Extracto
amplificación genómica de 19q12 se produce en varios tipos de cáncer incluyendo el cáncer de ovario donde se encuentra asociado con fracaso del tratamiento primario. Nos atenuados de forma sistemática la expresión de los genes dentro de la región 19q12 mínimamente definido en líneas celulares de ovario usando RNAs cortos de interferencia (siRNA) para identificar el oncogén (s) de conductor dentro del amplicón. Desmontables de
CCNE1
resultó en G1 /S fase de la detención, la viabilidad celular y la apoptosis reducida sólo en las células portadoras de amplificación. Aunque
CCNE1
una mayor caída en la resistencia a cisplatino en ensayos a corto plazo, la supervivencia clonogénico se inhibió después del tratamiento. Ganancia de 20q11 fue altamente correlacionado con 19q12 amplificación y abarcó una región de 2,5 Mb incluyendo
TPX2
, una proteína centromérica necesario para la función del huso mitótico. La expresión de
TPX2
fue altamente correlacionado con la amplificación génica y con
CCNE1
expresión en tumores primarios. inhibición de siRNA
TPX2
viabilidad reducida de células, pero este efecto no fue dependiente de amplicón. Estos hallazgos demuestran que
CCNE1
es un factor clave en el 19q12 amplificación necesaria para la supervivencia y clonogenicidad en las células con amplificación del locus. Co-amplificación en 19q12 y 20q11 implica la presencia de una red mutacional cooperativa. Estas observaciones tienen implicaciones para la aplicación de terapias dirigidas en
CCNE1
cánceres de ovario dependientes
Visto:. Etemadmoghadam D, George J, Colin PA, Cullinane C, Kansara M, de ovario Cancer Study Group de Australia , et al. (2010) amplicón dependiente de
CCNE1
expresión es crítica para la supervivencia Clonigénicas después de tratamiento con cisplatino y se correlaciona con 20q11 ganancia del cáncer de ovario. PLoS ONE 5 (11): e15498. doi: 10.1371 /journal.pone.0015498
Editor: Nathalie Wong, de la Universidad China de Hong Kong, China
Recibido: 31 Agosto, 2010; Aceptado: 17 de octubre de 2010; Publicado: 12 Noviembre 2010
Derechos de Autor © 2010 Etemadmoghadam et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por una Salud y medicina Consejo Superior de Investigaciones Científicas (NHMRC) proyecto de subvención 628.779 (www.nhmrc.gov.au). El estudio del cáncer de ovario australiana es apoyado por el Comando de Investigación Médica del Ejército de Material de Estados Unidos bajo DAMD17-01-1-0729, el Consejo de Cáncer de Victoria, Queensland Cancer Fund, el Consejo de Cáncer de Nueva Gales del Sur, el Consejo de Cáncer de Australia del Sur, la Fundación para el Cáncer de Australia occidental, el Consejo de cáncer de Tasmania y el NHMRC. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
fase avanzada tumores serosos representan la mayoría de los cánceres ováricos invasivos ya pesar de un general buena respuesta inicial a la cirugía citorreductora y quimioterapia basada en platino, la mayoría de las mujeres se enfrentan a un alto riesgo de recurrencia y pobre supervivencia a largo plazo [1 ]. Los agentes basados en platino, tales como cisplatino y carboplatino, son tóxicos para las células en división, debido a la formación de aductos de ADN que dan lugar a roturas de doble cadena, la activación de señales apoptóticas mediadas por daño en el ADN [2]. Respuesta a la quimioterapia es, sin embargo, difícil de predecir y actualmente no hay biomarcadores predictivos para los cánceres de ovario seroso en el uso clínico. Hemos mapeado previamente una región de 19q12 amplificación asociada a tumores ováricos serosos resistentes al tratamiento mediante la realización de un estudio de todo el genoma de los cambios de número de copias [3]. Estos resultados fueron consistentes con los informes anteriores de la amplificación que se encuentra asociado con la supervivencia global pobres [4], [5]. Del mismo modo, la amplificación de 19q12 recurrente ha informado en una variedad de cánceres como el de esófago [6], gástrico [7], pulmón [8] y tumores de endometrio [9].
La amplificación 19q12 es un nivel alto amplificación focal que se dirige a un grupo de sólo varios genes en el cromosoma 19.
CCNE1
(ciclina E) previamente se ha sugerido como el objetivo de la amplificación en el cáncer [4] de ovario, [10], [11], sin embargo un análisis sistemático de genes conocidos dentro del amplicón no se ha realizado. Además, mientras que
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amplificación probable proporciona un estímulo oncogénico través de la activación del ciclo celular, no es evidente la forma en que puede contribuir a la resistencia a la quimioterapia primaria. Por ejemplo, la sobre expresión de
CCNE1 in vitro
hace que las células de cáncer de ovario más sensibles a agentes de platino, presumiblemente debido a aumento de la proliferación [12]. Es posible que la consecuencia biológica de 19q12 amplificación no se limita a la sobre expresión de
CCNE1
, y que otros genes en el amplicón contribuye al crecimiento del tumor o la progresión. Por otra parte, otro co-existente eventos de mutación en el genoma del cáncer en otras partes pueden cooperar o aumentar el efecto oncogénico de
CCNE1
sobre-expresión.
Se realizó una pantalla de siRNA desmontables de todos los genes anotados dentro y inmediatamente flanquean el amplicón 19q12 en líneas celulares de cáncer de ovario con o sin amplificación regional. Encontramos
CCNE1
ser el único objetivo de genes dentro del amplicón que redujo la viabilidad celular en la línea celular OVCAR-3 que contiene amplicón después de siRNA desmontables.
CCNE1
caída inducida por la detención del ciclo celular y la apoptosis, mientras que también perjudicar la supervivencia clonogénico después del tratamiento con cisplatino, a pesar del aumento
in vitro
resistencia a los medicamentos en un ensayo de citotoxicidad a corto plazo. En un entorno de enfermedad, estos resultados sugieren que el fracaso del tratamiento in
CCNE1
tumores amplificados puede referirse a la rápida repoblación del tumor después de la quimioterapia y la resistencia a los medicamentos no celular específicamente. También encontramos
TPX2
amplificación y sobreexpresión estar correlacionado significativamente con el
CCNE1
de estado del número de copias que implica la presencia de una red mutacional de cooperación entre estos genes.
Resultados
amplificación de 19q12 focal es común a varios tipos de tumores
en primer lugar, trató de comparar la región mínima de la ganancia cromosómica 19q12 a través de múltiples tipos de tumores. Se obtuvieron datos de los estudios de número de copias de alta resolución basados en SNP incluyendo 15 tipos de tumores [9], [13] para una comparación con nuestros resultados [3] (Figura 1A). regiones mínimas selectivos de amplificación fueron definidos por logís-, una herramienta de análisis que evalúa la significación estadística de eventos número de copias basado en frecuencia y amplitud [14]. amplificación significativa de 19q12 estaba presente en un tercio de los tipos de cáncer analizadas. De los tipos de tumores con amplificación 19q12, aproximadamente el 25% de las muestras individuales mostró aumento de número de copias, con excepción de los tumores endometriales que se observó una frecuencia más alta (~ 45%) [9]. Se encontraron los límites mínimos de amplicón para apuntar a una región de menos de 2 Mb de tamaño, centrado a aproximadamente a 35,0 Mb en el cromosoma 19. En ambos conjuntos de datos analizados de tumor de ovario [3], [13] la región asignada mínima de ganancia incorporan los mismos cinco genes (
POP4
,
PLEKHF1
,
C19orf12, CCNE1 y C19orf2
), con zonas de solapamiento similares detectados en los tumores de endometrio y de mama. Por el contrario, la región mínima asignada en tumores de pulmón de células no pequeñas constituidas solamente
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mientras que una amplia región que fue asignada en los tumores esofágicos (~9.5 Mb), que abarca a 110 genes anotados. Copiar el cambio de número de la 19q12 locus mostró un grado de especificidad tumoral, en el que la amplificación no se observó en otros 10 tipos de tumores para los cuales se dispone de datos sustanciales, incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, hepatocelular, cáncer colorrectal y de próstata (datos no mostrados). También observamos que la amplificación de 19q12 ha sido identificado por análisis de cDNA array-CGH de los tumores gástricos [15], [16], sin embargo, no se incluyó este tipo de tumor que nuestro análisis se limita a los datos del número de copias de SNP de alta resolución.
(A) regiones de pico de amplificación entre 30-46 Mb en el cromosoma 19 en
a pequeña 1non celular [8], [13], [40], [41], [42];
2ovarian [3],
3 [13];
4endometrial [9];
5breast [13], [43], [44]; y
6esophageal tumores [42]. Frecuencia de ocurrencia y genes presentes dentro de los límites máximos indicados. (B) Affymetrix SNP 6,0 mapeo número de copias microarray del cromosoma 19 en líneas celulares de tumor de ovario y (C) entre 34 a 36 Mb de SK-OV-3 líneas de células OVCAR-3 y. el número de copias que se muestra es la ventana de promedio móvil de 20 marcadores mapeados a marzo Humano 2006 (hg18) del genoma de montaje (fuente: Sanger del Genoma del Cáncer archivo del proyecto). (D) La expresión de genes determinados por qPCR en las células OVCAR-3 en relación con SK-OV-3.
Para identificar las líneas celulares que eran representativas de los tumores primarios para estudios funcionales que analizamos de alta resolución de copia de SNP datos de números de 22 líneas celulares de cáncer de ovario en el cromosoma 19q12 (Sanger del Genoma del cáncer del archivo de proyecto) e identificaron siete líneas celulares (OVCAR-3, OVCAR-4, Kuramochi, RMG-I, Caov-4, EFO-21, OVCAR-8) que tenían la amplificación de solapamiento en 19q12 (Figura 1B y Figura S1). De las siete líneas celulares, OVCAR-3 contenía una amplificación focal, de alto nivel que mejor se recapitula los datos de los tumores primarios de ovario (Figura 1C). PCR cuantitativa (qPCR) demostró que los cinco genes dentro de la región de la amplificación de alto nivel en OVCAR-3 (
POP4
,
PLEKHF1
,
C19orf12
,
CCNE1 y C19orf2
), pero no genes de acompañamiento (
UQCRFS1
y
ZNF536
), se sobre-expresado en relación con el control de línea celular SK-OV-3 que carecen de 19q12 amplificación ( Figura 1D). De los cinco genes,
PLEKHF1
y
CCNE1
mostraron la más alta expresión. Por consiguiente, el amplicón 19q12 se puede asignar a una región que abarca 34,4-35,4 del cromosoma 19 y la participación de 5 genes anotados, cada uno de los cuales es sobre-expresado en células OVCAR-3.
líneas de células con amplificación de 19q12 son especialmente sensibles a
CCNE1
knockdown
ARN corto de interferencia (siRNA) se utilizaron para knockdown de la expresión de los siete genes en y adyacente a la amplificación de alto nivel 19q12 en OVCAR-3 y SK-OV 3 más
controles no silenciamiento (NS) y GAPDH
. Un esquema del diseño experimental utilizado para la estrategia de siRNA desmontables combinados y posterior protocolo de tratamiento de drogas se muestra en la Figura 2A. niveles de transcripción de todos los genes específicos fueron de manera eficiente y específicamente reducen hasta 96 horas después de siRNA transfección, con la excepción de
ZNF536
, que flanqueaba la región de amplificación (Figura 2B). Por interrogar a los datos obtenidos de un estudio anterior [17] encontramos
ZNF536
expresión sea baja o ausente en los tumores de ovario seroso primarios, lo que puede explicar una reducción observable en la expresión de genes (datos no mostrados). La expresión génica también se monitorizó en presencia de cisplatino, en la preparación para los experimentos funcionales.
PLEKHF1
,
CCNE1
,
C19orf2
y
ZNF536
fueron ligeramente hasta reguladas por el tratamiento con cisplatino en líneas celulares de uno o ambos siRNA desmontables sin embargo seguía siendo (Figura 2B).
(a) esquema experimental eficaz para la transfección de siRNA combinado y tratamiento de drogas. (B) qPCR mapa de calor muestra de registro
ratio de expresión 2 gen a las células SK-OV-3 (abajo) no transfectadas OVCAR-3 (arriba) y para cada siRNA (columnas) a objetivos de genes (filas) con o sin tratamiento con cisplatino 72 horas después de la transfección. viabilidad (C) de la célula normalizó a las células de control no siRNA después de la transfección con cada siRNA. La significación estadística (prueba t) calculado por comparación con la no silenciamiento (NS) siRNA en la misma línea celular utilizando los datos de tres ensayos independientes realizados MTS con tres pozos por condición. absorbancia media normalizada a 490 nm y SEM representa (n = 3), ** p-valor & lt; 0,01. (D) La proporción de células apoptóticas evaluados por la tinción de TUNEL en las células de control no siRNA o después de la transfección con NS o
CCNE1
dirigido siRNA. Los datos mostrados a partir de tres experimentos independientes con pocillos duplicados analizaron por condición. El porcentaje medio de células apoptóticas y SEM representa (n = 3). *** P-valor & lt; 0,0001 (Chi cuadrado) calculada por comparación de los recuentos de células totales entre las células OVCAR-3 tratadas con un
CCNE1
siRNA y todas las demás condiciones. expresión de la proteína (E) CCNE1 por Western Blot para confirmar siRNA mediada por
CCNE1
caída al final del estudio experimental. (F) La viabilidad celular en líneas celulares adicionales después de la transfección con
CCNE1
o no silenciar siRNAs normalizado a cada línea celular sin siRNA añadió. La significación estadística (prueba t) calculado por comparación con NS siRNA en la misma línea celular. Media de absorbancia normalizada de ensayo de MTS y SEM representa (n = 3); * Valor de p & lt; 0,05, ** p-valor. & Lt; 0,01
De los genes analizados, sólo el
CCNE1
caída mostraron una reducción significativa de la viabilidad celular en OVCAR- 3 (a aproximadamente 60% de las células de control NS; p & lt; 0,01; Figura 2C).
CCNE1
caída tuvo ningún efecto sobre SK-OV-3 células. Teniendo en cuenta su papel en la transición G1 /S, esperábamos que el agotamiento de la proteína ciclina E1 sería inducir la detención G1 (ver más abajo) y el resultado en un aumento de células apoptóticas. TUNEL tinción de las células no tratadas fue comparable (SK-OV-3, 0,1%; OVCAR-3, 0,2%) (Figura 2D), mientras que
CCNE1
caída resultó en un aumento significativo en la apoptosis sólo en OVCAR-3 (p & lt; 0,0001). Reducción en la abundancia de proteínas también se validó en ambas líneas celulares después de la caída de genes (Figura 2E).
Una vez identificada la sensibilidad específica de OVCAR-3 a
CCNE1
desmontables, que tuvo como objetivo validar este hallazgo en líneas de células independientes y determinar si el efecto observado fue de amplificación dependiente. Por lo tanto, hemos ampliado el análisis para incluir una líneas celulares de tres adicionales con amplificación en 19q12 (OVCAR-4, Kuramochi y OVCAR-8) y una línea adicional sin amplificar (IGROV-1). Una correlación estadísticamente significativa entre el número de copias y la expresión génica de
CCNE1
se encontró en todas las líneas. Sin embargo, OVCAR-8 no muestra incrementos
CCNE1
expresión en relación con la amplificación de genes (Figura S2 A).
CCNE1
expresión y los niveles de proteína ciclina E1 se redujeron de manera eficiente en cada línea con respecto a la línea base de la expresión mediada desmontables-siRNA (Figura S2 B y C). Como se observa en OVCAR-3,
CCNE1
caída específicamente redujo la viabilidad de las líneas adicionales con 19q12 amplificación, y sólo marginalmente en la línea sin amplificar IGROV-1 (Figura 2F). Así, las células tumorales de ovario con la amplificación de 19q12 son especialmente sensibles al agotamiento de ciclina E1, en comparación con las líneas sin amplificar.
CCNE1
caída aguda reduce la sensibilidad al cisplatino
Dada la asociación de 19q12 amplificación con fallo primario del tratamiento [3] y los pobres resultados [4], [5] hemos tratado de explorar el efecto del gen desmontables en la sensibilidad a los fármacos. Aunque nuestro análisis había identificado una dependencia específica en
CCNE1 Hoteles en líneas amplificadas, lo primero que volver a evaluar todos los siete genes de amplicón-asociado para el impacto sobre la respuesta de la quimioterapia en las células OVCAR-3 y SK-OV-3 utilizando un 72- ensayo de citotoxicidad horas. Las células se trataron a ligeramente por encima de un IC50 pre-determinado (ver Métodos S1) y la viabilidad midieron. Desmontables de genes dentro del amplicón no tuvo un impacto significativo sobre la sensibilidad a cisplatino de cualquiera de línea celular. Inesperadamente, la citotoxicidad inducida por cisplatino en OVCAR-3 células tratadas fue atenuada por
CCNE1
inhibición (Figura 3A). Se realizó un análisis de dosis-respuesta a caracterizar mejor el efecto del tratamiento con cisplatino después de
CCNE1
caída. Se observó un cambio estadísticamente significativo en la curva de dosis-respuesta en OVCAR-3 (p & lt; 0,05; Figura 3B), pero no SK-OV-3 que demuestra aún más la resistencia de OVCAR-3 a cisplatino en
CCNE1
inhibición. Consistente con este hallazgo, el cisplatino no tuvo ningún efecto diferencial sobre la viabilidad celular en
CCNE1
desmontables células en comparación con los controles de siRNA en dos de las tres líneas adicionales 19q12 amplificados (Kuramochi y OVCAR-4) (Figura 3C). Por el contrario, desmontables gen aumentó el efecto del cisplatino sobre la viabilidad celular en ambas líneas celulares con baja línea de base
CCNE1
expresión (OVCAR-8 y la línea de control 19q12 amplificado IGROV-1).
( a) la viabilidad celular tras la transfección con ARNip individuales y el tratamiento con cisplatino se normalizaron con las células control tratados con cisplatino y sin siRNA. dosis de cisplatino de 3 micras o 6 micras, fue utilizado para OVCAR-3 y las células SK-OV-3, respectivamente. absorbancia media normalizada (490 nm) a partir de tres ensayos independientes de MTS (pocillos por triplicado por condición) y SEM trazan (n = 3). respuesta a la dosis (B) El cisplatino después de la transfección con
CCNE1
o no silenciar siRNA en OVCAR-3 y SK-OV-3 líneas celulares. La flecha indica la dosis de tratamiento fármaco utilizado en la pantalla inicial; p-valor indica significación de la diferencia entre las curvas ajustadas. Media normalizada MTS ensayo de absorbancia a las células sin tratamiento con cisplatino, SEM y de cuatro parámetros equipado pendiente de Hill representa (n = 3 para cada concentración de fármaco). (D) La viabilidad celular tras la transfección con
CCNE1
o NS siRNAs y el tratamiento con cisplatino normalizó a las células de control no siRNA tratados con cisplatino para cada línea celular. La significación estadística calculada por comparación con NS siRNA, las células tratados con cisplatino en la misma línea celular. Media de absorbancia normalizada de ensayo de MTS y SEM representa (n = 3). Ver Tabla S4 para las dosis de tratamiento con cisplatino.
Para investigar el fenotipo de resistencia a cisplatino observado en células OVCAR-3 con
CCNE1
desmontables, que utiliza citometría de flujo para analizar la distribución del ciclo celular después de cisplatino tratamiento. el tratamiento con cisplatino de OVCAR-3 resultó en una fase S prolongada (Figura 4A), mientras que SK-OV-3 células detenidas predominantemente en la fase G2 del ciclo celular (Figura 4B). En consonancia con el requisito de ciclina E1 en la transición G1 /S [18],
CCNE1
siRNA desmontables inducida G1 detención en OVCAR-3, más evidente en la presencia de cisplatino (Figura 4A). Por el contrario, la distribución del ciclo celular de SK-OV-3 no fue modificado por la inhibición de
CCNE1
expresión con o sin cisplatino (Figura 4B). Estas observaciones fueron consistentes en
CCNE1
amplificada Kuramochi y OVCAR-4 células (Figura S3). detención parcial G1 también se observó en las células no amplificadas 19q12 IGROV-1 después de
CCNE1
caída, sin embargo, sólo en respuesta al tratamiento con cisplatino. Como se observó en el ensayo de viabilidad, el
CCNE1
amplifican pero OVCAR-8-células que expresan bajos comportaron de manera similar a las líneas de control. Por lo tanto, la conclusión de que la dependencia de OVCAR-3, Kuramochi, y OVCAR-4 en alta
CCNE1
expresión dio lugar a una detención del ciclo celular después de la caída de genes, incluso en la presencia de cisplatino, más probable es que la contabilidad de la aparente cisplatino resistencia observada en los ensayos de viabilidad a corto plazo.
(a) OVCAR-3 células y (B) el perfil del ciclo celular SK-OV-3 (izquierda) y la proporción de células en G1, S o fase G2 ( derecha) para las células teñidas PI analizadas por citometría de flujo 72 horas después de la transfección con
CCNE1
o NS siRNA con o sin tratamiento con cisplatino (3 M o 6 M durante OVCAR-3 y SK-OV-3 células respectivamente).
Para comprender el impacto a largo plazo de
CCNE1
agotamiento sobre la supervivencia celular después del tratamiento con cisplatino que ensayaron la clonogenicidad de líneas con y sin amplificación del locus 19q12 (vea el esquema de la figura 5A ).
CCNE1
desmontables profundamente reducido la capacidad clonogénico de OVCAR-3, pero no SK-OV-3 en ausencia de fármaco (Figura 5B y 5C). En contraste con el aumento de la resistencia al cisplatino en ensayos de citotoxicidad a corto plazo,
CCNE1
atenuación reduce la supervivencia clonogénico de células OVCAR-3 después del tratamiento con cisplatino (Figura 5B). No exploramos la
in vivo
efectos de
CCNE1
caída en líneas tumorales de ovario con la amplificación 19q12, y siendo incapaz de generar líneas viables con la integración estable de lentivirus corto horquilla RNA (shRNA) dirigido a
CCNE1 gratis (datos no mostrados).
(a) Experimental transcurso de tiempo de supervivencia de ensayo clonogénico después de siRNA transfección y tratamiento con cisplatino. cristal Representante violeta manchado (B) SK-OV-3 y (C) OVCAR-3 colonias (superior) y proporción media de colonias discretas formado (parte inferior) en comparación con las células control sin siRNA o tratamiento con cisplatino 1 hora (3 micras o 6 micras para OVCAR-3 y SK-OV-3 células respectivamente). Las barras de error indican SEM (n = 3), ** p-valor. & lt; 0,001
CCNE1
amplificación es predictivo de mal pronóstico en los tumores primarios
CCNE1
número de copias se midió en 43 tumores primarios de ovario de pacientes con estadios avanzados, la enfermedad invasiva serosa. Además, se incluyeron los datos de 52 tumores de nuestro análisis genómico anterior de platino-resistencia en el cáncer de ovario [3] y se obtuvo el ajuste de datos de expresión génica para todas las muestras [17]. Todos los pacientes fueron sometidos a cirugía primaria seguida de quimioterapia basada en platino. La información clínica se utiliza para correlacionar
CCNE1
estado con la supervivencia tenía más de dos años adicionales de datos de seguimiento de pacientes acumulada (a junio de 2010) de nuestros estudios anteriores.
Los pacientes fueron estratificados basados en
CCNE1
estado de número de copias según la evaluación de la qPCR (ver Materiales y Métodos). No se observó ninguna diferencia entre las características clínicas de cada grupo aparte de la edad, los pacientes más jóvenes sobre-representados en el
CCNE1
grupo sin amplificar (Tabla 1 y Figura 6A).
CCNE1
expresión génica mostraron una fuerte correlación con el número de copias (Figura 6B) y ambos se correlacionaron con la supervivencia libre de progresión (PFS) (Figura 6 C & amp; D).
CCNE1
número de copias, pero no la expresión de genes, también se asoció con la supervivencia global-(OS) (Figura 6E & amp; F). La correlación más significativa observada fue grado de
CCNE1
ganancia y PFS (Figura 6C), de manera que todos los casos con la amplificación de alto nivel mostraron enfermedad progresiva dentro de aproximadamente doce meses desde el diagnóstico (media PFS de 10,7 meses; Tabla 1 ).
(A) distribución de edad de los pacientes estratificados por
CCNE1
estado de amplificación. Kruskal-Wallis p-valor informado, barras indican la media y la SEM. (B) Correlación entre el
CCNE1
número de copias por la señal de qPCR y la expresión génica mediante microarrays. (C) Análisis de Kaplan-Meier de
CCNE1
sin amplificar (n = 68), ganado (n = 21) y se amplifica (n = 6) pacientes con cáncer de ovario y (D)
CCNE1
baja (n = 31), media (n = 28) y alta (n = 36) que expresan muestras para la supervivencia libre de progresión y (e & amp; F) la supervivencia global. informaron los valores de p log-rank test. La estratificación por
CCNE1
número de copias o la expresión de estado se describe en Materiales y Métodos.
La amplificación de 19q12 se correlaciona con el aumento en 20q11
Una vez identificados los
CCNE1
como un factor crítico en el 19q12 amplificación en el cáncer de ovario, razonó que otras mutaciones en otros lugares en el genoma podrían interactuar con la ciclina E1 o estar asociados con la resistencia a fármacos. Por ejemplo, las mutaciones que mejoran el efecto de, o permiten a los tumores toleran
CCNE1
sobreexpresión puede co-ocurrir con 19q12 ganancia. Se obtuvieron dos el número de copias y la expresión génica de datos SNP basada en 157 tumores invasivos serosos de alto grado de El Proyecto del Genoma del Cáncer Atlas (TCGA) para su análisis. En primer lugar, se analizó la expresión génica de los genes cuyos productos proteicos son necesarios para el procesamiento de la ciclina E1 a formas activas de bajo peso molecular (
ELA2
y
CAPN2
) [19], [20] o su degradación (
FBXW7
) [18]. Sin embargo, la correlación positiva estadísticamente significativa entre la expresión de genes candidatos y
se observó CCNE1
estado (datos no mostrados). y entonces correlacionamos 19q12 ganancia con todas las otras ganancias y pérdidas dentro de los segmentos 0.1 Mb del genoma (ver Métodos S1). Los tres principales regiones correlacionados del cambio de número de copias estaban en 20q11, 1p36 y 6q27 (Figura 7A). La ganancia asociada más importante se localiza en una región 2,5 Mb en el cromosoma 20 (Figura 7B) y ha sido validado en un análisis imparcial independiente de las correlaciones de todo el genoma de la ganancia y la pérdida de los tumores de ovario [21]
.
(a) Circos diagrama que muestra las regiones de cambio de número de copia se correlacionaron significativamente a
CCNE1
amplificación (valor de p & lt; 1 × 10
-5) (B) Importancia de la correlación del número de copias de
CCNE1
amplificación a través del cromosoma 20. umbral de significación utilizado para definir los límites máximos de correlación indicadas por la línea de puntos. (C)
TPX2
correlación con la expresión del número de copias y locus
CCNE1
expresión (fuente: TCGA). (D) La correlación de
CCNE1
y
TPX2
la expresión de genes en un conjunto de datos independientes (Tothill et al., 2009).
Con el fin de reducir gen candidatos dentro de las tres regiones con mayor probabilidad de interactuar con
CCNE1
, el próximo correlacionaron la expresión de los genes dentro de cada región con
CCNE1
expresión (Tabla 2). La expresión de
TPX2
se asoció significativamente con más
CCNE1
expresión, y también se correlacionó con su propio estado de amplificación (Figura 7C). La relación entre el
CCNE1
y
TPX2
la expresión de genes fue validado en un segundo conjunto de datos independientes (Figura 7D). La fuerte asociación entre la
TPX2
y
CCNE1
amplificación y expresión se le dio intrigante que TPX2 es una proteína centromérica necesario para la función del huso mitótico durante la división celular [22].
20q11 amplificación hace que las células resistentes a TPX2 desmontables
para probar si había una dependencia funcional en
TPX2 Hoteles en líneas celulares con la amplificación del locus 20q11 y si interactúa con
CCNE1
, se evaluó
TPX2
estado en que se utilicen para nuestros experimentos desmontables.
TPX2
se amplificó (Figura 8A) y sobre-expresado (Figura 8B) en los tres
CCNE1
ha amplificado y sobre-expresión de líneas celulares (OVCAR-3, OVCAR-4 y Kuramochi) compararon a la línea de control, SK-OV-3. Además, se identificaron más OAW-28 que tienen alto nivel de amplificación de 20q11 (Figura 8A, los datos de Sanger del Genoma del Cáncer del archivo del proyecto) y el más alto nivel de expresión génica a través de las líneas celulares ensayadas (Figura 8B).
(a) Affymetrix SNP 6.0 mapeo del número de copias del cromosoma 20 microarrays en líneas celulares de tumores ováricos que se localice cada
TPX2
. (B) Correlación entre el
TPX2
número de copias y la expresión génica mediante PCR cuantitativa en líneas celulares. viabilidad (C) Cell representado como absorbancia normalizada MTS (490 nm) a partir de tres ensayos independientes con las células tratadas con no siRNA en siRNA experimentos doble desmontables. Media de absorbancia normalizada de ensayo de MTS y SEM representa (n = 3). (E) la expresión de proteínas TPX2 por Western Blot para confirmar siRNA desmontables mediada al final del estudio experimental de las líneas celulares y en las células CCNE1 OAW-28.
A diferencia de la estrecha relación entre el
CCNE1
amplificación y la sensibilidad celular al gen desmontables, se observó una relación inversa entre el
TPX2
número de copias y los efectos de
TPX2
siRNA (Figura 8C). Por ejemplo, SK-OV-3 células con baja expresión de genes (Figura 8B) y un mínimo de proteínas TPX2 detectable (Figura 8D), eran muy sensibles a las gen desmontables, mientras que OAW-28 células fueron esencialmente resistentes. RT-PCR (Figura S4) y Western blot (Figura 8D) análisis demostraron knockdown eficiente de
TPX2
, sin embargo la proteína era todavía detectable en algunas líneas celulares que inicialmente tenían niveles elevados de proteína TPX2. También observamos que desmontables de
CCNE1
resultó en disminución de
TPX2
la expresión genética en 19q12 líneas amplificados (Figura S4 A) sugerente que
TPX2
expresión se ve afectada aguas abajo de ciclina E1 .
Dada la correlación entre los
CCNE1
y
TPX2
amplificación, que también examinó si la caída simultánea de ambos genes disminuiría aún más la viabilidad de las líneas celulares que contienen ambas amplificaciones (Figura 8C ). Después nos permitió un efecto competitivo de la combinación de siRNAs (ver Métodos) ninguna interacción obvia se observó con caída simultánea de
TPX2
y
CCNE1
. Desmontables de
CCNE1
tuvo un efecto mínimo en OAW-28 la viabilidad celular a pesar de la reducción de la proteína eficientes en desmontables experimentos dobles (Figura 8D). Este hallazgo es consistente con nuestros resultados iniciales, como OAW-28 células no tienen 19q12 amplificación (véase la figura S1 para OAW-28 número de copias en este locus).
Discusión
Se realizó la siRNA primera caída sistemática de todos los genes dentro del amplicón 19q12 mínimamente definido en el cáncer de ovario que muestra que
CCNE1
es el objetivo clave oncogénico. Teniendo en cuenta las funciones conocidas de la ciclina E1 en el cáncer, incluyendo de-regulación del ciclo celular y promueven la inestabilidad genómica, que era el conductor probable de la 19q12 locus, sin embargo, no habían sido excluidos otros genes. Por ejemplo,
C19orf2
, que se encuentra inmediatamente adyacente a
CCNE1
, recientemente se ha anotado para codificar URI, una proteína prefoldin no convencional. Los estudios de la
C. elegans
URI homólogo sugieren una implicación en la remodelación de la cromatina, prevenir y /o reparar el daño del ADN endógeno genotóxico y el mantenimiento de la integridad del genoma [23]. Más recientemente, URI se ha identificado como un inhibidor de la clave de la proteína fosfatasa 1γ (PP1γ) y está involucrado en la regulación de la vía de supervivencia mTOR /S6K1 basado en la disponibilidad de factores de nutrientes y el crecimiento [24]. A pesar de estas asociaciones biológicas interesantes, no se encontraron pruebas de URI como conductor del locus 19q12.
La reducción de la viabilidad celular después de
CCNE1
caída era específica para las líneas celulares con 19q12 amplificación, con limitada o ningún efecto en las líneas no amplificados, lo que indica una "adicción" [25] para
CCNE1
desregulación. Nuestros resultados validan un informe reciente que muestra la sensibilidad-amplificación específica de
CCNE1
atenuación en OVCAR-3 y IOSE 29 células [26]. unamplified líneas parecían pasar por alto siRNA mediada G1 S detención /puesto de control y la apoptosis, lo que posiblemente refleja
CCNE1
mecanismos independientes de ciclo celular de-regulación y procesos oncogénicos distintas. Curiosamente, la expresión aumentada de CCNE1 Recientemente se ha demostrado en serosa carcinoma intraepitelial de trompas (STIC), un precursor propuesto para el carcinoma seroso de alto grado [27]. Este hallazgo refuerza la importancia de
CCNE1
la desregulación en el cáncer de ovario y sugiere que es un requisito temprano en la evolución del tumor.
19q12 amplificación está fuertemente asociado con el fracaso del tratamiento primario en tumores de ovario [3 ] y por lo tanto es a la vez un potencial marcador de pronóstico y diana terapéutica. Una vez identificadas
CCNE1
como el conductor de la amplificación 19q12 hemos tratado de entender cómo contribuye al fracaso del tratamiento primario.