativamente (p≤0.02) más prevalente en el CRC que en las muestras diverticulosis. Estas diferencias se deben principalmente a la alta prevalencia de
PKS CD -,
CNF CD - y
cdt
-positivo
E. coli en muestras de CRC
distales comparación con la de los especímenes diverticulosis (p≤0.01). En conjunto, estos resultados indican que la CM-positivo
E. coli
distribución difiere de acuerdo al espécimen origen.
A,
E. coli
cepas (n = 70) aisladas de muestras de CRC (n = 38), y B,
E. coli
cepas (n = 46) aisladas de muestras diverticulosis (n = 31).
La genotoxicidad de los
E. coli
carente de genes
Hemos investigado si
E-CM codificación. coli
carente de genes que codifican CM conocidos pueden inducir daño en el ADN en las células huésped. El uso de células HeLa cultivadas, la genotoxicidad de las cepas fue investigado por el ensayo de una sola célula de electroforesis en gel (o ensayo cometa), la técnica del estado de la técnica para la detección de daños en el ADN causado por genotoxinas químicos. Un total de 76
E clínica. Se investigaron coli
cepas; 15 originó a partir de cáncer de colon proximal, 21 de cáncer de colon distal y 40 de diverticulosis. Estas cepas pertenecían a A (n = 29), D (n = 21) y phylogroups B2 (n = 17). Curiosamente, el 27,6% (n = 21/76) de
E. coli
cepas carentes de genes CM codifica conocidos indujo la formación de los cometas, que son típicos de daño en el ADN de la célula huésped (Figura 3 y las Tablas S1, S2, S3). Además, en contraste con CM-producir
E. coli
cepas, que pertenecen principalmente a la filogrupo B2, estas cepas positivas de cometas pertenecían principalmente a A (52%, n = 11/21) y D (29%, n = 6/21) phylogroups. Se observaron cometas con 13 cepas (32,5%) entre los 40 aislados de pacientes con diverticulosis, y con 8 cepas (22%) entre 36 en pacientes con CCR. La distribución de estas cepas genotóxicos putativos en las muestras fue, por tanto, diferente de la de las cepas de CM-codificación.
daño en el ADN no se detectó en células HeLa infectadas con el
E.