Extracto
Dado que la terapia individualizada es cada vez más importante en el tratamiento del cáncer de recto, una enfoque preciso y eficaz debe establecerse en los entornos clínicos para ayudar a los médicos a tomar sus decisiones. Las células tumorales circulantes (CTC), ya sea originado a partir de cáncer primario o metastásico, podrían proporcionar información importante para el diagnóstico y seguimiento del cáncer. Sin embargo, la implicación y el desarrollo de los CTC son limitadas debido a la extrema rareza de estas células tumorales. En este estudio se han fabricado un dispositivo de microfluidos simple y de alto rendimiento, que explotaba numerosos microcanales filtrados en él para enriquecer las células tumorales diana de gran tamaño de la sangre entera. Se obtuvo de este dispositivo en el caudal óptimo de 0,5 mL /h y el canal de altura de 5 m: Una eficiencia de captura CTC muy alta (94% de tasa de recuperación promedio). Además, hemos utilizado este dispositivo para detectar las CTC en 60 pacientes con cáncer de recto. Los recuentos de CTC de pacientes con cáncer rectal fueron significativamente más altos que los de los sujetos sanos. Además, los recuentos de CTC detectados por este dispositivo fueron significativamente mayores que los de método basado en perlas EpCAM para pacientes con cáncer rectal con varias etapas. Especialmente, para pacientes con cáncer rectal localizadas, las tasas de positivos de muestras con más de 3 CTC por 5 ml de sangre mediante el uso de microdispositivo vs. los basados en EpCAM eran 100% vs. 47%, respectivamente. Por lo tanto, este dispositivo proporciona una nueva y eficaz herramienta para la identificación y medición exactas de los CTC en pacientes con cáncer de recto, y tiene un amplio potencial en la práctica clínica
Visto:. Sun W, Jia C, Huang T, W Sheng , Li G, Zhang H, et al. Microdevice (2013) de Alto Rendimiento Tamaño-base para la detección de células tumorales circulantes de sangre periférica en pacientes de cáncer rectal. PLoS ONE 8 (9): e75865. doi: 10.1371 /journal.pone.0075865
Editor: Francisco X. real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), España |
Recibido: Abril 23, 2013; Aceptado: August 16, 2013; Publicado: 16 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Sun et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por algunos fondos de investigación científica de la siguiente manera: 1. Programa Nacional de investigación básica de China (973 Programa Nº 2012CB933303) 2. el Proyecto clínicos clave del Ministerio de Salud (2010-2012) 3. 3ª fase de Fudan Universidad de Radiación de investigación de Medicina "proyecto 985" (Grant No. 985III-YPT06) 4. La Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81101645, 61271162) 5. Shanghai Municipal Comisión de Ciencia y Tecnología (No.12nm0503702, 11JC1414400). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En los últimos años, la incidencia de cáncer rectal está aumentando drásticamente en todo el mundo [1]. A pesar de los recientes avances en las técnicas de diagnóstico y tratamiento, el resultado después del tratamiento sigue siendo pobre, principalmente debido a la aparición de las metástasis a distancia [2] - [4].
Las células tumorales circulantes (CTC), cobertizo de cualquiera cáncer primario o metastásico, se han identificado en la sangre periférica de los pacientes y con frecuencia están asociados con la recurrencia del cáncer y la metástasis [5] - [6]. En consecuencia, se esperaría que la detección de CTC para proporcionar una poderosa herramienta para el pronóstico del cáncer, el diagnóstico de la enfermedad residual mínima, la evaluación de la sensibilidad del tumor a los fármacos contra el cáncer, y la aplicación de un tratamiento individualizado [7].
Sin embargo , los intentos de estudiar las CTC están limitadas por su rareza, con concentraciones tan bajas como un CTC por billón de células hematológicas circulantes [8]. Por lo tanto CTC deben enriquecerse, aislado y debidamente identificados con el fin de ser clínicamente útil. Actualmente, uno de los métodos más comúnmente usados de detección de CTC se basa en el uso de anticuerpos conjugados con perlas magnéticas contra antígenos de superficie relacionados con tumores epiteliales tales como molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM) [9] - [10]. El CellSearch (Veridex, NJ, EE.UU.) sistema es un ejemplo típico usando el método basado en perlas magnéticas anti-EpCAM para detectar CTC y es el único sistema aprobado por la FDA de Estados Unidos para la utilización clínica en cáncer de mama metastásico, cáncer colorrectal y de próstata hasta ahora [ ,,,0],11]. Sin embargo, algunos datos sugieren que el antígeno epitelial podría perderse el CTC debido a la transición epitelio-mesenquimal (EMT), que se considera que es un evento crucial en el proceso de metástasis [12] - [13]. Este puede ser el principal problema que limita la aplicación amplia de método basado en la EpCAM en la práctica clínica.
Por otro lado, otro enfoque utilizado comúnmente para separar CTC de muestras de sangre se basa en las diferencias en el tamaño celular y la deformabilidad entre CTC y las células hematológicas. En general, los tamaños de las CTC van de 15 a 25 micras de diámetro, más grande que los de las células hematológicas (. El tamaño promedio de los eritrocitos y linfocitos de sangre periférica son 8 micras y 7-10 micras de diámetro, respectivamente) [14] - [ ,,,0],15]. ISET (Les Ulis, Francia), que enumera los CTC por filtración de la sangre a través de membranas de tipo-Etch Pista de policarbonato de 8 micras poros cilíndricos, es un representante con una comparativamente alta eficiencia de captura [16]. Sin embargo, los poros de filtros de policarbonato, que se fabrican por la pista de ataque químico, se colocan al azar con densidad no uniforme [17] - [18]. Recientemente, el desarrollo de la técnica de microfabricación ha permitido la introducción de enfoques de microfluidos para la captura de estas células raras, que puede compensar la debilidad de ISET [19] - [20]. El uso de una sola capa de la membrana de parileno-C microfiltros, Zheng S et al. [21] recuperaron 89,5% ± células humanas de cáncer de próstata 9,5% que fueron añadidos en sangre entera de donantes sanos. Además, Tan y Lim et al. [14] desarrollaron un dispositivo de microfluidos con múltiples conjuntos de pozos de forma de media luna y obtuvieron eficacias de captura superior al 80% para las líneas celulares de cáncer de mama y de colon. Además, Bhagat et al. [22] utilizado una rectangulares microcanales estampadas con una matriz de contracción-expansión y adquirió la mayor tasa de recuperación del 90% para las células de cáncer de mama humano MCF-7 de. Sin embargo, estos métodos sólo detectan las muestras con líneas celulares de cáncer se dispararon en sangre saludable, pero que carece de la verificación de las CTC en la sangre de los pacientes de cáncer, así como el posterior análisis de su aplicación clínica.
nuevas estrategias terapéuticas mejorar la eficacia contra la enfermedad metastásica y biomarcadores precisos para el seguimiento de los pacientes con cáncer rectal son los retos principales, junto con la detección precoz y el cribado en poblaciones de alto riesgo. En este estudio, se diseñó y fabricó un dispositivo de filtración de microfluidos para capturar estos CTC raras basados en las diferencias de tamaño entre las células tumorales y componentes de la sangre. En nuestro dispositivo, el flujo de sangre pasa a través de un sistema basado en micro-canales que permite el aislamiento de tamaño selectivo de las células tumorales raras, con muy alta eficiencia de captura y totalmente repetibilidad. Después de la tinción de inmunofluorescencia, las CTC se puede identificar y enumerar directamente bajo microscopio de fluorescencia a continuación. Nuestro dispositivo es una herramienta muy eficaz para la captura de CTC raras sin necesidad de aparatos grandes y caros. Los objetivos de este estudio fueron los siguientes: En primer lugar, medir y optimizar los parámetros de nuestro dispositivo de microfluidos con incremento células de cáncer colorrectal en muestras de sangre. En segundo lugar, hemos enumerado y analizado la eficiencia de la captura de CTC tanto en el modelo de células de pinchos y en muestras de sangre de pacientes con cáncer de recto. Por último, comparamos nuestro dispositivo con anticuerpos anti-EpCAM método basado en Immunobead conjugado.
Materiales y Métodos
Diseño y fabricación de dispositivos
Como se muestra en la Figura 1, el microfluidos dispositivo consiste en 80 canales principales y 81 canales laterales, que están dispuestas de una manera interdigital para minimizar la huella de chip. Un grupo de canales de filtro-paralelas dispuestas estrechos están diseñados para conectar cada par de canal principal y canal lateral adyacente. Ambos canales principales y los canales laterales tienen las secciones transversales de 50 micras de anchura y 50 m de altura, mientras que los de canales de filtro tienen anchuras de 20 micras y alturas que variaban de 2 micras a 8 micras. Para cada canal principal, el lado derecho está conectado directamente con la entrada de la muestra, y el lado izquierdo está enlazado a través de un canal de filtro a una cámara de residuos, con una serie de micro-mensajes que están diseñados para evitar el colapso de la cámara. Para cada canal lateral, el lado derecho es ciego y el de la izquierda está conectada directamente con cámara de residuos. Después de la muestra de sangre se carga en la entrada, una presión negativa se aplica a la salida, que aspira la muestra de sangre en los canales principales. Mientras tanto, debido a la diferencia de presión entre el canal principal y el canal lateral, la mayoría de los de pequeño tamaño células hematológicas en sangre completa, tales como eritrocitos y leucocitos se pueden filtrar en sus canales laterales adyacentes a través de canales de filtro y luego eliminado de la cámara de residuos. Las células de gran tamaño, tales como las células tumorales no pueden pasar a través de los canales del filtro estrechas y luego permanecer en los canales principales. Esta es la teoría del aislamiento de los CTC para este dispositivo
A) El esquema del dispositivo de microfluidos.; B) El esquema de la configuración de estación de trabajo para el aislamiento CTC; C) La estructura del dispositivo bajo el microscopio; D) El esquema que muestra la teoría del dispositivo en la vista vertical; E) El esquema que muestra la teoría del dispositivo en vista de perfil.
Nuestro dispositivo se fabricó por unión de una losa de polidimetilsiloxano híbrido (PDMS) que contiene tridimensionales micro-canales con un portaobjetos de vidrio. El dispositivo microfluídico se fabricó a través del proceso bien establecido multi-capa blanda litografía [23]. En pocas palabras, un maestro de dos niveles se preparó a partir de un negativo fotográfico resistir, SU-8 (Microchem, EE.UU.). Posteriormente, se desgasificó PDMS (mezclado en una relación 10:01 de la base de PDMS con agente de curado, Sylgard 184, Dow Corning Inc., EE.UU.) se echó sobre el molde maestro y coció a 90 ° C durante 1 h en un horno. Después del curado, la losa de PDMS se peló con cuidado del molde maestro. Una entrada y una salida fueron perforados a través de los PDMS utilizando una aguja con una punta aplanada. A continuación, la losa de PDMS se unió con un portaobjetos de vidrio después del tratamiento con plasma de oxígeno, y el proceso se describe como sigue: La unión plasma de oxígeno se realizó usando limpiador de plasma dedicado (PDC-32G-2, Harrick Plasma Corp., EE.UU.). El portaobjetos de vidrio y la losa de PDMS se colocaron en la cámara de limpiador de plasma durante 50 segundos. Después de eso, PDMS losa y portaobjetos de vidrio fueron sacados de la cámara, y el PDMS se colocó y se presionan en el cristal de inmediato.
Cultura y célula Spiking
La línea celular colorrectal humano HT- 29 que se obtuvo de banco de células de la American Type Culture Collection se cultivó en medio 5A de McCoy (Gibco, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal 10% (Gibco, Carlsbad, CA, EE.UU.). El cultivo celular se llevó a cabo en una incubadora a 37 ° C en 5% de CO
2. El medio de crecimiento se aspiró y las células se cosechan posteriormente usando 0,25% de tripsina. Inmediatamente antes de los experimentos, las células se enjuagaron con tampón de PBS y se resuspendieron. Siguiendo las instrucciones del fabricante, las células se trataron con soluciones de etiquetado celular Vybrant DiI (Carlsbad, Invitrogen, CA) durante 5 min a 37 ° C, después se aclara con tampón PBS y se resuspendió. La concentración de las células se determinó contando con un hemocitómetro. La concentración deseada de células se preparó diluyendo suspensiones de células en tampón de PBS. Las células marcadas con los números conocidos fueron añadidos en muestras de sangre para realizar otras mediciones.
Recolección y Procesamiento de Sangre
Las muestras de sangre de 60 pacientes con cáncer de recto se obtuvieron entre marzo y diciembre de 2012. Todos pacientes fueron confirmadas patológicamente como carcinoma rectal por biopsia o cirugía. De éstos, 30, 10 y 20 pacientes fueron confirmados como recién diagnosticado en estadio II-III, la recurrencia local y metástasis a distancia, respectivamente. Por todas estas 60 pacientes, se obtuvieron 10 muestras de sangre para la detección mL CTC, incluyendo 5 ml por dispositivo de microfluidos y 5 ml por el método basado en EpCAM.
Como grupo control, las muestras de sangre fueron también extraerse de 30 saludable voluntarios que no tenían la enfermedad conocida o fiebre en el momento del sorteo y sin antecedentes de enfermedad maligna.
Todas las muestras fueron extraídas en tubos de recogida de sangre que contenían EDTA evacuados, se almacena a 4 ° C y procesada dentro de las 72 h. Después de la centrifugación de la sangre periférica a 1500 rpm durante 10 min, las muestras de plasma se extrajeron cuidadosamente de la parte superior del sobrenadante. tampón de lisis de glóbulos rojos (M NH
4Cl, Tris 0,02 M, pH 7,2 0,139) se añadió a las muestras de sangre residual y se mezcló durante 45 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación a 1500 rpm durante 10 min, el sobrenadante se eliminó y el de células mononucleares de sangre periférica residual (PBMC) sedimento se resuspendió en tampón de PBS.
Configuración del instrumento
Antes de que el procesamiento de detección, las concentraciones de muestras de PBMC de pacientes con cáncer rectal (o muestras de donantes sanos con células HT-29 con púas) se midieron mediante un hemocitómetro y se diluyeron en tampón PBS como 5 × 10
7 células /mL. A continuación, los 0,5-0,6 ml diluyeron muestras de PBMC se introdujeron en el dispositivo mediante el bombeo. Una bomba de jeringa (PHD 22/2000, aparatos HAVARD, Massachusetts, EE.UU.) con una jeringa de 5 ml para la recogida de residuos se conectó a la salida del dispositivo. La entrada del dispositivo se conectó a las muestras de sangre a través de tubos de polímero. La bomba de jeringa se puso en marcha y la presión ajustada de acuerdo con el caudal requerido. Las muestras de sangre se bombea desde la entrada en el dispositivo de microfluidos para la captura de CTC y se recogieron los constituyentes hematológicos filtrados tales como los leucocitos en la cámara de residuos.
identificación y enumeración de CTC por microscopía de fluorescencia
después de que el proceso de captura de CTC, se identificaron las células tumorales y se distinguen de los leucocitos sobre la base de la expresión del antígeno morfología y diferencial. Las células tumorales son epiteliales (citoqueratina + /CD45- /DAPI +), mientras que los leucocitos son no epitelial (cytokeratin- /CD45 + /+ DAPI). reactivos fluorescentes se bombearon en el dispositivo y la reacción de inmunofluorescencia se realizó directamente en los canales del dispositivo. En primer lugar, los anticuerpos para CD45 conjugados con FITC (BD Biosciences, EE.UU.) se introducen en el dispositivo, seguido de incubación durante 30 min a 0 ° C. Posteriormente, una solución de 0,2% de Triton X-100 y anticuerpos frente a citoqueratina conjugado con ficoeritrina (C-11, Abcam, UK) se bombearon en el dispositivo y se incubaron durante 10 min y 1 h, respectivamente. Luego, las células capturadas se mezclaron con una solución de DAPI durante 20 min. Finalmente, las células se fijaron capturados por una solución de 1% de paraformaldehído durante 20 min. Después de estas reacciones, el dispositivo se lavó con 1 ml de PBS para eliminar el exceso de reactivos. Se identificaron células capturadas y cuentan usando microscopía de fluorescencia (Olympus America). CTC se identificaron de acuerdo con el color de teñido y las características morfológicas tales como el tamaño celular, la forma y el tamaño nuclear. Las células que se tiñeron citoqueratina + /CD45- /DAPI + y cumplieron con las características morfológicas fenotípicas se anotó como CTC. Un patólogo experimentado que era ciego a los resultados clínicos evaluados exhaustivamente cada muestra de sangre para la identificación de CTC.
Detección CTC con sede en EpCAM Método
La eficiencia de la captura de los CTC se midió también con sede en EpCAM Método. método detallado se describe como sigue: La separación de las CTC se realizó mediante el uso de perlas inmunomagnéticas recubiertas con anticuerpos epiteliales de células específicas de EpCAM (perla magnética: 4,5 m de diámetro; DYNAL, Invitrogen, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. El sedimento de PBMC se resuspendió en tampón PBS y se mezcló con perlas inmunomagnéticas. La mezcla de células-perlas se incubó durante 40 min a 2-8 ° C con inclinación suave y rotación. La mezcla se colocó en un magnética durante 5 min y el sobrenadante se retiró cuidadosamente. Posteriormente, se añadieron anticuerpos a CD45 conjugados con FITC (BD Biosciences, EE.UU.) y se mezclaron con células capturadas durante 30 minutos a 0 ° C. Luego, las células se lavaron con una solución de 0,2% de Triton X-100 durante 10 minutos y se mezclaron con anticuerpos contra citoqueratina conjugados con ficoeritrina (C-11, Abcam, UK) durante 1 h. Después de eso, las células capturadas se mezclaron con una solución de DAPI durante 20 min. Por último, las células se fijaron con una solución de 1% de paraformaldehído durante 20 min. Después de cada paso de procesamiento, las células capturadas se lavaron por tampón PBS para eliminar el exceso de reactivos en una magnético. El método de identificación y recuento de CTC fue similar a la de dispositivo de microfluidos, de acuerdo con el color teñido y características morfológicas tales como el tamaño celular, forma y tamaño nuclear. Las células que se tiñeron citoqueratina + /CD45- /DAPI + y cumplieron con las características morfológicas fenotípicas se anotó como CTC. Un patólogo experimentado que era ciego a los resultados clínicos evaluados exhaustivamente cada muestra de sangre para la identificación de CTC.
Declaración de Ética
Se realizaron todos los procedimientos de inscripción en cumplimiento con las leyes y directrices institucionales y relevancia institucional comité (Comité de Ética de la Universidad Fudan de Shanghai Centro de cáncer) aprobó nuestra investigación. Todos los pacientes y voluntarios sanos firmaron el consentimiento informado por escrito antes de la inscripción.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS (versión 16.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Todos los resultados se expresaron como media ± desviación estándar (DE). eficiencia de captura se calculó dividiendo el número de las células diana capturados por el número de células diana totales introducidos en el dispositivo. La pureza de células capturadas se determinó dividiendo el número de las células diana capturados por el número de las células totales capturado. Se realizó un análisis de regresión para evaluar la exactitud de la detección de células tumorales. Una prueba de Mann-Whitney y Kruskal-Wallis H se utilizaron en los casos de 2 muestras independientes y más de 2 muestras, respectivamente, mientras que las comparaciones de las mediciones vinculadas se ha realizado mediante un test de Wilcoxon. Rango de correlación de Spearman se utilizó para analizar la correlación de la tasa de captura entre el dispositivo de microfluidos y el método basado en EpCAM. Todas las pruebas fueron de dos caras y se realizaron a un nivel del 5% de significancia.
Resultados y Discusión
El efecto de canal de altura y el caudal de CTC eficiencia de captura
con el fin de optimizar los parámetros experimentales de este dispositivo, de pinchos células HT-29 con un número conocido en muestras de sangre de donantes sanos para medir la eficiencia de la captura y la pureza celular.
en primer lugar, se investigaron los efectos del canal de filtro altura en la eficiencia de captura y la pureza de la célula. Como se muestra en la Figura 2a, la eficiencia de la captura de CTC con altura del canal 8 micras era obviamente más baja que con 2 micras y 5 micras de altura, mientras que es similar mayor eficiencia de captura del 98% se observó para 2 micras y 5 micras. Además, la pureza de células mejoró gradualmente con el aumento de la altura del canal, como se demuestra en la Figura 2b. Por lo tanto, sobre la base de los datos en la Figura 2a y 2b, se optó por una altura de 5 m como el mejor compromiso entre la eficiencia de la captura y la pureza de la célula. Estos resultados indican que existe una estrecha relación entre el tamaño de la cavidad de filtro y la eficiencia de la captura de CTC, y algunos otros estudios también a conclusiones similares: Hosokawa M. et al. [24] utilizado una matriz de microcavidad de tamaño selectivo para aislar CTC y su eficiencia de captura presentó una tendencia a la baja con el aumento de tamaño de la microcavidad. Sheng W. et al. [25] fabricado un microdispositivo aptámero habilitados y también se indica que la eficiencia de la captura de los CTC descendería gradualmente, pero la pureza tenido una tendencia al alza cuando la profundidad del canal aumentó.
A) La relación entre la altura del canal y la eficiencia de la captura : la eficiencia de captura se calculó dividiendo el número de las células diana capturados por el número de las células diana introducidas en el dispositivo. B) La relación entre la altura del canal y la pureza de células: La pureza de células capturadas se determinó dividiendo el número de las células diana capturados por el número del total de células capturadas. El caudal fue de 0,5 ml /h para A) y B). C) La relación entre la velocidad de flujo y la eficiencia de captura: La eficiencia de captura se calculó dividiendo el número de las células diana capturados por el número de las células diana introducidas en el dispositivo. La altura del canal era 0,5 micras. Las barras de error representan una desviación estándar de 4 experimentos repetidos. D) La recuperación de un número conocido de HT-29 con púas células de la sangre entera. El análisis de regresión observada del número de células tumorales frente al número de células tumorales se esperaba produjo una pendiente de 0,986 y un coeficiente de correlación (R
2) de 1.
Por otro lado, también se investigó la relación entre el caudal y la eficiencia de captura de CTC. Como se muestra en la Figura 2c, en la velocidad de flujo que van desde 0,2 y 0,5 ml /h, la eficiencia de la captura no cambió obviamente. Pero a partir de la tasa por encima de 0,5 ml /h, la eficiencia de la captura disminuyó de forma espectacular. La eficiencia de captura se reduce con el aumento de la velocidad de flujo presumiblemente a causa de una presión más grande a un caudal más alto. Algunos otros estudios [24] - [26] también señalaron que la eficiencia de la captura de células fue inversamente proporcional a la velocidad de flujo de sangre. Por lo tanto, teniendo en cuenta el tiempo de procesamiento de las muestras por bombeo en el dispositivo y la eficiencia de la captura, se optó por 0,5 ml /h como el mejor parámetro para la detección, en el que se pudo observar la tasa de capacidad de carga suficiente.
Por lo tanto, hemos utilizado la altura del canal óptimo de 5 micras y la velocidad de 0,5 ml /h de flujo para la detección de CTC, y se utilizaron estas condiciones experimentales para todos los experimentos posteriores.
recuperación de la detección de tumores de la célula
para determinar la sensibilidad de la detección de células tumorales, células HT-29 en diferentes números conocidos, se enriquecieron en 5 ml de muestras de sangre de cada donante sano. El número de células enriquecidas fueron 5, 9, 51, 102, 500 y 998 respectivamente. Figura 2d muestra el número esperado de células HT-29 con púas en el donante sano muestras representan frente el número real de células HT-29 observados en las muestras. El análisis de regresión de las células tumorales observada número frente al número de células tumorales esperado produce una pendiente de 0,986 y un coeficiente de correlación (R
2) de 1. El porcentaje medio de HT-29 recuperado fue 94 las tasas de recuperación a varias concentraciones celulares% y estaban todos por encima de 80% (Tabla 1, Tabla S1). También se validó las tasas de recuperación de líneas celulares de cáncer de pulmón incluyendo tres A549, SK-MES-1 y H446, todos los cuales fueron superiores a 90% (datos no mostrados).
Detección de CTC rectal Los pacientes de cáncer con diversas etapas
fueron detectadas y analizadas en cada sangre total 5 ml El recuento de CTC de 60 pacientes con cáncer rectal con diferentes etapas y 30 sujetos sanos. La Figura 3 demuestra la CTC capturada de un paciente típico con cáncer de recto en el dispositivo de microfluidos
A /B: CTC tinción;. C /D: tinción de las células sanguíneas normales. A) tinción positiva CK en los CTC; B) tinción DAPI positivo en CTC; C) la tinción de CD45 positiva en las células normales de la sangre; D) DAPI positivo en las células sanguíneas normales.
Tal como se demuestra en la Figura 4, las células positivas podrían ser observada en 3 de cada 30 personas sanas, pero ninguno de ellos tenía más de 3 células positivas por muestra . Estos resultados fueron similares con los de estudios anteriores que indica que se han detectado hasta tres CTC en una pequeña población de donantes sanos o pacientes no malignas [27] - [28]. La razón de estos resultados "falsos positivos" se desconoce todavía, pero presumiblemente debido a varias razones como sigue: (a) la contaminación de las células epiteliales en muestras de sangre debido a algún tipo de procesamiento incorrecto como el muestreo de sangre inadecuado; (B) El juicio inexacto en la identificación de los CTC por los investigadores; (C) presencia de células hematológicas aberrantes que expresan el antígeno epitelial en muestras de sangre; (D) los pacientes con cáncer potenciales que no pueden ser diagnosticadas a tiempo mediante técnicas clínicas rutinarias
.
El diagrama de caja demuestra la mediana, cuartiles inferior y superior (percentiles 25, 75). Los puntos de datos que fuera de los percentiles 10 y 90 se muestran como valores atípicos.
Aunque los marcadores tumorales tales como CEA en suero son ampliamente utilizados para el diagnóstico y seguimiento de pacientes con cáncer gastrointestinal, su falta de sensibilidad sigue sin resolverse. técnicas de imagen convencionales y los marcadores tumorales son a veces inexacta para el diagnóstico y seguimiento de las respuestas de la terapia del cáncer, lo que resulta en un retraso en la progresión de la enfermedad a juzgar antes de tiempo. En este estudio, las CTC podría ser detectada en todos los 60 pacientes con cáncer rectal cuyos recuentos de CTC estaban todos por encima de 3 células por muestra. Los recuentos de CTC de pacientes con cáncer rectal fueron significativamente más altos que los de los sujetos sanos (167.33 ± 212.76 vs. 0,17 ± 0,59, P & lt; 0,05). Además, los pacientes con metástasis a distancia tenían niveles significativamente más altos de CTC que los pacientes con estadio II-III o aquellos con recidiva local (385,30 ± 245,86 vs 39,40 ± 19,23 frente a 115,20 ± 69,15, P & lt; 0,05). Además, los recuentos de CTC de pacientes recurrentes locales también fueron significativamente más altos que los de la etapa II-III (P & lt; 0,05). Estos resultados indicaron que la cantidad CTC correlaciona razonablemente bien con la carga tumoral y la gravedad de los pacientes con diferentes etapas. Por lo tanto, CTC podría ser un prometedor biomarcador para compensar la insuficiencia de modalidades de detección clínicos convencionales. Sastre et al. [29] demostraron una estrecha relación entre los recuentos de CTC y diferentes etapas clínicas para pacientes con cáncer colorrectal, que era similar a nuestros resultados. Cohen et al. [30] indicó que el CTC cuenta antes del tratamiento y en los puntos de tiempo posteriores fueron factores pronósticos independientes para la supervivencia libre de progresión y la supervivencia global. Allen-Mersh et al. [31] demostraron que la CTC cuenta dentro de 24 horas después de la resección primaria del cáncer colorrectal es un fuerte predictor de recurrencia del cáncer colorrectal. La detección de CTC también se podría aplicar en la terapia génica dirigida. Yen et al. [32] encontró que la detección del estado mutacional de KRAS en CTC tenía potencial para la aplicación clínica en la selección de pacientes con cáncer colorrectal metastásico con más probabilidades de beneficiarse del tratamiento con cetuximab. Por lo tanto, la detección de CTC puede tener una aplicación de gran variedad en los entornos clínicos tales como el diagnóstico de enfermedades de cáncer, el seguimiento de la respuesta al tratamiento, la evaluación pronóstico e incluso la toma de decisiones de la terapia individualizada. Otros análisis incluyendo el papel de las CTC en la predicción y evaluación de la supervivencia a largo plazo los pacientes con cáncer usando nuestro dispositivo de microfluidos se llevará a cabo en un futuro próximo.
Comparación de microfluidos dispositivo vs. basada en EpCAM Método
anti-EpCAM método basado en perlas magnéticas es actualmente una de las tecnologías más utilizadas para la detección de CTC [9] - [10]. Por lo tanto, se compararon los resultados de nuestra microdispositivo para la enumeración de las células tumorales contra el método de enriquecimiento basado en EpCAM. En primer lugar, células HT-29 con números conocidos se enriquecieron en muestras de sangre de donantes sanos, y a continuación, cada muestra se dividió en dos duplicados, uno para nuestro dispositivo y otro para el método basado en EpCAM. Las tasas de recuperación de estos dos métodos fueron comparados y analizados. Como se muestra en la Tabla 1, las tasas de recuperación de las células tumorales utilizando este microdispositivo estaban todos por encima de 80% en cada concentración de las células tumorales, mientras que las tasas de recuperación de método basado en EpCAM eran comparativamente más bajos, que van desde 36% a 81% (P & lt; 0,05). Además, no se encontró correlación significativa entre la tasa de recuperación del dispositivo de microfluidos y la del método basado en EpCAM (Correlación eficiente fue de 0,07; p & gt;. 0,05). Posteriormente, también comparó el rendimiento de estos dos métodos que utilizan muestras de sangre de los pacientes y los resultados se demuestra en la Tabla 2. Se recogieron y procesaron las muestras de sangre de 60 pacientes con cáncer de recto, y cada muestra se dividió en dos piezas para las células tumorales detección utilizando estos dos métodos (Tabla S2). Para los pacientes con cáncer rectal con diferentes etapas, los recuentos de CTC detectadas por microdispositivo fueron significativamente más altos que los de método basado en EpCAM (P & lt; 0,05). El número de CTC aislados varió de 0 a 100 versus 0 al 12 (microdispositivo vs. basada en EpCAM) por muestra para los pacientes con estadio II-III (media ± SD, 39 ± 19 vs. 4 ± 3), 4-210 vs . 3 al 31 para los pacientes recurrentes (115 ± 69 vs 12 ± 9) y 47 a la 980 vs 5 a 55 para los pacientes metastásicos (385 ± 246 frente a 24 ± 15). Para el método basado en EpCAM, el CTC cuenta de 38 (63%) de los pacientes varió de 0 a 10, mientras que en sólo un paciente (2%) son más de 50. Por el contrario, para el microdispositivo, los recuentos de CTC de 3 (5 %) pacientes varió de 0 a 10, mientras que los de 34 (57%) pacientes eran más de 50. La diferencia entre estos dos métodos fue especialmente evidente para los 30 pacientes con cáncer de recto en estadio II-III: Las tasas positivas de muestras con más de 3 CTC por cada 5 ml de sangre por el uso del microdispositivo fueron del 100% (30/30), mientras que sólo el 47% (14/30) muestras positivas podrían ser observados por método basado en EpCAM.
EpCAM- método basado perla magnética es actualmente uno de los métodos más frecuentes para el aislamiento de los CTC. Sin embargo, este método depende de la expresión de EpCAM en las células tumorales diana. Aunque el antígeno EpCAM se puede encontrar en la mayoría de los tumores epiteliales, expresión EpCAM débil o negativo se ha indicado, lo que probablemente se asocia con el fenómeno de la EMT [33] - [34]. Muchos factores tales como la quimioterapia probablemente pueden inducir EMT, que puede afectar la eficiencia de la captura de las células tumorales. En nuestro estudio, a fin de minimizar la influencia de la EMT, se utilizó un método basado en el tamaño de detectar las CTC en lugar de uno EpCAM-dependiente. Por lo tanto, en teoría, más células tumorales incluyendo las tanto EpCAM-expresión positivos y negativos pueden ser capturados por nuestro microdispositivo basada en tamaño. Esta hipótesis está de acuerdo con nuestros resultados anteriores: no sólo en las muestras con células tumorales con púas en sangre saludable, más CTC se aislaron por nuestra microdispositivo, pero los resultados similares fueron validados en muestras de pacientes con cáncer rectal también. Otros estudios anteriores [35] - [36]., Que comparó método basado en EpCAM basada en tamaño y, informó hallazgos similares y demostró que una proporción de las células aisladas por enfoque basado en el tamaño carecía de características epiteliales
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