Extracto
heparanasa es una enzima presente endoglicosidasa en leucocitos activados, mastocitos, tejido placentario, neutrófilos y macrófagos, y está implicado en la metástasis tumoral y la invasión de tejidos. Presenta un objetivo potencial para terapias de cáncer y diversas moléculas se han desarrollado en un intento de inhibir la acción enzimática de la heparanasa. En un intento de desarrollar una novela terapéutico con un ensayo de diagnóstico asociado, que hemos descrito previamente aptámeros seleccionados de alta afinidad en contra de la heparanasa. En este trabajo, hemos demostrado que estos aptámeros anti-heparanasa son capaces de inhibir la invasión de tejidos de células tumorales asociadas con el cáncer oral y verificó que tal inhibición es debida a la inhibición de la enzima y no debido a otros efectos potencialmente citotóxicos de los aptámeros. Además, hemos identificado un corto aptámero 30 bases como un candidato potencial para más estudios, ya que esto mostró una mayor capacidad para inhibir la invasión de los tejidos que su contraparte más tiempo, así como un potencial reducido para la formación de complejos con otras proteínas del suero no específicos. Finalmente, se encontró el aptámero para ser estable y por lo tanto adecuado para su uso en modelos humanos, ya que no mostró degradación en presencia de suero humano, por lo que es un candidato potencial para el uso diagnóstico y terapéutico
Visto.: Simmons SC, Jämsä H, D Silva, Cortez CM, McKenzie EA, Bitu CC, et al. (2014) Anti-heparanasa aptámeros como potenciales agentes de diagnóstico y terapéuticos para el cáncer oral. PLoS ONE 9 (10): e96846. doi: 10.1371 /journal.pone.0096846
Editor: Sophia N. Karagiannis, el Kings College de Londres, Reino Unido
Recibido: 27 de septiembre de 2013; Aceptado: April 11, 2014; Publicado: 8 Octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Simmons et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación: Dra. Bonacossa fue apoyado por una beca post-doctoral del Consejo Nacional de Pesquisa Científica - CNPq, en el ámbito del programa Ciencia sin Fronteras, MCTI, Brasil. El Dr. Missailidis desea reconocer el apoyo financiero del Consejo Nacional de Pesquisa Científica - CNPq, en el ámbito de un programa de estancias de investigación senior de la Fiocruz para la parte de este proyecto. El grupo de investigación del Prof. Salo fue apoyado por la Academia de Finlandia, el cáncer de Organizaciones finlandés, finlandés Sociedad Dental de Apolonia y la concesión del Hospital Universitario de Oulu Kevo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
heparanasa es una enzima β-1,4-endoglicosidasa [1] que participa en la matriz extracelular (ECM) la degradación y remodelación [1]. El gen heparanasa fue clonado por primera vez en 1999 por los grupos Vlodavsky y Parish en el seminal espalda con espalda Naturaleza documentos de medicina [2], [3].
El polipéptido naciente es un pre-pro-enzima 543 aminoácidos, los cuales después de la eliminación de la secuencia de péptido señal en el retículo endoplásmico, se somete a procesamiento proteolítico en endosomas tardíos /lisosomas por la catepsina-L como proteasas [4] en los sitios de Glu109-Ser110 y Gln157-Lys158, produciendo un N-terminal 8 polipéptido kDa, un C -terminal 50 kDa polipéptido y entre ellos un kDa polipéptido enlazador 6 [3]. Los polipéptidos de 50 y 8 kDa se asocian para formar una enzima activa heterodimérica, mientras que el 6 kDa enlazador se extirpó y se degrada [5], [6].
La actividad de heparanasa se asocia con leucocitos activados, mastocitos, tejido placentario y los macrófagos y la enzima es secretada por las células T CD4 + activadas [7], [8], [9], las plaquetas [3], neutrófilos y células metastásicas [10]. Tras la secreción de la heparanasa de las células tumorales metastásicas, la enzima hidroliza los enlaces glicosídicos de cadenas de heparán sulfato unidos a proteoglicanos a un producto de 10-20 unidades de azúcar de longitud [11], lo que lleva a la penetración de las células endoteliales de los vasos sanguíneos y los órganos diana por la célula tumoral. Liberación de citoquinas y factores de crecimiento ligados secuestrados por las cadenas de heparán sulfato en los tejidos [12] facilita aún más el crecimiento del tumor y promueve la angiogénesis y la proliferación de tumores secundarios [13]. Los niveles de expresión de la heparanasa en las células tumorales se correlaciona con su potencial metastásico; niveles elevados de ARNm y la proteína heparanasa se han encontrado en pacientes con cáncer que muestran los tiempos de supervivencia postoperatoria significativamente más cortos que los pacientes cuyos niveles de heparanasa son normales [13], [14].
heparanasa regulación al alza en células de cáncer de mieloma, linfoblastoide y el cáncer de mama refleja en el aumento de la secreción de exosomas con un contenido mejorado de syndecan-1, VEGF y HGF cuyas funciones están estrechamente relacionadas con la agresividad del tumor [15]. Además de su función en la progresión del cáncer, la enzima heparanasa también juega un papel importante en la inflamación
per se
y la carcinogénesis relacionada con procesos inflamatorios [16]. La enzima ha sido detectado en una variedad de células inmunes incluyendo las células T y B, macrófagos, neutrófilos y mastocitos. Se ha demostrado que mediar la extravasación a través de la barrera endotelial a través de la remodelación de ECM heparán sulfato, que entonces permite el tráfico a los sitios de inflamación [10], [17], [18]. expresión de heparanasa se ha relacionado con la tumorigénesis en un número de diferentes tipos de cáncer, por ejemplo, leucemia mieloide aguda [19], de la vejiga, cerebro [20], de mama [21], colon [22], gástrico [23], del esófago [24] , oral [25], de páncreas [14], y el cáncer cervical [26], lo que sugiere que puede ser un objetivo adecuado para la terapia de drogas. inhibidores disponibles en la actualidad de la heparanasa incluyen anticuerpos neutralizantes [27], péptidos [28] y pequeñas moléculas [29], [30].
Un número de heparinas modificadas y oligosacáridos sulfatados también han demostrado ser inhibidores de heparanasa potentes con actividades antitumorales prometedores y ahora han avanzado a las etapas de análisis clínicos. Ejemplos de estos incluyen SST0001, M402, PI-88 y PG545. SST0001 es una heparina modificada totalmente acetilado N-que carece de actividad anti-coagulante y demostró ser un inhibidor de la heparanasa selectiva. Actualmente se encuentra en fase I /II de ensayos clínicos para el tratamiento de pacientes con mieloma. M402 es una heparina modificada sulfatado-N que se une una gama más amplia de factores de crecimiento en comparación con SST0001. Esto ha progresado a la fase I /II de ensayos clínicos como un tratamiento de combinación con el agente de quimioterapia gemcitabina para el tratamiento de cáncer de páncreas metastásico. PI-88 es un polisacárido sulfatado con la actividad anti-angiogénica y anti-metastásico potente y con una reducción de la actividad anticoagulante no deseado. Se ha llegado a la Fase III de ensayos clínicos para el carcinoma hepatocelular después de la resección. PG545 es un tetrasacárido que tiene propiedades farmacocinéticas superiores debido a su alto grado de lipofilia. Se ha demostrado actividad antitumoral potente en modelos resistentes PI88, sin embargo, la Fase I de ensayos clínicos a finales de 2010 se abandonaron debido a las reacciones en el lugar de inyección inesperados [31].
Los aptámeros son desarrolladas de ADN o ARN oligonucleótidos cortos para el diagnóstico y el uso terapéutico que deben mostrarse alta afinidad de unión y especificidad para moléculas diana [32] - [34]. La afinidad de los aptámeros se ha comparado con la de los anticuerpos (es decir, en el intervalo nanomolar), pero como aptámeros son más pequeños (8-25 kDa en comparación con el tamaño de 150 kDa de anticuerpos), que puede tanto penetrar tejidos y se borren de la plasma los pocos minutos de la administración intravenosa sin desencadenar una respuesta inmune, que puede ser útil cuando ellos utilizando como agentes de diagnóstico [35]. Para uso terapéutico, son capaces de mantener su función y características de unión sobre la modificación con otros restos para mejorar su estabilidad y solubilidad, mientras que la reducción de su toxicidad y plasma aclaramiento de [35] - [38], [39] - [41]. Típicamente, los aptámeros son de 22 a 100 bases de longitud, y contienen una región de secuencia variable, flanqueado por secuencias conocidas, que se utilizan para los propósitos de amplificación e identificación. Un gran repertorio de diferentes combinaciones de secuencias (típicamente en la región de 10
15) en el dominio central crea muchos esquemas de plegado diferentes, la especificidad y afinidad de unión por moléculas diferentes. Los aptámeros son típicamente Elaborado a partir de la SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) procedimiento [42], aunque un número de otras metodologías de selección están disponibles en la actualidad [43] - [45].
Los aptámeros se generaron con anterioridad contra heparanasa recombinante humana activa mediante un protocolo serie y la sal de elución SELEX modificada. Selección produjo tres aptámeros, 1,5 M 'cortos', una versión truncada de 30 bases de '1,5 M de largo' (73 bases), y '3,0 M' (55 bases). ELISA y titulaciones de fluorescencia separan las dos aptámeros más largos que muestra mayor afinidad y reconocimiento de la heparanasa en células de la placenta, mientras que la tinción del tejido placentario favorecida '1,5 M de largo'. Esto se confirmó en un ensayo de invasión de Matrigel usando células de carcinoma de ovario previamente demostrado que requieren heparanasa para la invasión [46]. Dos aptámeros adicionales, denominados 'rosa' y 'amarilla' fueron seleccionados en contra de la secuencia del péptido enlazador de pro-heparanasa, ya que éstos pueden tener una función en la inhibición de la formación de la enzima heterodímero activo, mediante el bloqueo de la escisión del péptido de la proteasa.
En este estudio, se hicieron esfuerzos para caracterizar mejor los aptámeros seleccionados previamente y evaluar su potencial como agente de diagnóstico o terapéutico. La estabilidad del aptámero se evaluó por incubación en diferentes puntos de tiempo con electroforesis en gel de poliacrilamida utilizado para determinar la extensión de su degradación por las nucleasas presentes en el suero humano y suero de ratón, y. Un ensayo de invasión adicional, además del ratón anterior EHS-tumor derivado ensayo de invasión de Matrigel, se llevó a cabo usando uterino humano tejido leiomioma y células orales humanos de heparanasa que expresan escamosas de carcinoma (HSC-3), como este experimento representa una imagen más auténtica de lo que ocurre en el tejido humano. Además, un ensayo de proliferación de la citotoxicidad de células /células se realizó para verificar que cualquier inhibición de la invasión observó no era un resultado de la citotoxicidad por parte de los aptámeros. Finalmente, las interacciones de los aptámeros con proteínas de suero se investigó tanto para verificar la especificidad de los aptámeros y estudiar su potencial de transporte por tales proteínas en el torrente sanguíneo. El aumento de la literatura en el campo de aptámero de ADN ha demostrado que estas moléculas tienen un enorme potencial terapéutico en el tratamiento de la terapia del cáncer y ya se han utilizado como los llamados moléculas chaperonas para suministrar fármacos en células de cáncer (revisado en [47]). AS1411 es un ejemplo de un aptámero de ADN que ha progresado a las pruebas de ensayos clínicos. El aptámero en este caso se dirige específicamente a la proteína nucleolina y ha sido ensayado con metastásico, de células claras, los pacientes con carcinoma de células renales que han sido refractarios a los inhibidores de la tirosina quinasa anteriores [48].
Materiales y Métodos
cultivo de células
lengua humana células de carcinoma escamoso, HSC-3 (JCRB 0623; Instituto Nacional de Ciencias de la Salud de Osaka, Osaka, Japón), se cultivaron en medio de crecimiento: 50% de DMEM 50% de Ham F-12 (Sigma Aldrich) y, además, suplementado con ácido 50 mg /ml ascórbico, 250 /ml de anfotericina B ng, 5μg /ml de insulina (páncreas bovino), /ml de hidrocortisona 0,4 ng y suero bovino fetal inactivado por calor al 10%. El suplemento de cultivo se adquirieron de Sigma Aldrich. Todos los cultivos celulares se realizaron utilizando reactivos pre-calentado. Las células fueron incubadas en 95% de aire /5% de CO
2 a 37 ° C. Las células se pasaron mediante la eliminación de los medios y lavado con HBSS (Sigma Aldrich), a continuación, la adición de 3 ml 1 x de tripsina-EDTA (Sigma Aldrich) e incubando durante 5 minutos. La tripsina-EDTA se inactivó mediante la adición de 7 ml de medio de crecimiento y la eliminación de cualquier grupo de células. 1 ml de suspensión celular (más 24 ml de medio de cultivo fresco) se mantuvo en el matraz para el mantenimiento de las existencias y los restantes 9 ml se contó y se utiliza para los experimentos.
ensayo de invasión Organotípicos y análisis de los inhibidores de la invasión
el ensayo de invasión organotípicos y la cuantificación de los resultados se realizaron como se describe en Nurmenniemi
et al
. (2009) [49]. En pocas palabras, 7 × 10
5 HSC 3-células en suspensión en un medio que contiene el aptámero correspondiente (no relacionada, 1,5 M corto, de 1,5 m de largo, 3 H, rosa y amarillo) o un anticuerpo contra heparanasa (HPA Ab, 0,7 mM) . También (2- {4 - [(E) -3- (4-bromofenil) acriloilamino] -3-fluorofenil} benzooxazol-5-il) acético, abreviado a BAFB, se utilizó, ya que esto ha demostrado tener efectos inhibitorios a heparanasa en estudios previos [29] (Tabla 1). Se añadió cada aptámero o anticuerpo a 1 M a la suspensión de células HSC-3 en el inicio del estudio y en los medios de cultivo de células HSC-3 durante todo el experimento. discos mioma sin HSC-3 células y HSC-3 células sin inhibidor también se incluyeron en el ensayo como controles. Los discos se incubaron durante 14 días a 37 ° C con 5% de CO
2 con los medios que contienen los inhibidores apropiados. Se recogieron los medios de comunicación, se centrifugan, y los medios frescos con inhibidores se cambiaron en los días 4, 7, 10 y 14. A partir de los sobrenadantes de los medios recogidos, los productos de degradación del tipo de tejido del mioma se analizaron mediante radioinmunoensayo colágeno III SP99 (RIA) de C- telopéptido terminal (IIICTP) y telopéptido N-terminal (IIINTP) inmunoensayos enzimáticos indirectos (EIA) para telopéptido N-terminal, siguiendo los métodos descritos en Nurmenniemi
et al
. ([49], para RIA y [50] para EIA). En el día 14, los discos mioma se fijaron en paraformaldehído al 4% y se prepararon para el análisis inmunohistoquímico. Seis micras cortes histológicos de discos mioma se tiñeron con anticuerpo monoclonal pancytokeratin (Dako, clonar AE1 /AE3 a una dilución 1:150) y observar bajo un microscopio con un aumento de 100x. Nueve imágenes representativas fueron tomadas de cada una de las tres repeticiones de cada tratamiento. Se analizaron las imágenes como se describe en Nurmenniemi
et al.
(2009) [49]. Las diferencias en el área de la invasión y la profundidad se evaluaron mediante la prueba t de Student y la prueba de Mann-Whitney y los valores de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
La proliferación celular ensayo
para determinar el efecto del aptámero '1,5 M corto' sobre la proliferación celular HSC-3, se utilizó el CellTiter 96 acuoso ensayo de proliferación celular (Promega), un ensayo MTS. Aproximadamente 1 x 10
4 células se sembraron por triplicado en una placa de 96 pocillos con 1μM de corto aptámero. Después de 24, 48 y 72 h, se añadieron 20 ml de CellTiter 96 Aqueous Solution un reactivo a cada pocillo y se incubaron las células durante 1 hora a 37 ° C en un 5% CO
2 incubadora. La absorbancia registrado a 490 nm en un lector de placas Optima FLUOstar fue utilizado como una representación del número relativo de células vivas en el cultivo.
estabilidad en suero de ensayo
Los aptámeros 1,5 M 'corta', ' 1,5 m de longitud "y" 3,0 M 'se incubaron a una concentración de 5 mM con suero humano y de ratón para el 30, 60, 120, 180, 240 y 300 minutos a 37 ° C. Después, la reacción se detuvo mediante la adición de EDTA 100 mM y los productos corrió en un gel de poliacrilamida nativo al 12%, junto a una escalera de marcadores de ADN de 25 pb. Los geles se tiñeron utilizando bromuro de etidio y se observan bajo luz UV.
unión
La albúmina sérica
albúmina de suero bovino (BSA) se adquirió de Sigma-Aldrich Ltd (Gillingham, Reino Unido, código de producto A7030 10 g ). UV experimentos se llevaron a cabo en un Bio-Tek Uvikon XL con un Peltier Thermosystem para el control de la temperatura y la instalación de agitación, conectado al PC utilizando el software Lab Junior Power para la recolección y análisis de datos. Fluorímetro se utiliza un Horiba Jobin Yvon Fluoromax-P equipado con un contador de fotones y el sistema Peltier para el control de la temperatura y la instalación de agitación, acoplado a un PC utilizando el software de Datamax para el análisis espectral. Se tomaron mediciones iniciales para verificar la presencia o ausencia de la emisión fluorescente de los dos aptámeros de longitud de onda de excitación de 290 nm (selectiva para residuos de triptófano) y longitudes de onda de emisión entre 300 y 400 nm. Ambos aptámeros se titularon en agua y 10 mM de soluciones de tampón de fosfato pH 7,4, a 37 ° C. La concentración de aptámero corto 1,5 M varió desde 0,3 hasta 8,0 M, y la larga aptámero 1,5 M varió desde 0,5 hasta 8,0 M, que muestra la fluorescencia intrínseca de estos aptámeros. Ambos aptámeros presentan espectros de emisión de fluorescencia en este rango. pruebas anteriores mostraron que las concentraciones de aptámero que varía de 0,1 mg /ml a 8 mg /ml no interferir en la evaluación de la albúmina de extinción [51]. mediciones de temple se tomaron en 1 ml de 6 M albúminas en tampón de fosfato de pH 7,4. Espectros de emisión se registraron 300 a 400 nm de longitud de onda, después de un tiempo de reacción de 90 segundos de cada adición aptámero. Tanto el ancho de banda de emisión y excitación se establece en 3 nm. Aptámero se añadió de una solución madre concentrada de modo que el incremento de volumen era insignificante. Los experimentos se realizaron a 37 ° C, pH 7,4.
para evaluar cualquier efecto existentes primarios y /o secundarios interiores de filtro (IFES), los procedimientos de corrección sobre la base de mediciones de absorbancia de las soluciones se realizaron a longitudes de onda de excitación y emisión de albúmina . Este efecto consiste en la absorción de la radiación de excitación y /o emitida por especies disueltas, incluido el propio fluoróforo [52]. medición de la absorbancia de las soluciones aptámeros /albúmina en longitudes de onda de excitación y emisión de albúmina mostró que el efecto de filtro interno causado por la absorción de la radiación emitida era insignificante.
Resultados
Los aptámeros anti-heparanasa inhiben la invasión de células de carcinoma
La invasión de HSC-3 células se estudió con un modelo mioma organotípicos humana [49] la exposición de las células de carcinoma de diversos aptámeros (no relacionada, 1,5 M corto, de 1,5 m de largo, 3 M, Rosa y amarillo) o anticuerpo de la heparanasa (Hpa Ab) (Fig. 1A). Los efectos de estos compuestos en comparación con el control (sin inhibidor) en el área invasión (calculado sobre la base de la m-área de células invasoras) y la profundidad de la invasión (la distancia desde la superficie inferior de la capa de células no invasiva para la célula invadida más profundo) eran analizados (Fig. 1B y C). Aptámero 1,5 M corta disminuyó significativamente el área total invasión (p = 0,0001), similar a Hpa Ab, que se utilizó como un control inhibidor de invasión positivo [27]. Por el contrario, ninguno de los otros compuestos tuvo un efecto sobre HSC-3 invasión (Figura 1). La profundidad de la invasión se redujo significativamente sólo después del tratamiento Hpa Ab (p = 0,0001) (Figura 1C). En base a los resultados anteriores, la degradación del colágeno tipo III por HSC-3 células medido con RIA picos de 7 a 11 días [49]. Del mismo modo, los medios analizados por RIA de día 4 no mostraron diferencias entre ninguno de los tratamientos (no mostrados). El cambio de medio después de la terminación del experimento en el día 14 mostró sólo la significación estadística del tratamiento sin células añadidas (p = 0,001; no se muestra). La degradación de colágeno de tipo III sin inhibidores fue más alta en los días 7 (no se muestra) y 10 (Figura 2A-D). En el día 10, el tratamiento con anticuerpo heparanasa inhibió significativamente la degradación en comparación con el control no relacionado (p = 0,07 en RIA, y p = 0,03 en EIA). El día 10 hubo una inhibición significativa de 1,5 M corta (p = 0,004 en RIA, y p = 0,007 en EIA) y 1,5 m de longitud (p = 0,02 en RIA, y p = 0,03 en EIA) en comparación con el control HSC-3 . Sin embargo, 3 M, Rosa, y aptámeros amarillas, así como BAFB no mostraron disminución significativa en la cantidad de productos de degradación de colágeno, lo que indica que no fueron exitosos inhibidores de la invasión
A:. Incluido en parafina 14- día mioma secciones organotípicos se tiñeron para el marcador pancytokeratin AE1 /AE3 para analizar HSC-3 invasión después de varios tratamientos: sin inhibidor, Hpa Ab, (el anticuerpo heparanasa policlonal como control positivo), aptámero no relacionado, (seleccionado contra un objetivo implicados en la enfermedad de Alzheimer enfermedad), aptámeros anti-heparanasa 1,5 M corta, de 1,5 m de largo y 3 M; aptámeros de péptidos de engarce rosa y amarillo. La barra de escala es de 100 micras. Las diferencias en la zona de invasión (B) y la profundidad de invasión (C) después de varios tratamientos (n = 27 /tratamiento). Las estadísticas se realizaron como se muestra de dos
t-test
y Mann-Whitney
A:. EIA (IIINTP inmunoensayos enzimáticos indirectos) detectar telopéptido N-terminal del colágeno tipo III productos de degradación en el día 10 de cambio de medio. El aumento de absorbancia significa menos producto de degradación de colágeno presente. Hpa Ab (p = 0,03), 1,5 M corto (p = 0,007) y 1,5 m de largo (p = 0,03) mostró aumento significativo en la absorbancia en comparación con ningún inhibidor, lo que sugiere que han inhibido la invasión de HSC-3 células. B: El gráfico muestra los valores anteriores de EIA ajustados para el control negativo en el día 10 de cambio de medio. C: RIA (radioinmunoensayo para el colágeno tipo III) detectar telopéptido C-terminal en el día 10 de cambio de medio. El aumento de los niveles significan menos producto de degradación de colágeno. Hpa Ab (p = 0,07), 1,5 M corta (p = 0,004) y 1,5 m de longitud (p = 0,02). D: RIA ha confirmado los ensayos de EIA que muestran los productos de degradación de colágeno significativamente inferior a la de los tejidos sin inhibidor añadió, indicando que eran inhibidores de éxito de la invasión
El corto aptámero anti-heparanasa no presenta ninguna. citotoxicidad
se estudió la citotoxicidad de los aptámeros seleccionados sobre HSC-3 células, para verificar que la inhibición de la invasión observado en el modelo organotípico fue el resultado de la inhibición de la heparanasa, que se han verificado previamente [46] y no teléfonos citotoxicidad. El ensayo MTS se llevó a cabo más de 72 horas, con una sola adición del aptámero en el principio del ensayo, y las mediciones en los intervalos de duración de 24, 48 y 72 hrs. No se observó ningún cambio en el crecimiento celular y la viabilidad celular entre las células que se añadió aptámero y el control (véase la Figura 3). Sólo los aptámeros que mostraron inhibición de la invasión se ensayaron para determinar la citotoxicidad, para investigar si el efecto inhibidor observado fue debido a la citotoxicidad o la inhibición de la heparanasa. Los aptámeros que no inhiben la invasión de células claramente no tienen efecto sobre las células y por lo tanto no había ninguna razón para ser más estudiado para la citotoxicidad.
Se encontró que la presencia de aptámero a una concentración de 1 mM a tener ningún efecto sobre la el crecimiento celular en comparación con el control.
el corto aptámero anti-heparanasa no se une significativamente a las proteínas séricas
corto y largo aptámeros 1,5 M se titularon inicialmente por etapas en agua y fosfato solución tampón, pH 7,4 a 37 ° C para investigar su fluorescencia intrínseca. Ambos aptámeros tienen fluorescencia intrínseca con picos a 380 nm, lo que aumenta la intensidad de fluorescencia a un aumento correspondiente de la concentración de aptámero; A corto que muestra la fluorescencia menos que el aptámero de largo (Figura 4A y B). Se usó agua como diluyente para mostrar que el aptámero y no solución tampón de fosfato fue la causa de la fluorescencia, a pesar de la fluorescencia para el corto aptámero aumentó en el uso de solución de tampón fosfato como diluyente. Sin embargo, esto era probablemente debido a una diferencia en el pH como en la espectroscopia de fluorescencia cambios de pH tienen una influencia significativa en los resultados.
fluorescencia aumenta al aumentar la concentración de aptámero en tanto fosfato y agua, que muestra que, aunque la fluorescencia es más alto en fosfato, el aptámero es, de hecho, la causa y la diferencia de pH en agua y PBS es la razón más probable para el aumento de la fluorescencia del aptámero en PBS.
el corto aptámero fue capaz de apagar la fluorescencia de HSA a 37 ° C por 1,5% (± 0,03%) y 9% (± 1,2%) a 1:100 y 1:10 relaciones molares respectivamente, con enfriamiento rápido de 10% logrado por una concentración molar 9,1 veces más bajos de HSA (Figura 5). Largo aptámero es capaz de extinguir la fluorescencia de HSA por 10% a una concentración de 18,2 veces menor que HSA, y por 2,4% (± 0,1%) y 16% (± 0,6%) a 1:100 y 1:10 relaciones molares. Los resultados muestran que ambos aptámeros son capaces de extinguir la fluorescencia de HSA, aunque el largo aptámero fue más eficaz. HSA temple indica que los aptámeros alcanzan IIA dominio secundario, donde se encuentra su única triptófano. Este residuo de triptófano se encuentra en el sitio 214 en subdominio IIA, dentro de la cual hay una gran cavidad hidrófoba con muchos residuos de arginina cerca de la superficie [53], que se ha demostrado en diversos estudios para servir como puntos de anclaje para los aptámeros [54].
onda de excitación 290 nm, [HSA] = 6 M. longitud de onda de excitación a 290 mM en una solución de fosfato de sodio. Los datos son la media de seis valores que no muestran una mayor desviación estándar del 11%. El efecto de enfriamiento es más considerable para larga que corta aptámero.
Para obtener más información sobre el tipo de interacción que se produce entre los aptámeros y HSA, las valoraciones de espectrometría UV se llevaron a cabo mediante titulación de concentraciones crecientes de corta y aptámeros de largo y 6 M HSA diluido en tampón de fosfato de pH 7,4, como se muestra en la Figura 5. la adición de ambos aptámeros de tampón de fosfato y HSA aumentó la absorbancia en general, lo que demuestra que el aptámero era responsable de este incremento en lugar de HSA. El aumento fue más pronunciado para el largo aptámero en el corto aptámero, y ambos produce un cambio de la absorbancia máxima a la izquierda después de la adición de concentraciones crecientes de aptámero.
El cambio observado desde el aptámero corto (Figura 6A ) movido 6 nm, a la izquierda, lo que sugiere que sólo un ligero cambio conformacional en la proteína se estaba produciendo [55] y por lo tanto, HSA de temple por este aptámero es más probable debido al enfriamiento dinámico. Sin embargo, en el caso de la larga aptámero (Figura 6B), no sólo no había un cambio sustancial en la absorción máxima de 20 nm a la izquierda, pero se observó un cambio completo en la forma del pico, que incorpora el pico a 260 nm del aptámero, lo que sugiere que un complejo se formó y que el enfriamiento rápido era debido al fenómeno de enfriamiento estático con aptámeros de largo [55]. Por lo tanto, las titulaciones UV sugirieron que el corto aptámero no forma un complejo con HSA y que las interacciones se deben a temple dinámico, mientras que se sugirió el largo aptámero para formar un complejo de estado fundamental con HSA, en contraste con otros aptámeros previamente estudiados, que también muestran una especificidad y la formación de complejos sólo con su proteína diana [56]. Este trabajo se ha ampliado y se ha calculado la interacción de los aptámeros con proteínas de suero y la posición específica de su interacción y publicado por separado, ya que no estaba dentro del alcance de este artículo [57].
los aptámeros son estables en suero humano
para evaluar la idoneidad de los aptámeros como agentes terapéuticos, era necesario tener una comprensión de la estabilidad de los aptámeros no modificados estarían en el cuerpo, ya que, en el torrente sanguíneo solamente, hay muchos nucleasas capaces de degradar los aptámeros. Por lo tanto, para verificar la estabilidad de los aptámeros en el suero humano, hemos caracterizado cualquier producto de degradación mediante electroforesis en gel. Comparación de las bandas en los geles de 1,5 M corto aptámero se incubaron durante diferentes puntos de tiempo con suero humano y de ratón, con la de aptámero sólo mostró que 1,5 M corto aptámero no estaba sujeto a la degradación por nucleasas de suero humano como las bandas no mostraron manchas o disminuir en tamaño o intensidad en comparación con sólo aptámero, y por lo tanto, no se observó descomposición del aptámero en fragmentos más pequeños (datos no mostrados). Con suero de ratón, sin embargo, hubo una disminución en la intensidad de la banda primaria en el tiempo de incubación de cinco horas, lo que sugiere que las nucleasas han degradado el aptámero en ese momento.
Discusión
En este estudio hemos explorado el potencial de los aptámeros seleccionados previamente contra heparanasa como prometedores agentes diagnósticos y terapéuticos contra el cáncer oral. Los aptámeros fueron previamente demostrado tener una alta afinidad contra heparanasa y eran funcionales en un ensayo de Matrigel. En estos estudios iniciales, se encontró que los aptámeros más largos tenían una mayor afinidad por heparanasa y habían obtenido buenos resultados en microscopía de fluorescencia y ensayos de invasión de Matrigel. Sin embargo, cuando se examinaron estos aptámeros en el ensayo de invasión organotípicos y analizado su potencial para bloquear la invasión, se encontró que la corta aptámero era mucho más capaz de hacerlo, en comparación con sus homólogos de largo. Esto también se verificó mediante el análisis por RIA y EIA de los productos de degradación de tejido mioma, a saber, tipo III C- colágeno y telopéptido N-terminal, respectivamente. El M corto 1,5 y 1,5 m de largo aptámeros consisten en la misma región variable y, de hecho, el corto es una versión truncada de la larga. Sin embargo, parece que, aunque la larga tiene una afinidad ligeramente más alta, probablemente debido al aumento de las interacciones entre la proteína y las partes de imprimación de la aptámero, estos resultado en la reducción de la capacidad de estos aptámeros para inhibir la invasión de tejidos. La presencia de varias proteínas en el tejido real, en comparación con el experimento Matrigel realizado previamente, puede ser la razón para esto, como la larga aptámero puede formar otras interacciones con tales proteínas, o las colas de cebadores puede tener un efecto de impedimento estérico en la tejido, lo que no es evidente en el modelo de matrigel más simple. Esto, de hecho, fue confirmada por el estudio de las interacciones entre los dos aptámeros y proteínas de suero. En estos estudios se encontró que el largo aptámero forma un complejo con la albúmina de suero humano, mientras que el corto aptámero no forma un complejo y mostró sólo un enfriamiento dinámico limitado. En un estudio adicional [57], hemos modelado de las interacciones de los aptámeros cortas y largas con HSA y hemos identificado que, efectivamente, el largo aptámero forma un complejo con albúminas de suero en un solo sitio de unión, cerca de Trp 214 de HSA o 212 de BSA, en el subdominio IIA de estas proteínas, en una cavidad de carga positiva forrado con lisina y arginina residuos [57]. Se ha demostrado que las especies de aptámero más cortos carece de la capacidad de formar complejos con proteínas de suero y exposiciones de este modo una mayor especificidad por su diana, lo que justifica nuestra elección de usarlo en cualquier desarrollo terapéutico o de diagnóstico adicional y está de acuerdo con los datos mioma presentados en este trabajo. Una de las características más importantes de este estudio es la demostración de que las modificaciones post-SELEX puede ser más beneficioso para la selección de aptámeros de pasos iniciales contra-selección, cuando ello sea posible. En una serie de estudios con diferentes metodologías de detección, la afinidad del aptámero por su objetivo ha sido comparada con la de la albúmina.