Extracto
Aplicaciones
Los cambios radicales en tanto la expresión como la glicosilación patrón de mucinas transmembrana tienen ha observado en diversos tumores malignos. Nosotros y otros han demostrado que la MUC1 y MUC4, dos mucinas transmembrana, juegan un papel centinela en los eventos de señalización celular que conducen a varias neoplasias epiteliales. En el presente estudio, se determinó el perfil de expresión de MUC1 y MUC4 en el urotelio de la vejiga no neoplásica, en diversos tumores malignos de vejiga y en líneas celulares de carcinoma de vejiga.
Material y Métodos
la inmunohistoquímica se realizó sobre secciones de tejido de las biopsias de la vejiga urinaria, muestras de resección y microarrays de tejidos (TMA) con anticuerpos monoclonales específicos para MUC1 y MUC4. También se investigó su expresión en líneas celulares de carcinoma de vejiga por RT-PCR e inmunotransferencia.
Resultados
MUC1 se expresa en la superficie apical o en células paraguas del urotelio de la vejiga no neoplásica normal. Fuerte expresión de MUC1 también se observó en el carcinoma urotelial (UC). MUC1 tinción aumentó de urotelio normal (n = 27, 0,35 ± 0,12) para el carcinoma urotelial (CU, n = 323, H-score, 2,4 ± 0,22, p≤0.0001). En contraste con MUC1, MUC4 se expresó en todas las capas de urotelio de vejiga no neoplásica (n = 14, 2,5 ± 0,28), tanto en la membrana celular y el citoplasma. En comparación con urotelio no neoplásico, se observó la pérdida de la expresión MUC4 durante carcinoma urotelial (n = 211, 0,56 ± 0,06). Sin embargo, se observó re-expresión de MUC4 en un subconjunto de casos con metástasis de carcinoma urotelial (significa H-Score 0,734 ± 0,9).
Conclusión
La expresión de MUC1 se incrementa mientras que la de MUC4 disminuyó en UC en comparación con el urotelio no neoplásica normal. La expresión de ambas MUC1 y MUC4, sin embargo, son significativamente mayores en los casos de carcinoma metastásico uroteliales en comparación con UC localizada. Estos resultados sugieren que la expresión diferencial de MUC1 y MUC4 durante el desarrollo y progresión del carcinoma de vejiga
Visto:. Kaur S, Momi N, S Chakraborty, Wagner DG, Cuerno AJ, Lele SM, et al. (2014) la expresión alterada de transmembrana mucinas, MUC1 y MUC4, en el cáncer de vejiga: implicaciones patológicas en el diagnóstico. PLoS ONE 9 (3): e92742. doi: 10.1371 /journal.pone.0092742
Editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Enero, 2014; Aceptado: February 25, 2014; Publicado: 26 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Kaur et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por las becas de los Institutos nacionales de Salud (RO1 CA 138791, U54 CA163120, CA111294 UO1 y CA127297 P50). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga (BCA) es la quinta enfermedad común en los Estados Unidos representa casi 72.570 nuevos casos y 15.210 muertes relacionadas con cáncer en 2013 [1]. El carcinoma urotelial (CU) es el tipo histológico más común de BCa que da cuenta de & gt; 90% de los casos recién diagnosticados. UC en el momento del diagnóstico gama de lesiones papilares de bajo grado superficiales (asociada con un mejor pronóstico) a los carcinomas malignos altamente invasivos (altamente agresivo con una baja supervivencia). Aproximadamente, el 70-80% de los nuevos diagnósticos de los UC son "no músculo invasivo" en el que la enfermedad se limita a la mucosa de la vejiga o la lámina propia (estadio Ta /T1 según la clasificación TNM) [2]. Alrededor del 10% -30% de estos tumores avanzar a la "enfermedad del músculo invasivo" ( "alto grado" de la UC) (estadio T2 /T3) [2]. cánceres papilares de bajo grado son por lo general no invasiva (sólo & lt; 15% invaden la pared de la vejiga) y por lo tanto susceptibles de resección quirúrgica. Sin embargo, los casos de carcinoma invasivo de alto grado se asocian con una alta probabilidad de metástasis y la mortalidad [3], [4]. Citología y la cistoscopia con biopsia de tejido siguen siendo los métodos más precisos disponibles para detectar BCa hasta la fecha. La citología es altamente específico para el carcinoma urotelial de alto grado, pero no para el carcinoma urotelial de bajo grado.
En los últimos años, se han reportado cambios aberrantes en la expresión y glicosilación de mucinas en inflamatoria, premalignas y malignas condiciones [5 ] - [10]. Las mucinas son glicoproteínas que se caracterizan por la presencia de alto grado de O- y N-glicosilación junto con tramos cortos altamente repetitivas de restos de aminoácidos (denominada como "repeticiones en tándem") [9]. Estos se dividen en dos grandes categorías, a saber mucinas unidas a la membrana y secretadas /mucinas formadoras de gel. Es importante destacar que, MUC1 y MUC4 representan las mucinas trans-membrana bien caracterizados que juegan un papel importante en la fisiología celular. En virtud de su estructura y composición bioquímica de estas mucinas participa en la lubricación e hidratación de las superficies celulares, la protección a partir de microorganismos (bacterias y virus) y enzimas degradantes [11]. La variación en el patrón de expresión y glicosilación de MUC1 y MUC4 se ha observado en varias neoplasias epiteliales incluyendo páncreas, mama, colon, próstata y cáncer de pulmón [7], [9], [12], [13]. Se han demostrado que desempeñan un papel crítico en el crecimiento del tumor, la señalización intracelular y extracelular, interacciones tumor-estroma, metástasis y resistencia a los agentes quimioterapéuticos y en la vigilancia inmune [7], [11], [12], [14]. La disponibilidad de reactivos altamente específicos (
por ejemplo.
Anticuerpos monoclonales), algunos capaz de reconocer glicoformas alteradas ha hecho mucinas objetivos atractivos para el diagnóstico precoz de tumores malignos epiteliales. Alterado expresión y localización patrón de MUC1 se han observado durante la progresión de los tumores malignos de vejiga [15] - [18], sin embargo hasta la fecha no se dispone de poca información sobre el estado de MUC4. Teniendo en cuenta sus papeles protectores y lubricantes, es importante evaluar sus funciones en la vejiga sana y la alteración en su expresión durante el desarrollo y progresión del carcinoma urotelial.
En el presente estudio, se examinaron los patrones de expresión de MUC1 y MUC4 en urotelio de la vejiga no neoplásica y las neoplasias malignas de tejidos de la vejiga en microarrays de tejidos (TMA) y secciones de tejido de las biopsias de vejiga urinaria y muestras resecadas. Además, la correlación entre la expresión de estas mucinas y el grado tumoral (grados 1-4) se examinó para definir el significado de diagnóstico y fisiológica de las mucinas TM durante la patogénesis de la UC.
Materiales y Métodos
Líneas celulares tumorales y muestras de tejido
fijadas con formalina muestras de tejido se obtuvieron BCa archivados Universidad de banco de tejidos Nebraska Medical Center. La junta de revisión encontró este estudio, con su base de datos sin identificación, estando exentos de revisión junta de revisión institucional. Vejiga TMA fueron adquiridos de Biomax Estados Unidos para la tinción de MUC1 (cat#BL802), Accumax para MUC4 (cat#A215II) y la vejiga TMA (2004) (una especie de regalo del Dr. Henry Frierson de la Universidad de Virginia en Charlottesville VA). IHC tinción se realizó utilizando mAb HMFG2 (anticuerpo anti-MUC1, una especie de regalo del Dr. Gendler, Mayo Clínicas), y mAb8G7 (anticuerpo anti-MUC4, generado contra el péptido de repetición en tándem, STGDTTPLPVTDTSSV en nuestro laboratorio y reactivos con tanto la proteína nativa y péptido) [19]. Vejiga líneas celulares de carcinoma [T24 y HT1376, (derivados de vejiga carcinoma de células de transición), la cultura TCCSUP (derivada de un carcinoma de células de transición anaplatic) SCaBER (derivado de vejiga carcinoma de células escamosas) se mantuvieron en la American Type Culture Collection (ATCC) especificado medio suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco BRL, Grand Island, NY). El medio de crecimiento se cambió en días alternos y las células se tripsinizaron a 70% de confluencia.
La inmunohistoquímica (IHC)
Para el análisis de MUC1 y MUC4 expresión en tumores malignos de vejiga, IHC se realizó tal como se describe anteriormente en TMA secciones de tejido y de las muestras de la vejiga urinaria [7]. Las muestras de biopsia y la resección de un carcinoma urotelial fueron revisados por los patólogos (Dres. S Lele, AH Horn, y la Dirección General de Wagner en UNMC) para confirmar los diagnósticos y también seleccionar bloques representativos para los análisis inmunohistoquímicos. Para el tejido IHC, 4 micras de espesor secciones fueron cortadas de los bloques de tejido incluidos en parafina utilizando microtomo de tejido y se adhirieron a las placas de vidrio cargadas. Vejiga TMA y las secciones de tejido se incubaron durante la noche a 56 ° C seguido de desparafinación mediante repetidos lavados de xileno (5 min cada uno) seguido de rehidratación de los tejidos con alcohol graduado. Después de la rehidratación, los tejidos se incubaron con solución metanólica de 3% H
2O
2 para enfriamiento rápido de la actividad peroxidasa endógena. El calor inducido por la recuperación de antígeno se llevó a cabo calentando la muestra en 0,01 M de citrato (pH 6,0, 95 ° C) de tampón durante 15 minutos en horno de microondas. Tras la recuperación de antígenos, las secciones se bloquearon con suero de caballo (kit anticuerpo ImmPRESS universal; Vector Laboratories) durante 3 horas a temperatura ambiente. Los portaobjetos se incubaron adicionalmente con anti-MUC1 (HMFG2 a 1:05 dilución de sobrenadante enriquecido en PBS), el anticuerpo 8G7 MUC4 (1:2000 dilución de una acción 1,8 mg /ml en PBS) [20] durante la noche a 4 ° C. Después de cuatro lavados con PBS-T (PBS que contiene 0,05% de Tween 20), las secciones se incubaron con anticuerpo secundario anti-ratón (kit anticuerpo ImmPRESS universal; Vector Laboratories) durante 30 min. y posteriormente, el color se desarrolló mediante la adición de solución de 3,3'-diaminobencidina (kit de sustrato DAB; Vector Laboratories). precipitado de color marrón rojizo indica inmuno-reactividad positiva. Las diapositivas fueron contra el teñidas con hematoxilina de Gill (Vector Laboratories), se deshidrataron en etanol clasificado, seguido de xileno y se montaron con medio Vecta-montaje de montaje (Vector Laboratories). Todos los portaobjetos se analizaron usando un microscopio Nikon Eclipse E400 (Nikon Corporation, Tokio, Japón).
Cada núcleo de tejido se evaluó por los uropathologists en UNMC para evaluar la presencia de tumor y la puntuación de la tinción. En pocas palabras, cada punto en la matriz de tejido se calificó basa en la intensidad de la tinción en una escala de 0 a 3 (0-no tinción, tinción 1-débil, tinción 2-intermedio, y 3-fuerte tinción). El porcentaje de células positivas con una intensidad dada para cada muestra se determinó por los patólogos. El H-score [intervalo: 0 (sin tinción en cualquier celda) a 3 (todas las células de la tinción con la más alta intensidad (3)] se calculó como la suma del producto de la intensidad de la tinción (rango: 0-3) y la proporción de tinción de las células (rango: 0-1; 0-ninguna célula células teñidas y 1-100% teñido). de acuerdo con la puntuación H-reactividad focal corresponde a la puntuación H de ≤0.1, la reactividad leve (puntuación de H & gt; 0,1 pero inferior o igual a 1,0), la reactividad moderada (puntuación H & gt; 1,0 pero ≤2.0) y reactividad intensa (puntuación H & gt;. 2.0) en el caso de las biopsias de tejido debido a un número limitado cada tipo de tejido (benignos, carcinoma in situ y carcinoma) presente en la diapositiva se puntuó en la intensidad puntaje solo. en los casos metastásicos, las secciones fueron anotados para H-anotando similares a las manchas de los tejidos.
los análisis estadísticos se analizó
los datos utilizando Medcalc para la versión de Windows software 9.6.4.0. Para los fines del análisis, cada punto se consideró como una muestra individual. la intensidad de la expresión de mucina se consideraron como variables continuas, sin embargo, el tipo de patología [UC, carcinoma de células escamosas (SCC), adenocarcinoma o carcinoma papilar] , grado del cáncer se consideraron como variables categóricas. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró significativo
El aislamiento de ARN total y la transcriptasa inversa-reacción en cadena de la polimerasa
ARN celular de las células cultivadas se extrajo mediante el kit RNeasy de acuerdo con las instrucciones del fabricante (. Qiagen, Hilden, Alemania). El ARN total se cuantificó usando un espectrofotómetro de ultravioleta (Peqlab ND-1000; Peqlab, Erlangen, Alemania) y la calidad y la integridad de las muestras se evaluaron en un gel de agarosa al 1,5%. 2 g de ARN total de cada línea celular BCa fue transcrita invertir utilizando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena (Perkin Elmer, Branchburg, NJ) según las instrucciones del fabricante. La cuantitativa en tiempo real PCR se realizó para MUC1, MUC4, y β-actina utilizando siguientes pares de cebadores: MUC1 (cebador directo 5'-GAACTACGGGCAGCTGGACATC'-3 'y el cebador inverso 5'-GCTCTCTGGGCCAGTCCTCCTG-3'), MUC4 (cebador directo 5 imprimación '-CGCGGTGG TGGAGGCGTTCTT-3' y revertir 5'-GAAGAATCCTGACAGCCTTCA-3 '), y el cebador directo β-actina (5'-TGGACATCCGCAAAGACCTG-3') y el cebador inverso (5'-CCGATCCACA CGGAGTACTT-3 ') (IDT Cor -. alville, IA, EE.UU.)
Análisis de Western-Blot
La proteína total fue extraído de las líneas celulares bca, resuelve y se analizó mediante inmunotransferencia según el protocolo estándar. En resumen, las células se lavaron dos veces con frío-PBS, rasparon en tampón RIPA (Tris 100 mM, EDTA 5 mM, 5% de NP40, pH 8,0) que contiene inhibidores de la proteasa de cóctel (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) y se dejó para lisar para al menos 30 min en hielo con agitación con vórtex intermitente. Las células se sometieron a lisis por más de un ciclo de congelación-descongelación y se centrifugaron a 14.000 g durante 30 min a 4 ° C. Los sobrenadantes se retiraron cuidadosamente y las concentraciones de proteína se determinaron mediante kit de estimación de proteínas Bio-Rad-DC. Para mucina inmunotransferencia, electroforesis se realizó en 2% de gel de SDS-agarosa usando cantidades iguales de muestras de proteína en condiciones reductoras. Para β-actina, SDS-PAGE (10%) se llevó a cabo bajo condiciones similares. Las proteínas se transfirieron a las membranas de PVDF y se sondaron con anti-MUC1 (1:05 diluido sobrenadante mAbHMFG2 en PBS) y MUC4 (1:1,000 dilución de mAb8G7) anticuerpos. Después de la incubación con rábano picante ratón anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (Amersham Biosciences Buckinghamshire, Reino Unido), se detectó la señal con un kit de reactivos electroquimioluminiscencia (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ).
Resultados
En este estudio, se analizó el perfil de expresión de mucinas transmembrana (MUC1 y MUC4) en secciones de tejido de carcinoma urotelial y tres tejidos TMA. Además, los niveles de expresión de estas mucinas se evaluaron en líneas celulares de carcinoma de vejiga.
Los análisis de expresión de MUC1 durante neoplasias malignas de vejiga
expresión de MUC1 en el urotelio de la vejiga no neoplásica.
la mayoría de los tejidos de la vejiga no neoplásicas puntos de TMA (16/27 o 59%) fueron negativos para la expresión de MUC1 (H puntuación = 0). Se observó tinción focal menor en algunos casos 4/27 (15%). En los puntos restantes, se observó positividad leve (7/27 media H-score 0,58 ± 0,29 en una escala de 0-3) (Fig. 1A). En general, se encontró media H-score de todos los casos juntos para ser 0,15 ± 0,1 (Tabla 1). En la mayoría de los casos, una tinción intensa MUC1 se restringió a las células paraguas con la tinción débil en las células resto del urotelio (Fig. 1A, punta de flecha). Sin embargo, en algunos casos, una tinción intensa MUC1 (4/27 o 15%) se observó capa superficial del urotelio (Fig. 1B, se representa por la flecha). En general, la tinción fue altamente intensa en las células paraguas superficiales que en las otras capas /células del urotelio. Un hallazgo similar se observó para las secciones de tejido recogidas en UNMC que reveló moderada a intensa tinción de MUC1 (N = 3, la intensidad media de 1,7 ± 0,58, significa H-puntuación de 1,7 ± 0,58) que fue restringida a las células de la capa o superficiales paraguas.
secciones o manchas de tejidos tumorales de vejiga se sondearon con anticuerpos anti-MUC1 mAB (HMFG2) tras bloqueo no específica con suero de caballo. Todas las secciones se examinaron bajo el microscopio y la inmunorreactividad se evaluó por tinción de color marrón rojizo. fotomicrografías representativas se muestran para MUC1 tiñeron urotelio de la vejiga no neoplásica (A & amp; B), el carcinoma papilar de bajo grado (C), carcinoma de vejiga in situ (D), y el cáncer invasivo de alto grado (E & amp; F). En urotelio normal de la vejiga, la expresión de MUC1 fue restringida a las células paraguas (marcadas con punta de flecha en el panel A y la inserción ampliada) en la mayoría de las muestras. En algunas muestras, se observó una vaina de mucina MUC1 sobre urotelio (flecha en 1B). En el carcinoma papilar de bajo grado, se observó una intensa tinción de MUC1 en la superficie luminal del urotelio y se observó menor intensidad de la tinción en las otras capas de urotelio (C). En el carcinoma urotelial in situ, se observó la expresión de MUC1 en todas las capas de urotelio, sin embargo, la tinción fue relativamente más fuerte en las células cerca de la frontera luminal (D). En el carcinoma urotelial de alto grado invasivo, se observó tinción de MUC1 en células invasoras por separado (E) o grupos pequeños como dentro de la lámina propia (F).
expresión de MUC1 en urotelial papilar no invasivo . el carcinoma urotelial y carcinoma in situ (CIS)
cánceres papilares son por lo general no invasiva (sólo & lt; 15% invaden la pared de la vejiga) y por lo tanto susceptibles de resección quirúrgica. Para MUC1, casos de carcinoma papilar se limitaron a las secciones de tejido por sí sola, ya que ningún punto de tejido en TMA correspondió a carcinoma papilar invasivo o no invasivo. Moderada a intensa tinción de MUC1 se observó tanto en bajo y alto grado carcinoma urotelial papilar de secciones de tejido (intensidad media de 2,9 ± 0,1 y la media de la puntuación H-2,1 ± 0,83 en una escala de 0-3, Fig. 1C). Se observó tinción intensa de MUC1 en la superficie luminal del epitelio de la vejiga en el carcinoma papilar urotelial de bajo grado. Intensidad de la tinción y el porcentaje de positividad aumentado de células en capas basales a las capas apicales del uroepitelio (Fig. 1C, se muestra por la flecha). Además, las células de la capa superficial mostraron tinción más intensa en comparación con las células por debajo de la capa uroepiteliales, lo que demuestra una célula no uniforme a patrón de tinción de células (Fig. 1C). En caso de carcinoma in situ, tinción intensa MUC1 (intensidad media de 2,9 ± 0,1 y la media de la puntuación H-2,48 ± 0,74) se observó (N = 10) en secciones de tejido (Fig. 1D).
expresión de MUC1 en el carcinoma urotelial primario y metastásico.
en los casos de carcinoma urotelial, MUC1 tinción varió de ninguna reactividad (N = 38 ó 12%), la reactividad focal (N = 12 o 4%, significa H-puntuación de 0,057 ± 0,01 ) a moderada (N = 147 o 46%, significa H-puntuación de 1,02 ± 0,05) y la intensa inmunorreactividad (N = 117 o 37%, con una media H-score de 2,86 ± 0,02) (Fig. 1E y 1F). En casos invasivos, se observó tinción de MUC1 en los focos (simple o nido de las células) presente dentro del núcleo papilar o en la lámina propia (Fig. 1E y 1F), la distribución de la MUC1 ser a la vez la membrana citoplasmática y.
MUC1 expresión se observó en el 66% (8/12) de las metástasis de un UC primaria a varios lugares
es decir
. pared abdominal, la espalda, los huesos, el cerebro y los ganglios linfáticos (Fig. 2E y F). En el caso de secciones de tejido metastásico (n = 28), se observó la expresión absoluta de MUC1 en todos los casos metastásicos con media H-score de 1,91 ± 0,15 y la media de intensidad de 2,72 ± 0,45. De acuerdo con estos resultados, no se observó expresión de MUC1 en la zona normal de los ganglios linfáticos, mientras que las células metastásicas en el ganglio linfático tienen reactividad positiva (Fig. 2E). La expresión de MUC1 observado puede clasificarse en tres diferentes patrones de tinción de la membrana luminal (en la capa de células sombrilla) solamente, además luminal tinción citoplasmática (en las capas intermedias y basales), o tinción de células sólo aislados o grupos de células.
fotomicrografías representativas mostrados para la tinción de MUC1 en el carcinoma de células escamosas (a), perlas de queratina (B), adenocarcinoma (C) adenocarcinoma mucinoso (D), la metástasis al hueso (E), carcinoma urotelial metastásico en los ganglios linfáticos (F). expresión membranosa fuerte de MUC1 se observó carcinoma de células escamosas (A) y también en perlas de queratina dentro de la carcinoma de células escamosas (B). Tanto adenocarcinoma mucinoso (C) y adenocarcinoma mostraron tinción débil (D) para MUC1. Fuerte expresión de MUC1 se observó en el carcinoma urotelial metastásico en el hueso (E) y de los ganglios linfáticos (F). Opinión de alto poder demostró que MUC1 se localiza en el citoplasma y la membrana tanto en las metástasis (en el recuadro de E & amp; F).
Como se ve en la Tabla 2, se observó diferencia significativa en la puntuación de H-tinción de MUC1 desde el grado 1 (0,51 ± 0,1) para tumores de grado 2 (1,62 ± 0,155). Además H-score para la tinción de MUC1 aumentó de grado 3 a 4 tumores de grado.
expresión de MUC1 en el carcinoma de células escamosas (SCC), adenocarcinoma mucinoso y adenocarcinoma de la vejiga.
Moderado que se observó una tinción intensa en SCC (N = 33, 65% de los casos) con la media H-puntuación de 2,33 ± 0,16 (Fig. 2A), mientras que otros mostraron positividad solamente suave para MUC1 (N = 18 ó 35%, con una media H -score 0,66 ± 0,11, la intensidad media de 1,3 ± 0,11). Se observó tinción moderada para MUC1 en perlas de queratina que son rasgo distintivo de grado 1 carcinoma de células escamosas (Fig. 2B, representado por la flecha). No hubo diferencia significativa en la intensidad de la tinción entre el grado 2 (N = 6, la media de puntuación de H-2 ± 0,3) y grado 3 SCC (N = 12, significa H-score 3.0 ± 0.7). De los 12 adenocarcinomas puntos que se examinaron, 7 mostraron debilidad de la tinción de MUC1 (Fig. 2C) mientras que en otros la expresión estaba completamente ausente. La mayoría de las manchas de tejido de adenocarcinoma mucinoso fueron ligeramente positivos para MUC1 (media H-score, 0,62 ± 0,14) (Fig. 2D).
Los análisis de expresión MUC4 durante Tumor maligno de la vejiga
MUC4 expresión en el urotelio de la vejiga no neoplásica.
Cuando se analizó en los tejidos normales (N = 14), se observó una alta expresión de MUC4 en urotelio de la vejiga no neoplásica (Fig. 3A, la intensidad media 2,54 ± 0,21 y significa H-puntuación de 2,54 ± 0,21) (Tabla 3). Se observó la expresión de MUC4 (en el urotelio de vejiga normal) tanto en la membrana y el citoplasma de las células del epitelio con la expresión más fuerte en las membranas celulares que citoplasma. Sin embargo, en contraste con MUC1, la tinción para MUC4 fue uniforme a través de todas las capas de urotelio (Fig. 3A). Curiosamente, se observó una fuerte expresión de MUC4 incluso en agregados invaginadas de células uroteliales conocidos como "nidos de Von Brunn" (Fig. 3B, se muestra por la flecha) guía.
secciones de tejido de tumor de vejiga y de microarrays de tejidos se sondaron con anti -MUC4 mAB (8G7) tras bloqueo no específica con suero de caballo. Todas las secciones se examinaron bajo el microscopio y la inmunorreactividad se evaluó por tinción de color marrón rojizo. fotomicrografías representativas se muestran para MUC4 manchado normal de urotelio no neoplásico (A), nidos de Von Brunn (B), no invasivo urotelial carcinoma papilar (C), carcinoma urotelial in situ (D), bajo (E) y el carcinoma urotelial de alto grado (F). positividad fuerte de MUC4 se observó en varios urotelio de la vejiga capa (A). imagen ampliada muestra que la distribución de MUC4 es a la vez la membrana citoplasmática. Las células en células de nidos de Von Brunn mostraron una fuerte tinción membranosa de MUC4 (B). Se observó pérdida de expresión MUC4 durante carcinoma papilar no invasivo (C), y carcinoma in situ (D). Tanto el carcinoma urotelial de bajo y alto grado mostró pérdida de la expresión MUC4 (E & amp; F)
MUC4 expresión en el carcinoma urotelial papilar no invasivo e invasivo y urotelial carcinoma in situ (CIS)..
a pesar de casos limitados (N = 6) de carcinoma papilar no invasivo estaban presentes en manchas de tejidos, la mayoría de ellos eran completamente negativos (N = 4, la intensidad puntuación 0), mientras que otros tienen positividad parcial (N = 2, la intensidad media-score 2.5). carcinoma papilar invasivo (N = 2) mostró una pérdida completa de expresión MUC4 (Intensidad-score = 0). Además, se observó la pérdida completa de la expresión MUC4 en ambos no invasiva (Fig. 3C) e invasivos casos de carcinoma papilar (N = 10, la media de la intensidad de 0,8 ± 0,41; media H-puntuación de 0,31 ± 0,39). MUC4 expresión fue significativamente downregulated en la CEI de TMA (N = 4, significa H-marcador en 0, el cuadro 3), así como en caso de cortes de tejido (N = 10; la intensidad media de 0,3 ± 0,1; p = 0,02 y la media de H-score 0,12 ± 0,06) en comparación con el urotelio no neoplásico (Fig. 3D). En general, se observó pérdida de la expresión MUC4 durante el carcinoma papilar invasivo y no invasivo.
MUC4 expresión en el carcinoma urotelial invasivo y metástasis.
En la mayoría de los casos, se observó la expresión focal de MUC4 en el carcinoma urotelial (N = 122 o el 58%, con una media H-score, intensidad media 0), mientras que otros casos mostraron positividad leve (N = 89 ó 42% de los casos, significa H-puntuación de 0,68 ± 0,14, la intensidad media de 0,91 ± 0,19). En general, se observó la pérdida de expresión MUC4 tanto en bajo y alto grado de carcinoma urotelial invasivo (Fig. 3E y 3F). expresión MUC4 fue significativamente baja regulado en células de carcinoma en comparación con el urotelio no neoplásico (media H-score en el urotelio de la vejiga no neoplásica y UC ser de 2,54 ± 0,21 [P & lt; 0,0001], y 0,47 ± 0,05, respectivamente) (datos de TMA). Curiosamente, en comparación con carcinoma urotelial que carece de la expresión de MUC4, mayor porcentaje de casos metastásicos se encontró que eran positivos para MUC4. Entre todos (n = 28) casos con metástasis, el 57% de los casos (N = 16) demostraron débil para tinción MUC4 leve (H media de puntuación de 1,27 ± 0,27) (Fig. 4D-F), mientras que no se observó ninguno de expresión focal en 43% de los casos (N = 12; la intensidad media = 0 y significa H-Score 0,025 ± 0,02). Ambos se observó tinción citoplásmica y la membrana de MUC4 en varios casos metastásicos (4D-F).
fotomicrografías representativas mostrados para la tinción MUC4 en el carcinoma de células escamosas (A), adenocarcinoma (B), adenocarcinoma mucinoso (C) y metástasis de carcinoma urotelial de nodo linfático (D & amp; e) y urotelial metastásico de pulmón carcinoma (F). casos de carcinoma de células escamosas mostraron una expresión moderada de MUC4 mientras MUC4 se encontró a estar ausente en el adenocarcinoma. se observó Focal a moderada expresión de MUC4 en el carcinoma urotelial metastásico a los diversos órganos. Opinión de alto poder mostró que el patrón de tinción es a la vez la membrana citoplasmática y durante la metástasis.
Como se ve en la Tabla 4, no se observó ninguna diferencia significativa en la puntuación de H-tinción MUC4 de grado 2 (0,66 ± 0,17) al grado 4 tumores (0,58 ± 0,19).
MUC4 expresión en el carcinoma de células escamosas (SCC) y adenocarcinoma de la vejiga.
de los 51 puntos de SCC que se examinaron (en el TMA), se observó positividad focal en 38% de los casos (N = 19, significa H-puntuación de 0,061 ± 0,009), positividad leve en 42% de los casos (n = 21, significa H-puntuación de 0,59 ± 0,09) y la reactividad intensa en 20 % de los casos (N = 10, significan H-puntuación de 2,24 ± 0,13) (Fig. 4A). Se observó tinción membranosa fuerte en la mayoría de las células con pocas células que muestran tinción citoplásmica. En los casos MUC4 positivos, todos los focos de SCC invasivo dentro de la lámina propia mostró tinción uniforme (Fig. 4A). No significativa correlación puede ser evaluada entre la expresión MUC4 y el grado del carcinoma de células escamosas debido a la información limitada sobre el grado del tumor de los casos. Aunque el número de secciones de tejido se limita para el adenocarcinoma (N = 8), no se observó o focal reactividad MUC4 (media de la puntuación de H-0,4 ± 0,22) (Fig. 4B). Del mismo modo, los adenocarcinomas mucinosos también fueron encontrados a negativo para la expresión MUC4 (Fig. 4C).
La expresión de MUC1 y MUC4 en carcinoma de vejiga Líneas Celulares
Tras el análisis de la expresión de mucinas en diversas patologías de la vejiga por inmunohistoquímica, la expresión de MUC1 y MUC4 se analizó en ARNm y los niveles de proteína en diferentes líneas celulares de carcinoma de vejiga (Fig. 5, panel a-C). El panel estuvo compuesto por cuatro líneas-T24 de células de carcinoma de vejiga, TCCSUP, HT1376 scaber. RT-PCR cuantitativa para MUC1 y MUC4 reveló que todas las líneas celulares excepto T24 expresan MUC1 y MUC4 (Fig 5A & amp;. B). estudios de inmunotransferencia utilizando el anticuerpo anti-MUC1 (HMFG2) y el anticuerpo anti-MUC4 (8G7) indican expresión diferencial de MUC1 y MUC4 en TCCSUP, HT1376 y líneas celulares scaber (Fig. 5C). No se observó expresión de MUC1 y MUC4 en línea celular de carcinoma de vejiga T24. Además, se observaron diferentes glicoformas de MUC4 en línea celular de carcinoma de células escamosas en comparación con líneas celulares de TCC.
análisis RT-PCR cuantitativa de MUC1 (A) y MUC4 (B) mostraron que toda la línea celular de carcinoma de vejiga, excepto T24 expresa MUC1 y MUC4. Se observó alta expresión de MUC1 y MUC4 tanto en la línea celular del tumor HT1376. Para los análisis de expresión de la mucina MUC1 y MUC4 a nivel de proteínas, los lisados de proteínas de todas las líneas celulares de carcinoma de vejiga se resolvieron en gel de agarosa al 2% y se sondaron con anti-MUC1 (HMFG2) y anti-MUC4 anticuerpos (8G7) (Panel C) . β-actina se resolvieron en 10% SDS-PAGE se utilizó como control de carga (Panel C). No se observó ninguna expresión de mucina MUC1 y MUC4 en T24 mientras que otras líneas celulares expresaron tanto las mucinas. (D) representaciones tabulares de la expresión de MUC1 y MUC4 durante la progresión de carcinoma de vejiga. No se observaron cambios significativos en la expresión de ambos MUC1 y MUC4 durante la progresión del carcinoma urotelial. Se observó un aumento progresivo en la expresión de MUC1 a través de varias etapas y grados del cáncer de vejiga mientras que la expresión de MUC4 disminuyó con la progresión de la enfermedad. En un subconjunto de casos de metástasis de carcinoma urotelial, se detectó la expresión de MUC4.
En general, mucina MUC1 y MUC4 análisis en TMA cáncer de vejiga y secciones de tejidos indicaron que la expresión de MUC1 se incrementa mientras que de MUC4 disminuido en UC en comparación con el urotelio no neoplásica normal. La expresión de MUC1 y MUC4 tanto, sin embargo, son significativamente mayores en los casos de metástasis de carcinoma urotelial en comparación con localizada UC (Fig. 5D).
Discusión
La expresión aberrante, la localización y la glicosilación de las mucinas son característicos eventos de múltiples tumores malignos (de páncreas, de ovario, de próstata y gástrico, de pulmón y de mama). Entre los diversos miembros de la familia, MUC1 y MUC4 están implicados en el crecimiento del tumor, la señalización intracelular y extracelular, interacciones tumor-estroma, metástasis y resistencia a los agentes quimioterapéuticos y en la inmunidad [10], [12]. información completa sobre la expresión de estas mucinas no se encuentra en el carcinoma urotelial. El presente estudio examinó la expresión de mucinas TM MUC1 y MUC4 en microarrays de tejido de la vejiga, secciones de tejidos y líneas celulares de carcinoma de vejiga. Mientras que se observaron cambios aberrantes en la expresión y localización de patrón de MUC1 entre los casos benignos y malignos, se observó la regulación por disminución significativa de MUC4 durante carcinoma urotelial en comparación con el normal y /o tejidos de la vejiga benignos.
MUC1 es una membrana
O
glicoproteína que se expresa a nivel basal en la mayoría de las células epiteliales [21]. La expresión desregulada de MUC1 es una característica prominente de diversos tipos de cáncer y enfermedades inflamatorias.