Extracto
La interleuquina (IL) -20 es una citoquina proinflamatoria en la familia de la IL-10. IL-20 se asocia con la promoción de tumores en el patogénesis de la oral, la vejiga y el cáncer de mama. Sin embargo, se sabe poco sobre el papel de la IL-20 en el cáncer de próstata. Nuestra hipótesis es que la IL-20 promueve el crecimiento de células de cáncer de próstata. La tinción inmunohistoquímica mostró que la IL-20 y sus receptores se expresaron en líneas celulares de cáncer de PC-3 y LNCaP de próstata humanos y en tejido de tumor de próstata de 40 pacientes.
In vitro
, IL-20 upregulated N-cadherina, STAT3, vimentina, fibronectina, RANKL, la catepsina G, y la catepsina K, y el aumento de la formación de la migración y la colonia de células de cáncer de próstata a través de p38 activada, ERK1 /2 , señales de AKT, y NF-kB en las células PC-3. Se investigaron los efectos de la lucha contra la IL-20-7E anticuerpo monoclonal en el crecimiento del tumor de próstata
in vivo usando
subcutánea ratón SCID y los modelos de xenoinjertos de tumores intratibial.
In vivo
, 7E reducción del crecimiento del tumor, suprimida osteolisis tumoral mediada, y la densidad mineral ósea protegido después de la inyección intratibial de células de cáncer de próstata. Llegamos a la conclusión de que la IL-20 está implicada en la migración celular, la formación de colonias, y osteolisis inducida por tumor de cáncer de próstata. Por lo tanto, la IL-20 podría ser una nueva diana para el tratamiento de cáncer de próstata
Visto:. Hsu YH, Wu CY, Hsing CH, Lai WT, Wu LW, Chang MS (2015) Anti-IL-20 Anticuerpo Monoclonal suprime el crecimiento del cáncer de próstata y hueso Osteólisis en modelos murinos. PLoS ONE 10 (10): e0139871. doi: 10.1371 /journal.pone.0139871
Editor: Dominique Heymann, Faculté de Médecine de Nantes, Francia |
Recibido: 12 de mayo de 2015; Aceptado: September 16, 2015; Publicado: 6 Octubre 2015
Derechos de Autor © 2015 Hsu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (MAS 103 a 2311-B-006-002 y el MOST 104 a 2311-B-006-007 -MY2)
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es el segundo cáncer más incidente y la sexta causa de cáncer. muerte en los hombres en todo el mundo [1]. La mayoría de los hombres con cáncer de próstata avanzado tienen metástasis óseas escleróticas, que causan dolor severo y fracturas óseas patológicas [2, 3]. Invasión del compartimiento de hueso por células de cáncer causa un desequilibrio en la actividad de los osteoclastos y los osteoblastos que a su vez interrumpe la homeostasis ósea [4]. Estas respuestas inducidas por el cáncer de hueso favorecen la supervivencia y el crecimiento de las células cancerosas en su nuevo entorno. Aunque las metástasis óseas del cáncer de próstata son principalmente osteoblástica en la naturaleza, existe evidencia creciente de que la osteolisis mediada por osteoclastos también contribuye a la morbilidad ósea en pacientes con cáncer de próstata con metástasis ósea [5, 6].
Otros informan que mama y de próstata cánceres de inducir la activación de osteoclastos por la liberación de factores solubles, tales como IL-1, IL-6 y el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). La mayoría de estos mediadores actúan sobre los osteoblastos y células del estroma, y contribuyen a las lesiones osteolíticas upregulating activador del receptor de NF-kB ligando (RANKL), que proporciona un posible mecanismo para explicar el aumento de la resorción ósea en la metástasis ósea [6, 7]. RANKL se une a su receptor (RANK) en la membrana celular de los osteoclastos, lo que conduce a la diferenciación y maduración de los osteoclastos [8]. La catepsina K, una cisteína proteasa secretada por los osteoclastos y las células de cáncer de próstata, se degrada la matriz extracelular durante la resorción ósea [9]. La catepsina G, un quimioatrayente para los precursores de osteoclastos, es capaz de procesar RANKL a una forma soluble (sRANKL) que promueve la activación de los osteoclastos [10, 11]. El bloqueo de la catepsina G y la catepsina K reduce significativamente la osteolisis inducida por tumor, lo que sugiere que la catepsina K y la catepsina G son cruciales en el microambiente de las lesiones osteolíticas de cáncer inducido por [10, 12].
La inflamación es críticamente relacionado con tumor progresión. Afecta a la tumorigénesis a nivel molecular mediante la modulación del microentorno del tumor y la regulación del equilibrio de citocinas, quimiocinas y factores de transcripción [13, 14]. La transición epitelio-mesenquimal (EMT) es crítico para la metástasis del cáncer. EMT cambia el comportamiento de las células cancerosas y hace que invaden el estroma circundante, conduce a su intravasación, la difusión y la colonización de sitios distantes [15, 16]. Durante EMT, las células tumorales, que son células epiteliales como, adquieren características mesenquimales, y la pérdida del marcador epitelial E-cadherina conduce a un aumento en los marcadores mesenquimales N-cadherina, fibronectina y vimentina [17]. Varios inductores de la EMT, como Caracol y Twist, son factores de transcripción que reprimen la expresión de E-cadherina [16, 18]. Otros estudios [19, 20] han informado de que las células de cáncer promovidos EMT mediante la activación de la vía de señalización STAT3.
IL-20 es un miembro de la familia IL-10, que incluye IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24 e IL-26 [21, 22]. Se señales a través de dos tipos de complejo receptor heterodímero: IL-20R1 /IL-20R2 e IL-22R1 /IL-20R2 [23]. IL-20 está implicada en varias enfermedades inflamatorias, como la artritis reumatoide [24], aterosclerosis [25], psoriasis [26, 27], osteoporosis [28], cáncer oral [29], y el cáncer de mama [30].
el cáncer de próstata es una enfermedad compleja en la que la metástasis al hueso es una causa de morbilidad y puede preceder a la metástasis a otros órganos vitales. Nos anteriormente [28, 30] demostraron que la IL-20 no sólo promueve la proliferación de tumores de mama y la migración, sino que también modula la diferenciación de los osteoclastos upregulating RANKL y RANK. Anti-IL-20 anticuerpo monoclonal (mAb) 7E disminuyó lesiones óseas osteolíticas en modelos de ratón de cáncer de mama y protegida ratones ovariectomizadas contra la pérdida ósea osteoporótica, los cuales apoyan la noción de que IL-20 es crítica para la regulación de la osteolisis mediada por tumor. Nuestra hipótesis es que la IL-20 promueve el crecimiento de células de cáncer de próstata. Por lo tanto, se determinó la expresión de IL-20 y su función biológica en células de cáncer de próstata y se evaluó el potencial terapéutico de xenoinjertos 7E en modelos de ratón de cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
La inmunohistoquímica
incluidas en parafina de 40 muestras de cáncer de próstata humano se obtuvieron de una matriz de tejido de cáncer de próstata comercial (SuperBioChips Laboratories, Seúl, Corea), y se utilizaron para la inmunohistoquímica (IHC) de la tinción con anti-IL-20 (7E ), anti-IL-20R1, anti-IL-20R2, o anti IL-22R1-mAb (amp I +; D Systems, Minneapolis, MN) como se describe anteriormente [31]. La incubación de las secciones de tejido en parafina con isotipo IgG1 de ratón (clon 11711; R & amp; D Systems) en lugar de anticuerpo primario era el control negativo. Se utilizó 3 mg /ml como la concentración de trabajo para cada anticuerpo primario y para el control de IgG1 de ratón. Dos patólogos entrenados en la patología de la próstata y cegados a las fuentes de la muestra se analizó la histología y los niveles de expresión de IL-20 y sus receptores de cada paciente. La puntuación de las tinciones inmunohistoquímicas en cada muestra se determinó usando una puntuación histológica (H) [32] que se calculó con la siguiente ecuación: H = ΣPi (i + 1), donde i es la intensidad de la tinción de las células tumorales teñidas (0 -4+), y Pi es el porcentaje (intervalo: 0 a 100%) de las células tumorales teñidas para cada intensidad. La IL-20, IL-20R1, IL-20R2 y 22R1 inmunotinción IL-fueron etiquetados bajo la expresión (H & lt; 200) o de alta expresión (H ≥ 200). La tinción inmunocitoquímica de IL-20 y sus receptores en las células PC-3 se hizo usando el mismo protocolo que se describió anteriormente.
Cultivo de células
líneas celulares de cáncer de próstata se adquirieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). líneas celulares de cáncer de próstata humano, PC-3 y LNCaP, se mantuvieron en RPMI-1640 con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Life Technologies, Rockville, MD), 100 g /ml de estreptomicina y 100 U /ml de penicilina . Las células fueron incubadas a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2.
La proliferación celular ensayo
células PC-3 (3 × 10
4) se cultivaron durante la noche y luego se exponen a humano (h) IL-20 (200 ng /ml) durante 72 horas en medio que contiene 1% de FBS. Para confirmar la actividad específica de IL-20, 7E (2 mg /ml) se añadió al sistema de cultivo, ya sea solo o junto con IL-20 a un 10: 1 (7E: 20 IL-) relación de concentración. Las células se incubaron con 1 mg /ml de tetrazolio metiltiazol (MTT) (Sigma-Aldrich) durante 3 horas y los cristales de MTT-formazan se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma-Aldrich). Se midió la absorbancia a 550 nm.
La migración de células de ensayo
La migración celular se ensayó usando una cámara de Boyden modificada con un filtro de policarbonato con 8-micras poros (Nucleopore, Cabin John, MD). Los pocillos superiores fueron cargados con células PC-3 (5 × 10
4). Las cámaras inferiores se rellenaron con hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 mg /ml), mIgG (2 mg /ml), hIL-20 plus 7E, o hIL-20 plus mIgG en medio RPMI-1640 que contiene 1 % de FBS. RPMI-1640 con FBS al 1% se utilizó como control negativo. Las células se dejaron migrar durante 8 horas, y luego se tiñeron y se contaron. El experimento se llevó a cabo durante tres veces usando pozos por cuadruplicado.
En tiempo real ensayo de migración
PC-3 células fueron sembradas a 5 × 10
4 células /ml en placas de 6 pocillos y dejó que se unieran durante 18 horas. Las células se expusieron a medio que contenía hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 mg /ml), mIgG (2 mg /ml), hIL-20 plus 7E, o hIL-20 plus mIgG. cinética de la migración celular se registraron utilizando un analizador de células fluorescentes (Juli inteligente; Biotecnologías Montreal Inc. (MBI), Dorval, Montreal, Canadá) durante 18 horas y luego se analizaron usando ImageJ software (http://rsbweb.nih.gov/ij/)
Soft agar de formación de colonias de ensayo
células que muestran un crecimiento exponencial se suspendieron en medio de crecimiento completo que contenía 0,35% de Bacto-agar (a-6013 Tipo 1 EEO bajo;. Sigma-Aldrich) y superpuesto en gel de agarosa al 0,5% en placas de 30 mm (1 × 10
4 células /placa). Medio que contiene IL-20 (200 ng /ml), 7E (2 mg /ml), mIgG (2 mg /ml), hIL-20 plus 7E, o hIL-20 plus mIgG se sobrepuso en el agar superior. Los platos se mantuvieron a 37 ° C en un incubador humidificado (5% de CO
2, el 95% de O
2) durante tres semanas. Durante este período, el medio se cambió cada 2 días. El número de colonias visibles (& gt; 50 micras) se contó bajo un microscopio. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)
Para analizar la expresión de IL-20 y sus receptores, el ARN total de PC-3 y células LNCaP se extrajo utilizando un reactivo (Trizol; Invitrogen, Carlsbad, CA), y luego el ARN total se sometieron a transcripción inversa (Clontech, Palo Alto, CA) según las instrucciones del fabricante. La plantilla amplificado se detectó utilizando SYBR Green con un sistema de PCR en tiempo real (StepOnePlus; Applied Biosystems) con cebadores específicos de genes. gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se utilizó como control interno. Para examinar la expresión de E-cadherina, N-cadherina, STAT3, vimentina, fibronectina, RANKL, la catepsina G, y catepsina K, las células PC-3 se incubaron con hIL-20 (200 ng /ml) durante 2 a 6 horas. Los niveles de expresión de estos genes se analizaron utilizando SYBR Green (Applied Biosystems) como el agente de interacción. análisis de cuantificación de ARNm se normalizó con GAPDH humano como la limpieza de genes. múltiplos relativos de cambio en la expresión de ARNm se determinó mediante el cálculo de 2
-ΔΔCt.
Western Blot
PC-3 células (2 × 10
5) fueron estimuladas con hIL 20 (200 ng /ml) (R & amp; D Systems) durante los tiempos indicados. lisado celular total fue de cobro revertido por la adición de 1 x tampón RIPA que contiene fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PSMF) (RIPA: PSMF = 10: 1) y se centrifugó a 13.000 rpm a 4 ° C para recoger el sobrenadante. Transferencia Western con anticuerpo específico para fósforo-p38, quinasa regulada por señales de fósforo extracelular (ERK1 /2), fósforo-AKT y fósforo-nuclear se utilizó factor kappa B (NF-kB) (Cell Signaling Technology) siguiente del fabricante instrucciones. β-actina se utilizó como control interno (Cell Signaling Technology). La cuantificación de proteínas en las bandas occidentales se realizó utilizando el software ImageJ.
ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
PC-3 células se incubaron con hIL-20 (100, 200, o 400 ng /ml) y los medios de cultivo se recogieron y se determinaron utilizando un kit de ELISA sRANKL (Peprotech, Rocky Hill, NJ) según las instrucciones del fabricante. La catepsina G-inhibidor específico, N-tosil-L-fenilalanina clorometil cetona (TPCK; Sigma-Aldrich) se utilizó para bloquear la actividad de la proteasa de la catepsina G. células PC-3 se preincubaron con 1 M de TPCK durante 1 hora y después se trató con hIL-20 durante otras 72 horas. TPCK se disolvió en 100% de etanol (EtOH), y después se diluyó en medio de cultivo. El control del vehículo fue 0,0175% EtOH en medio de cultivo. El nivel de sRANKL en el medio de cultivo final se analizó mediante ELISA.
El cáncer de próstata modelo de tumor PC-3-cojinete
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos basados en los Institutos Nacionales de Taiwán de Salud normas y directrices para el cuidado y uso de animales de experimentación (Taipei, Taiwán). Los procedimientos de investigación fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Nacional Cheng Kung. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales y para reducir el número de animales utilizados. masculino inmunodeficiencia combinada severa (SCID) ratones de ocho semanas de edad, se usaron en todos los experimentos. Brevemente, los ratones fueron anestesiados utilizando una inyección intraperitoneal (i.p.) la inyección de pentobarbital (50 mg /kg) y luego se inyectaron con buprenorfina (2 mg /kg; i.p.) para la analgesia quirúrgica. La almohadilla de grasa mamaria izquierda de cada ratón se inyectó por vía subcutánea con células PC-3 (1 × 10
6). La tasa de éxito para la implantación subcutánea (s.c.) del tumor fue de 100%. Los ratones fueron asignados aleatoriamente a 3 grupos (n = 4 en cada grupo), y se trataron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), 7E (10 mg /kg; sc), o inmunoglobulina G de ratón (mIgG; 10 mg /kg ; sc) tres veces por semana durante la duración del régimen de tratamiento. El anticuerpo se inyectó (s.c.) en la periferia de la creciente tumor en ratones SCID portadores de tumores. Controles sanos no fueron inyectados con células tumorales. El tamaño del tumor se midió con un calibre en tres dimensiones perpendiculares y se calcula utilizando la siguiente fórmula: tamaño del tumor = 0,5 x (longitud x anchura x profundidad). Cuarenta días después de que se inyecta a las células tumorales, los ratones se sacrificaron usando CO
2, y se recogió el tejido del tumor y se pesaron. Para analizar los niveles de expresión de IL-20 y catepsina G, se recogió el tejido tumoral aislado a partir de los 4 ratones en cada grupo, y el ARN total fue extraído para su posterior análisis.
inyección intratibial de PC-3 en ratones SCID
Ocho semanas de edad, los ratones SCID machos fueron anestesiados con una inyección de pentobarbital (50 mg /kg) y después de la buprenorfina (2 mg /kg; ip) para la analgesia quirúrgica. Cada uno recibió una incisión pararrotuliana medial y una aguja se colocó en el canal intramedular de la tibia. Células PC-3, a una concentración de 2 × 10
5/100 l, se inyectaron lentamente en la tibia y la incisión se cerró con suturas 5-0 crómico. Para la analgesia postoperatoria, la buprenorfina (2 mg /kg; vía intraperitoneal) se inyectó una vez al día durante 3 días después de la cirugía. La tasa de éxito para la implantación del tumor intratibial era 100%. Los ratones fueron asignados aleatoriamente a tres grupos (n = 5 en cada grupo) y se inyectaron con vehículo (PBS; ip), mIgG (10 mg /kg; ip), o 7E (10 mg /kg; ip) tres veces por semana. Siete semanas después del inicio de los tratamientos, los ratones fueron sacrificados mediante CO
2, y sus metáfisis tibial se analizaron
in vivo
mediante tomografía computarizada micro-(micro-CT) con una alta resolución, una dosis baja escáner de rayos X. La densidad mineral ósea (BMD) se analizó en 50 cortes consecutivos. Los resultados se calculan como un porcentaje frente a los valores de un control sano.
El análisis estadístico
Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA) se utilizó para el análisis estadístico. Se utilizó un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) no paramétrico de Kruskal-Wallis para comparar los datos entre los grupos. comparaciones post hoc se realizaron utilizando la prueba de comparación múltiple de Dunn. Los datos son medias ± desviación estándar (SD). Significación se fijó en
P Hotel & lt; 0.05
Resultados
La expresión de IL-20 y sus receptores en los pacientes con cáncer de próstata
Cuarenta muestras de tejido de la próstata adenocarcinoma (etapa II, n = 8;. Etapa III, n = 32) fueron IHC teñidas con anti-IL-20 mAbs. intensidad de la tinción fue alta expresión en 22 muestras (Figura 1A) y baja expresión en 18 muestras. Para investigar si las células del cáncer de próstata es la célula diana para la IL-20, se utilizó la tinción IHC para analizar los niveles de expresión de los receptores de IL-20 (IL-20R1, IL-20R2 e IL-22R1) en muestras de tejido de adenocarcinoma de próstata de 40 pacientes. Las células de carcinoma de próstata se tiñeron todos positivamente con anti-IL-20R1, anti-IL-20R2, y anti-IL-22R1 mAbs (Fig 1B, 1C y 1D). La intensidad de la tinción IHC de los tejidos de carcinoma de próstata fue heterogénea (Fig 1F). Anti-IL-20 y anti-IL-20R1 mAbs son muy manchadas en las células tumorales, pero anti-IL-20R2 y anti-IL-22R1 mAbs no son (Fig 1A, 1B, 1C y 1D, flechas) en el carcinoma representante tejidos. La expresión de IL-20R1, IL-20R2 e IL-22R1 fue alta en 37, 7, y 10 muestras, respectivamente.
(AE) muestras de tejido de adenocarcinoma de próstata quirúrgicamente biopsia (etapa II, n = 8 ; etapa III, n = 32) de 40 pacientes se obtuvieron de una matriz de tejido de cáncer de próstata comercial. tinción IHC con anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20R1, anti-IL-20R2, y anti IL-22R1-mAbs mostró que la IL-20 y sus receptores (IL-20R1, IL-20R2 e IL-22R1) fueron teñidas. IgG1 de ratón (mIgG1) isotipo fue el control negativo. Las flechas indican las células de cáncer de próstata. Ampliación: 200 ×. Los datos son representativos de 2 experimentos independientes con resultados similares. (F) La cuantificación de la intensidad de la tinción de anti-IL-20, anti-IL-20R1, anti-IL-20R2, y anti-IL-22R1 mAbs a partir de 40 especímenes de cáncer de próstata humano. IHC, la tinción inmunohistoquímica; mAb, anticuerpo monoclonal; mIgG, inmunoglobulina de ratón.
La proliferación celular se inhibe en células tratadas-7E PC-3
Para aclarar el papel de la IL-20 en la patogénesis del cáncer de próstata, que examinó por primera si la IL-20 y sus receptores (IL-20R1, IL-20R2 e IL-22R1) se expresaron en líneas celulares de cáncer de próstata. RT-qPCR y tinción IHC mostraron que la IL-20 y sus receptores se expresan en todas las células PC-3 (Fig 2A y 2B), y en células LNCaP (Fig 2A). El primer paso en la progresión del tumor se piensa que es el resultado de una alteración genética que conduce a la proliferación anormal de una sola célula. Para determinar si la IL-20 promueve la proliferación de células PC-3, se utilizó un ensayo MTT, que mostró que la IL-20 no promovió significativamente la proliferación celular de las células PC-3, pero que la proliferación celular se inhibió dependiendo de la dosis en tratada-7E las células PC-3 (figura 2C y 2D). La progresión tumoral involucrada la migración celular y la metástasis a órganos distantes. Un ensayo de migración en tiempo real mostró que la migración de células se incrementó en las células PC-3 tratados con IL-20 en comparación con los controles no tratados, la actividad de la que fue atenuada por 7E (Fig 3A y 3B). Además, un ensayo de cámara de Boyden mostró resultados similares (Fig 3C y 3D).
(A) RT-qPCR mostró que la IL-20 y sus receptores se expresaron en cáncer de próstata LNCaP células PC-3 y. Los datos son representativos de 2 experimentos independientes con resultados similares. (B) IHC mostró que la IL-20 y sus receptores se expresaron en células de cáncer de próstata PC-3. Los datos son representativos de 2 experimentos independientes con resultados similares. (C) Un ensayo MTT demostraron que la proliferación celular se inhibe en células PC-3 tratadas-7E. Medio solo se utilizó como control negativo. 7E se utilizó para inhibir la actividad de hIL-20. * P & lt; 0,05 frente a los controles no tratados, #p & lt; 0,05 frente al grupo de hIL-20. Los datos son las medias ± SD de tres experimentos independientes. (D) Un ensayo MTT demostraron que la proliferación celular se inhibió dependiendo de la dosis en las células PC-3 tratadas-7E. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 frente a los controles MIGG. Los datos son las medias ± SD de tres experimentos independientes. RT-qPCR, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real; MTT, tetrazolio metiltiazol; 7E, el anticuerpo monoclonal anti-IL-20; hIL-20, interleucina-20 humana.
(A-B) La migración celular se evaluó usando el ensayo de migración en tiempo real. las células PC-3 se incubaron con medio que contenía hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 mg /ml), mIgG (2 mg /ml), hIL-20 plus 7E, o hIL-20 plus mIgG. cinética de la migración celular se registraron utilizando un analizador de células fluorescentes inteligente durante 18 horas. (A) las imágenes con lapso de tiempo representativos para el seguimiento de la distancia de movimiento de las células PC-3 se muestran para cada grupo. La distancia de movimiento de cada célula se presenta en diferentes colores (count = 7 células). (B) Cuantificación de la distancia de movimiento (en micras) de las células PC-3 (count = 7 células). IgG de ratón era el control negativo de 7E. * P & lt; 0,05 frente a los controles no tratados, #p & lt; 0,05 frente al grupo de hIL-20. Los datos son la media ± SD de tres experimentos independientes, cada uno hecho por cuadruplicado. (C-D) La migración celular se evaluó también utilizando un ensayo de cámara de Boyden modificada. Los pocillos superiores se cargaron con 5 × 10
4 células PC-3. Las cámaras inferiores se rellenaron con hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 mg /ml), mIgG (2 mg /ml), hIL-20 plus 7E, o hIL-20 plus mIgG en medio RPMI-1640 que contiene 1 % de FBS. RPMI-1640 con FBS al 1% se utilizó como control negativo. Las células se dejaron migrar durante 8 horas. (C) Representante Giemsa fotos de tinción se muestran para cada grupo. (D) La cuantificación de células migradas por pocillo. ** P & lt; 0,01 frente a los controles no tratados. ## P & lt; 0,01 frente al grupo de hIL-20. Los datos son las medias ± SD de tres experimentos independientes, cada uno realizado por cuadruplicado.
La formación de colonias fue promovido en tratados con IL-20 células PC-3
El paso inicial de la la invasión local del cáncer de próstata es un aumento en la formación de colonias de las células cancerosas. Un ensayo de formación de colonias en agar blando mostró que la formación de colonias independiente del anclaje fue significativamente mayor en las células PC-3-20 tratadas con IL que en los controles no tratados, la actividad de la que fue atenuada por 7E (Fig 4A y 4B).
PC-3 (1 × 10
4 /pocillo) se incubaron con hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 mg /ml), mIgG (2 mg /ml), hIL-20 plus 7E, o hIL-20 plus mIgG durante 3 semanas. El medio de cultivo se cambió cada 2 días. (A) fotos representativos se muestran para cada grupo. formación (B) colonia fue significativamente mayor en las células PC-3 tratados con IL-20. 7E (2 mg /ml) se utilizó para inhibir la actividad de IL-20. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 frente a los controles no tratados, ## p & lt; 0,01 frente al grupo de hIL-20. Los valores son las medias ± SD de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado.
La transducción de señales se indujo en PC-3 células tratadas con IL-20
transición
epitelio-mesenquimal ( EMT) es fundamental en la progresión tumoral y la metástasis. Para investigar si la IL-20 está implicada en la próstata metástasis de tumores a través de EMT, RT-qPCR se utilizó para analizar la expresión del marcador epitelial E-cadherina, N-cadherina, STAT3, vimentina, y la fibronectina marcador mesenquimal en células PC-3 se incubaron con IL-20. Se demostró que la E-cadherina había sido downregulated (Fig 5A), y N-cadherina, STAT3, vimentina y fibronectina había sido significativamente upregulated (Fig 5B, 5C, 5D y 5E), mientras que en las células tratadas-7E, esta regulación positiva era atenuado. Para aclarar el posible mecanismo entre IL-20 y la progresión tumoral, las moléculas de señal de ERK1 /2, AKT, NF-kB y p38 se evaluaron y se encontró que ser fosforilados en células PC-3 IL-20 tratadas (Fig 5F) .
células (AE) PC-3 fueron tratados con hIL-20 (200 ng /ml) durante los tiempos indicados, y los niveles de expresión de e-cadherina, N-cadherina, STAT3, vimentina, y fibronectina se analizaron mediante RT-qPCR con cebadores específicos. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 frente a los controles 0 horas. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. las células PC-3 (f) (2 × 10
5) se incubaron con hIL-20 (200 ng /ml) durante los períodos de tiempo indicados, y luego de células se recogieron y se analizaron los lisados mediante inmunotransferencia con anticuerpos específicos contra fosfo- p38, fósforo-ERK1 /2, fósforo-AKT y fósforo-NF-kB. anticuerpo ß-actina se utilizó como control interno. La cuantificación de las bandas se realizó utilizando el software ImageJ. * P & lt; 0,05 frente a los controles 0 min. Los datos son las medias ± SD de tres experimentos independientes.
RANKL, catepsina G, y las transcripciones de la catepsina K y proteínas sRANKL producción fueron inducidos en las células PC-3 tratadas con IL-20
para probar si la IL-20 regula catepsinas y RANKL en el cáncer de próstata, las células PC-3 fueron tratados con IL-20 durante 6 horas. Un análisis del transcrito del gen RT-qPCR mostró upregulated RANKL, la catepsina G y la expresión de catepsina K en células PC-3 tratados con IL-20, la actividad de la cual se neutralizó mediante 7E (Fig 6A, 6B y 6C). Además, un ensayo de ELISA mostró una disminución significativa (p & lt; 0,05) aumento de la expresión sRANKL en 3 PC-células tratadas con IL-20 (Fig 6D). Por lo tanto, la hipótesis de que las células PC-3 tratados con IL-20 producen la catepsina G y posteriormente escindir RANKL para generar sRANKL, que fomenta aún más la activación de los osteoclastos en microambiente de la médula. Para confirmar que la disociación de RANKL fue catepsina G-dependiente, se utilizó un inhibidor de la catepsina G específico (TPCK, 1 M) para bloquear la actividad de la proteasa de la catepsina G. El resultado confirmó nuestra hipótesis (Fig 6E).
(AC) de PC-3 fueron tratados con hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 mg /ml), mIgG (2 mg /ml), hIL-20 plus 7E, o hIL-20 plus mIgG para 6 horas, y los niveles de expresión de RANKL, la catepsina G y la catepsina K se analizaron mediante RT-qPCR con cebadores específicos. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 versus control sin tratar, #p & lt; 0,05 frente al grupo de hIL-20. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. (D) células PC-3 se incubaron con hIL-20 (100, 200, o 400 ng /ml) durante 48 horas, se recogió el medio de cultivo y luego se determinó la concentración de sRANKL usando ELISA. * P & lt; 0,05 frente a los controles no tratados. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. las células (E) PC-3 se preincubaron con 1 M de catepsina G-inhibidor específico (TPCK) durante 1 hora y después se trataron con hIL-20 (400 ng /ml) durante 72 horas. El control del vehículo fue 0,0175% EtOH en medio de cultivo. La concentración de sRANKL se determinó usando ELISA. * P & lt; 0,05 frente a los controles no tratados, #p & lt; 0,05 frente a los controles del vehículo HIL-20 Plus EtOH. Los datos son la media ± SD de tres experimentos independientes, cada uno realizó por triplicado. RT-qPCR, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real; sRANKL, RANKL soluble; EtOH, etanol.
El crecimiento tumoral se inhibió en xenoinjertos de cáncer de próstata PC-3-7E tratados
Sobre la base de nuestra
in vitro
resultados, se determinó además la efectos de la 7E sobre el crecimiento del tumor de próstata
in vivo
en nuestro modelo de xenoinjerto en ratones. Células PC-3 fueron inyectados (sc) en ratones SCID, que se trata a continuación con PBS, mIgG (10 mg /kg, sc), o 7E (10 mg /kg, sc) inyecciones de 3 veces por semana, y el crecimiento del tumor se medido durante 40 días. Había menos crecimiento en el grupo tratado-7E que en el mIgG- y los grupos de control tratados con PBS (Fig 7A). Después de 40 días, los ratones se sacrificaron y se pesaron sus tumores. Los tumores en el grupo tratado con 7E pesaron menos que en el mIgG- y los grupos tratados con PBS (Fig 7B). Se aisló entonces el tejido tumoral de cada grupo para extraer el ARN. RT-qPCR mostró que la expresión de IL-20 en el grupo tratado-7E fue significativamente menor que en el mIgG- y los grupos de control tratados con PBS (Fig 7C). Además, la expresión de la catepsina G se downregulated en el grupo tratado-7E (Fig 7D).
(A-D) se inyectaron células PC-3 (s.c.) en las almohadillas de grasa mamaria de ratones SCID. Un día después, se inyectaron los ratones (s.c.) con PBS, 7E (10 mg /kg), o mIgG (10 mg /kg; n = 4 por grupo) tres veces por semana. (A) El tamaño del tumor se midió utilizando un calibrador. (B) Los ratones se sacrificaron 40 días después de que habían sido inyectados con células PC-3, y se recogieron y pesaron sus tumores. (C-D) muestras de tejido tumoral de cada grupo (n = 4) fueron aislados al final del experimento. La expresión de IL-20 y la catepsina G en el tejido tumoral se analizó mediante RT-qPCR con cebadores específicos. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 frente a los controles MIGG. Los datos son medias ± SD. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes con resultados similares. (E-F) de tratamiento 7E protegido contra la pérdida ósea y disminuye disminución de la densidad ósea en ratones intratibial osteolíticas PC-3-inyectado. las células PC-3 (2 × 10
5/100 l) se inyectaron lentamente en la cavidad de la médula ósea de la tibia. Los ratones fueron inyectados i.p. con PBS, 7E (10 mg /kg), o mIgG (10 mg /kg) (n = 5 en cada grupo) tres veces por semana. Controles sanos no fueron inyectados con las células cancerosas. (E) la metáfisis tibial se tomó de los ratones de control sanos y ratones con osteolisis inducida por PC-3. exploraciones micro-CT representativos se muestran para cada grupo. (F) Tibial DMO se midió y los resultados se expresaron en porcentajes relativos a los valores de control sanos. * P & lt; 0,05 frente a los controles MIGG. Los datos se muestran como medias ± SD. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes con resultados similares. DMO, la densidad mineral ósea; micro-CT, tomografía computarizada micro.
7E inhibe la osteolisis inducida por tumor en el PC-3 xenoinjertos de cáncer de próstata
En la progresión del cáncer de próstata, muchos pacientes finalmente desarrollan metástasis ósea . Sobre la base de nuestra
in vitro
datos, se especuló que la IL-20 podría promover mediante la regulación de la osteoclastogénesis sRANKL y expresión de catepsina G en células de cáncer de próstata. Por lo tanto, nos preguntamos si la inhibición de la IL-20 podría reducir la osteólisis inducida por el cáncer de próstata
in vivo
. Se inyectaron células PC-3 en la cavidad de la médula ósea de las tibias de ratones SCID, que luego se inyectaron (i.p.) con PBS, mIgG, o 7E tres veces por semana para los próximos 7 semanas. exploraciones Micro-CT, que se utilizan para examinar el efecto de 7E sobre la osteólisis inducida por el cáncer de próstata, mostraron que PC-3 osteólisis inducida por el cáncer se inhibió en el grupo tratado-7E en comparación con los grupos mIgG- y tratados con PBS (Fig 7E) . BMD fue significativamente menor en los grupos de control mIgG- y tratados con PBS que en el grupo de control sano;