Extracto
Objetivos
REIC /DKK-3 es el regulado en una amplia gama de células de cáncer humano y se considera para funcionar como un supresor de tumores. Hemos informado anteriormente de que REIC /DKK-3-expresando vector de adenovirus (Ad-REIC) inducida por el retículo endoplasmático (ER) y la apoptosis específica del cáncer en el cáncer de próstata humano. En este estudio, hemos examinado el impacto terapéutico de Ad-REIC sobre el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).
Materiales y Métodos
Se examinó el efecto antitumoral de Ad-REIC en 25 líneas celulares de cáncer
in vitro Opiniones y células A549
in vivo
. Dos de estas líneas celulares se establecieron artificialmente como inhibidor de EGFR de tirosina quinasa (TKI) sublíneas resistentes.
Resultados
Ad-REIC-tratamiento inhibe la viabilidad celular en un 40% o más en 13 ( 52%) de las líneas celulares 25 en multiplicidad de infección (MOI) de 20 (20 MOI). Estas líneas celulares fueron considerados como células altamente sensibles. La viabilidad de las células de una línea celular inmortalizada no maligna, oums-24, no se inhibió en 200 MOI de Ad-REIC. Los efectos de Ad-REIC en sublíneas resistentes EGFR-TKI fueron equivalentes a los de las líneas celulares de sus padres. Aquí, hemos demostrado que el tratamiento con Ad-REIC activado c-Jun N-terminal quinasa (JNK) en líneas celulares de cáncer, lo que indica la inducción de estrés ER con GRP78 /BIP (GRP78) sobre regulación y que resulta en la apoptosis. Una sola inyección intratumoral de Ad-REIC inhibió significativamente el crecimiento tumorigénico de las células A549
in vivo
. Como factores predictivos de sensibilidad para el tratamiento con Ad-REIC en el CPNM, se analizó el estado de la expresión del receptor de GRP78 y el virus Coxsackie y adenovirus (CAR). Hemos encontrado que la combinación de los estados de GRP78 y expressional coche puede ser utilizado como un factor predictivo para la sensibilidad Ad-REIC en las células NSCLC.
Conclusión
Ad-REIC la activación de JNK inducida por la apoptosis y la posterior en células de NSCLC. Nuestro estudio indica que Ad-REIC tiene un potencial terapéutico contra el NSCLC y que los estados de expresión de GRP78 y CAR puede predecir un beneficio terapéutico potencial de Ad-REIC
Visto:. Shien K, Tanaka N, Watanabe M, Soh J, Sakaguchi M, Matsuo K, et al. (2014) Efectos anticancerígenos de REIC /DKK-3-vector adenoviral que codifica para el tratamiento de células no pequeñas cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (2): e87900. doi: 10.1371 /journal.pone.0087900
Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 4 de diciembre de 2013; Aceptado 30 de diciembre de 2013; Publicado: 3 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Shien et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. No hay corriente fuentes de financiación para este estudio
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo , y la forma metastásica es un factor importante que conduce a la mortalidad [1]. Hay dos grandes subtipos histológicos de cáncer de pulmón: cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y cáncer de pulmón de células pequeñas. intensos estudios recientes han identificado alteraciones moleculares causantes que han conducido directamente al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas y han mejorado el pronóstico del paciente [2]. Por ejemplo, las mutaciones del gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico (
EGFR
) se encuentran en aproximadamente 30% de NSCLC, especialmente en adenocarcinomas de pulmón, e inhibidores de quinasa del EGFR-tirosina (TKIs) son particularmente eficaces en estos tumores [ ,,,0],3], [4]. Más recientemente, crizotinib ha demostrado ser eficaz para NSCLC con un
EML4-ALK
gen de fusión [5], [6]. Sin embargo, el número de pacientes con estas alteraciones es limitado, y poca mejora en el pronóstico se ha obtenido en NSCLCs sin estas alteraciones sensibles a fármacos. Además, la resistencia adquirida con el tiempo se produce en la mayoría de los
EGFR
tumores -mutant, que habían respondido previamente a EGFR-TKI, después de una media de 10 meses de tratamiento [7]. Por lo tanto, se necesita una nueva modalidad terapéutica para mejorar el resultado clínico de los pacientes con cáncer de pulmón
.
REIC /DKK-3, un miembro de la Dickkopf (DKK) la familia de genes, se encontró originalmente en células inmortalizadas y tiene ha informado que es un supresor de tumor; su expresión es significativamente baja regulado en una amplia gama de tipos celulares de cáncer, incluyendo cáncer de pulmón [8]. La imagen de mapa de calor del ARN mensajero (ARNm) de expresión de
REIC /DKK-3
gen de la UCSC Genoma del Cáncer en Examinar, que está disponible gratuitamente base de datos pública (https://genome-cancer.ucsc.edu/) (hemos descargado los datos el 16 de julio de 2013), mostró que
REIC /DKK-3 de expresión génica
se redujo en la mayoría de las muestras examinadas tanto de los adenocarcinomas de pulmón y carcinomas de células escamosas en comparación con los tejidos pulmonares normales (Figura S1) . Además, podría confirmarse a partir de una base de datos pública que la expresión de
REIC /DKK-3
también fue baja en muchas líneas celulares de cáncer (Gene Expression Omnibus repositorio [http: //www.ncbi.nlm.nih .gov /geo, GEO GSE4824 adhesión]). REIC /DKK-3 se sabe para interferir con la señalización de Wnt a través de receptores de Wnt [9], [10] y se informó anteriormente para jugar un papel distinto en la inducción de apoptosis y la inhibición de metástasis [11], [12]. La inducción de la apoptosis en células de cáncer es causado principalmente por el estrés del retículo endoplásmico (ER) inducida por la sobreproducción de REIC /DKK-3 en las células. estrés ER desencadena la activación de la quinasa c-Jun N-terminal (JNK), que es un evento crítico en la apoptosis inducida por la sobreproducción de REIC /DKK-3 usando un vector de adenovirus (Ad-REIC) [11], [13] . En nuestros estudios anteriores, hemos encontrado que Ad-REIC tuvo un efecto terapéutico en varios tipos de cáncer humano, incluida la próstata, testículos, la pleura, y carcinomas de mama [11], [13] - [15]. infección Ad-REIC y proteína REIC /DKK-3 también son conocidos por un máximo de regular la immunosystem anti-tumor [16]. Con base en los datos preclínicos, un ensayo clínico utilizando Ad-REIC para el cáncer de próstata humano ha estado en curso en Japón y los EE.UU. (NCT01197209).
En este estudio, se investigó el efecto terapéutico de Ad-REIC en las células NSCLC
in vitro
y
in vivo
. También se examinaron los factores relacionados con la sensibilidad de las líneas celulares de Ad-REIC como un paso hacia el desarrollo de la terapia Ad-REIC personalizada para pacientes con NSCLC.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo de la Universidad de Okayama (Número de Permiso: Oku-2012-549). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia ketamina y xilacina, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Las líneas celulares
Dieciséis líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón humano, 3 carcinoma de células escamosas, carcinoma de células grandes 3 , 1 carcinoma de células adenoescamoso, sublíneas 2 EGFR-TKI-resistentes de HCC827 y células (HCC827-GR-ALTA2 y RPC-9) PC-9, la línea celular mesotelioma humano MSTO-211H (211H), y la célula de fibroblasto humano normal se utilizaron la línea de oums-24 en este estudio (Tabla 1). Los detalles de las líneas celulares utilizadas en este estudio se describen en el Método S1. El HCC827-GR-elevados2 y RPC-9 líneas celulares se establecieron como se ha descrito anteriormente [17], [18]. se estableció oums-24 en nuestra institución [19].
vector de adenovirus con REIC /DKK-3
REIC /DKK-3 se sobreexpresa utilizando un adenovirus (Ad-REIC) que hemos generado anteriormente [11]. Un ADNc de longitud completa de REIC /DKK-3 se integró en un pAxCAwt vector cósmido y se transfiere a un vector de adenovirus por el método de COS-TPC (Takara Bio, Shiga, Japón). Un gen LacZ adenovirus vector que lleva (Ad-LacZ) también se utilizó como control [11].
viabilidad de las células de ensayo
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1,5 × 10
3 células /pocillo a las 48 h después de la infección con Ad-LacZ o Ad-REIC a una multiplicidad de infección (MOI) de 20, 100, o 200 MOI. La viabilidad celular se evaluó 3 días más tarde usando un ensayo de MTS con acuoso CellTiter 96 Una solución del reactivo (Promega, Madison, WI).
Apoptosis ensayo
Para examinar el
in vitro
inducción de la apoptosis después del tratamiento, se sembraron las células en placas de 6 pocillos y se les incubó durante 24 h. Las células fueron tratadas con Ad-LacZ o Ad-REIC a 20 MOI en medio libre de suero (500 l) durante 2 h; a continuación, el medio se cambió por medio completo fresco (2 ml). Después de 48 h adicionales de incubación, se añadió colorante Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) al medio a una concentración de 2 mg /ml, y las células se incubaron en la oscuridad durante 10 min. Hoechst 33342 es un colorante intercalante que permite la determinación de las variaciones en la cantidad total de la cromatina y el grado de condensación de la cromatina [15]. El uso de microscopía de fluorescencia, se identificaron células apoptóticas por la presencia de núcleos altamente condensados o fragmentados. Las células apoptóticas se contaron en 5 campos diferentes en observación microscópica.
Western blot
El protocolo detallado para el análisis de Western blot se describe en el Método S1. Se realiza en condiciones convencionales usando los siguientes anticuerpos: anticuerpo de conejo REIC /DKK-3 anti-humano se crió en nuestro laboratorio [11]; GRP78 de conejo anti-humano /BIP (GRP78) (ab21685; Abcam, Cambridge, MA); SAPK de conejo anti-humano /JNK (# 9252) y conejo anti-humano fosfo-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185;#9251) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA); conejo anti-humana por el virus Coxsackie y adenovirus receptor (CAR) (HPA030411; anticuerpos Atlas, Estocolmo, Suecia); y el ratón anti-actina (MAB1501; Millipore, Billerica, MA). Se usaron los siguientes anticuerpos secundarios: de cabra anti-conejo o peroxidasa de rábano picante anti-ratón IgG conjugado (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Para detectar las señales específicas, las membranas fueron examinadas usando ECL plus reactivos de detección de transferencia Western (Amersham Biosciences UK Limited, Buckinghamshire, UK). Además, las intensidades de las bandas de GRP78, CAR, y la actina, que representa sus niveles de expresión, se midieron utilizando el software ImageQuant TL (GE Healthcare Bioscience) y se cuantificaron mediante GRP78 o la relación de CAR /actina.
ensayo de crecimiento tumoral en vivo
células A549 (5 × 10
6 en 50 l de solución salina tamponada con fosfato [PBS]) se mezcla con 50 l de Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de la hembra adulta /nu ratones Balb /c nu (CLEA Japan, Tokio, Japón). El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula empírica V = 1/2 x [(el diámetro más corto)
2 × (el diámetro más largo)]. Cuando los tumores habían alcanzado aproximadamente 50-100 mm
3, los ratones (n = 15) fueron divididos aleatoriamente en 3 grupos de tratamiento: (a) PBS; (B) Ad-LacZ; y (c) Ad-REIC. Los virus (1 × 10
9 pfu) en 100 l de medio libre de suero se administraron por vía intratumoral. Al final de los experimentos, los ratones fueron sacrificados después de 24 días después de la inyección vírica y se recogieron los tumores, se miden y se fotografiaron.
análisis estadísticos
Todos los datos se analizaron utilizando STATA ver.12 (Stata Corporation, College Station, TX). se aplicó en su caso la prueba exacta de Fisher. Para una comparación de la inducción de la apoptosis entre REIC-tratados con Ad y las células A549 tratadas con Ad-lacZ, una estadística Cochran-Mantel-Haenszel se aplicó para comparar. medidas repetidas ANOVA se aplicó para la comparación de tamaños de los tumores de NSCLC xwnotransplantado entre PBS, Ad-LacZ y Ad-REIC.
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado significativo. Todas las pruebas fueron de dos caras.
Resultados
Efecto de Ad-REIC en líneas celulares NSCLC
Se examinó la inhibición de la viabilidad celular utilizando Ad-REIC y un ensayo de MTS . En 13 (52%) de 25 líneas celulares de cáncer, tratamiento de Ad-REIC a 20 MOI inhibió la viabilidad celular (40% de inhibición -60%), en comparación con el tratamiento con Ad-LacZ (Tabla 1, Figura 1). Estas líneas celulares fueron considerados como altamente sensibles a Ad-REIC. En contraste, 12 líneas celulares (48%) no fueron inhibidos por tratamiento con Ad-REIC a 20 MOI y eran considerados como células resistentes. Oums-24 no se inhibió en 20 o 200 MOI de Ad-REIC. De nota, el tratamiento Ad-REIC en 100 y 200 MOI mejorado la inhibición de la viabilidad celular (100 MOI: 15% de inhibición -59%, 200 MOI: 40% de inhibición -78%), en comparación con el tratamiento con Ad-LacZ (Tabla 1) . Por lo tanto, definimos 20 MOI como un valor de MOI baja y 200 MOI como un valor alto MOI. A modo de comparación, tratamiento con Ad-REIC también se llevó a cabo en el 211H línea celular humana mesotelioma, que ya se ha informado a ser ad-REIC sensibles [14]. El 211H no se inhibió en 20 MOI pero se inhibió en 200 MOI de Ad-REIC (Tabla 1). Las características moleculares conocidas de cada línea celular se muestran en la Tabla 1. Las 25 líneas celulares de cáncer consistieron en 8
EGFR
-mutant, 6
KRAS
-mutant, 1
HER4
-mutant, 1
ANR
-mutant, 1
PIK3CA
-mutant, 1
EML4-ALK sobre fusion, 1
HER2
-amplified, y 6 líneas de células sin alteraciones genéticas en la lista. Nueve de los 17
EGFR
líneas celulares de tipo -wild eran sensibles a Ad-REIC. HCC827 y su sublínea resistente, HCC827-GR-elevados2, mostraron un grado similar de sensibilidad a Ad-REIC. Hay una tendencia en el genotipo molecular se observó entre las líneas celulares sensibles y no sensibles. Estos resultados sugieren que el efecto de Ad-REIC no depende de un genotipo molecular conocido.
Las tasas de inhibición de 25 líneas celulares de cáncer transfectadas con Ad-REIC comparación con Ad-LacZ se muestran como barra de negro en 20 MOI y la barra blanca en 200 MOI. Trece líneas celulares con tasa de inhibición de más del 40% en 20 MOI se definen como altamente sensible y 12 líneas celulares con menor tasa de inhibición en 20 MOI se definen como resistente. Todas las líneas celulares resistentes muestra sobre la tasa de inhibición de 40% en 200 MOI. Las líneas celulares se clasifican en 3 categorías en función del nivel de expresión de GRP y la proteína CAR de la siguiente manera; Categoría A (baja GRP /alta CAR), la categoría B (bajo GRP /CAR de bajo o alto GRP /alta CAR), la categoría C (GRP alta /baja CAR). Todas las 8 líneas celulares altamente sensibles se incluyeron en la categoría A, y las 5 líneas celulares resistentes se incluyeron en la categoría C. Sq; El carcinoma de células escamosas, AD; adenocarcinoma, LC; carcinoma de células grandes, ADSQ; El carcinoma de células adenoescamosa, MM; mesotelioma maligno, Fondo Nacional de Salud; fibroblasto humano normal.
Hoechst 33342 tinción se realizó en las células A549 para examinar la inducción de la apoptosis. se observaron células apoptóticas en las células A549 tratadas con Ad-REIC (Figura 2a). La tasa media de apoptosis fue 22%, y fue significativamente (p & lt; 0,001 por la prueba de Cochran-Mantel-Haenszel). Aumentaron en comparación con el control de tratamiento Ad-LacZ
(a) Inducción de la apoptosis después de
in vitro
Ad-REIC trato en lo examinó en las células A549 utilizando Hoechst 33342 tinción. El panel superior indica la aparición de células apoptóticas después del tratamiento con Ad-REIC. El panel inferior muestra la tasa de apoptosis de las células A549 después del tratamiento indicado. Un total de 5 campos diferentes se examinaron bajo un microscopio para determinar la tasa de apoptosis. Se observó una diferencia significativa (* p & lt; 0,001) entre el Ad-LacZ y el tratamiento Ad-REIC. (Bar: 100 micras) (b) análisis de transferencia de Western de las proteínas implicadas en la transducción de señal desencadenada por Ad-REIC. Las células se recogieron a las 48 h después de la transfección con Ad-LacZ o Ad-REIC a 20 MOI. (C) células H460, que son resistentes a la transducción de adenovirus, se recogieron a las 48 h después de la transfección con Ad-LacZ o Ad-REIC en 20, 100, y 200 MOI.
El efecto de recombinante proteína REIC /DKK-3 en las líneas celulares de NSCLC se examinó en 7 líneas celulares seleccionadas al azar (NCI-H522, NCI-H611, NCI-H1299, NCI-H1819, NCI-H2009, PC-9, y A549). El ensayo MTS mostró que la proteína REIC /DKK-3 no afectó la viabilidad celular en las líneas celulares examinadas cuando se administra a una concentración que varía de 1 a 200 mg /ml (datos no presentados).
Expresión de GRP78 y CAR en respuesta a la terapia Ad-REIC
Como factores predictivos de sensibilidad Ad-REIC en el CPNM, se analizó la expresión de GRP78 y CAR; estos estados de expresión se correlacionan con la inhibición de la viabilidad celular por Ad-REIC en 13 líneas celulares. Un estudio informó de que la sobreexpresión de GRP78 inhibida ER-estrés, que puede estar opuestamente correlaciona con el efecto de Ad-REIC. la expresión del coche está estrechamente asociada con la eficacia de la infección por adenovirus, que puede estar correlacionada positivamente con el efecto de Ad-REIC. Western Blot se realizó, y el nivel de expresión se cuantificó como muestran en la Tabla 1 y la Figura 1. La mediana (rango) de GRP78 y expresiones CAR fueron 0.24 (desde 0,075 hasta 0,98) y 0,60 (0,080 a 2,1), respectivamente. Basándose en estos datos, se definieron las células con un nivel de expresión GRP78 más de 0,25 como expresión alta CRP78, mientras que aquellos con una GRP78 menos de 0,24 se definieron como baja expresión GRP78. En cuanto a la CAR, 15 líneas de células significativamente alto nivel de expresión de CAR (más de 0,50) se define como la expresión de alta CAR, mientras que 10 líneas celulares con esos significativamente bajo nivel de expresión del coche (en 0.20) se definieron como expresión baja CAR. expresión GRP78 fue baja en 8 de las células 13 Ad-REIC-sensibles (62%) y en 4 de las células 12 Ad-REIC-resistentes (33%). expresión de CAR fue alta en 12 de las 13 células Ad-REIC-sensibles (92%) y en 3 de las células Ad-12 REIC-resistentes (25%).
A continuación, se clasificaron las líneas celulares en tres categorías en función de los estados de GRP78 y la expresión del coche; células con una expresión /CAR Bajo Alto GRP78 fueron clasificados en la categoría A, los que tienen baja GRP78 CAR /o expresión baja /alta de coches de alta GRP78 fueron clasificados en la categoría B, y los que tienen expresión /CAR Bajo Alto GRP78 fueron clasificadas como Categoría C. las altas tasas de células sensibles fueron del 100% en la categoría a (8 de 8, 95% intervalo de confianza [IC]: 63-100), 42% en la categoría B (5 sobre 12, IC del 95%: 15-72), y 0% en la categoría C (0 de 5, IC del 95%: 0-52) (Tabla 2). Las categorías se asociaron significativamente con la sensibilidad al tratamiento con Ad-REIC (p & lt; 0,01).
JNK y expresión GRP78 en líneas celulares de cáncer tratados con Ad-REIC
Un Western Blot el análisis demostró la expresión significativa de proteínas REIC /DKK-3 en 14 líneas celulares de cáncer tratados con Ad-REIC. En 9 líneas de células infectadas con 20 MOI, tratamiento con Ad-REIC dio lugar a la fosforilación de JNK y la sobre regulación de GRP78 (Figura 2b). En los otros 8 líneas celulares, que eran relativamente resistentes a Ad-REIC, la activación de JNK y GRP78 se observaron valores más altos de MOI (100 y 200 MOI) (Figura 2c).
Efecto de Ad-REIC en tumores de NSCLC en un modelo de xenotrasplante
Se investigó el efecto de Ad-REIC en el crecimiento de las células A549
in vivo
. Una semana después del trasplante, cuando el volumen del tumor alcanzó 50 a 100 mm
3, 1 × 10
9 unidades formadoras de placa de Ad-REIC o Ad-lacZ en 100 l de PBS o 100 l de PBS solo eran inyectada por vía intratumoral. Los tumores crecieron progresivamente en los grupos de tratamiento con PBS y Ad-lacZ durante el período de observación posterior de 24 días. En contraste, el crecimiento del tumor en el grupo de tratamiento con Ad-REIC fue significativamente (p & lt; 0,001 por medidas repetidas ANOVA). Suprimidas durante el período de observación (Figura 3a, b)
(a) El volumen medio de la tumores de xenoinjertos subcutáneos se calculó para 5 ratones en cada grupo. Se observó una diferencia significativa entre los resultados de Ad-REIC y tratamiento con Ad-LacZ (* p & lt; 0,001 por medición repetida de ANOVA). (B) La aparición de los tumores en el momento del sacrificio después del tratamiento con PBS, Ad-LacZ y Ad-REIC.
Discusión
En el presente estudio, se encontró que ad-REIC era efecto directo en más de la mitad de las líneas celulares de cáncer que se examinaron, independiente de sus alteraciones de controladores conocidos como
EGFR Opiniones y
KRAS
mutaciones. Un modelo animal de xenoinjerto también mostró el efecto terapéutico de Ad-REIC. El efecto anti-tumor de Ad-REIC depende de la activación de JNK ER-estrés mediada cargado por la sobreproducción de la proteína REIC /DKK-3, lo que resulta en la inducción de la apoptosis [14], [20]. La activación de JNK, que es un paso esencial en la inducción de estrés ER y apoptosis por Ad-REIC, se observó a 20 MOI en líneas celulares de cáncer. Por otro lado, no se observó el efecto antitumoral de la proteína REIC /DKK-3 recombinante, como en otros tipos de cánceres que fueron examinados previamente. Originalmente, REIC /DKK-3 fue identificado como una proteína secretora y se supone que ejerza una función fisiológica, pero su receptor de superficie celular y su papel como una proteína de secreción no se han identificado.
define 20 como MOI un valor MOI baja y 200 MOI como un valor alto MOI porque los oums-24 línea celular de fibroblastos humanos normales no se inhibió en 20 o 200 MOI de Ad-REIC, mientras que se inhibieron líneas de células malignas cuando el valor de MOI se elevó a 100 y 200 MOI en líneas celulares en las que Ad-REIC había sido ineficaz a 20 MOI. En CPNM, Ad-REIC fue efectivo en un valor MOI baja en más de la mitad de las líneas celulares que se probaron. Teniendo en cuenta el resultado de que 211H fue inhibida solamente en un valor alto MOI, Ad-REIC podría ser más eficaz en el CPNM que en el mesotelioma.
La selección de pacientes basándose en las características moleculares de las células tumorales es un tema importante para maximizar la beneficio terapéutico y reduciendo al mínimo los efectos adversos. Con este fin, nos hemos centrado en la expresión GRP78 y la expresión del coche niveles. GRP78 es un miembro de la familia Hsp70, que sirve como un regulador de ER estrés de señalización [21]. Un estudio previo demostró que la sobreexpresión de GRP78 confiere resistencia a una amplia variedad de agentes quimioterapéuticos en diversos tipos de células [22]. También puso de manifiesto que el clon de la resistencia adquirida de las células PC-3 a Ad-REIC establecido después de la exposición repetida a Ad-REIC exhibió un alto nivel de expresión de GRP78, en comparación con PC-3 células de los padres [13]. En teoría, Ad-REIC debe ser eficaz para las células tumorales definidos en la Categoría A y no es tan eficaz para los que se definen en la Categoría C. Aunque se identificaron las células sensibles de la categoría B, los 8 células de la categoría A respondió a tratamiento con Ad-REIC. Estos resultados sugieren que los estados de expresión de GRP78 y coche en tumores podrían ser útiles como biomarcadores para la terapia Ad-REIC personalizado en el CPNM, mientras que una confirmación adicional que se necesita de una gran investigación a escala utilizando diversos tipos de líneas celulares.
un tema reciente de tratamiento para el cáncer de pulmón, EGFR-TKI han demostrado ser eficaces para el tratamiento de
EGFR
NSCLCs -mutant. Sin embargo, la resistencia adquirida a EGFR-TKI después del tratamiento con ITC es un problema que hay que superar. En el estudio actual, nuestros resultados muestran que el efecto de Ad-REIC contra las células EGFR-TKI resistentes adquiridos era igual a la contra las células parentales, lo que sugiere que Ad-REIC puede ser útil después de la adquisición de resistencia a EGFR-TKI.
Aunque los vectores de adenovirus que llevan genes supresores de tumores apropiados, tales como REIC /DKK-3, tienen un gran potencial para la terapia génica del cáncer, no exhiben especificidad objetivo y por lo tanto también pueden infectar las células normales en las proximidades de las células de cáncer . Los autores informaron que la infección de los fibroblastos humanos normales (NHF) con Ad-REIC no causó la apoptosis de sí mismo NHF, pero en lugar indujeron la producción de interleucina (IL) -7. Cuando infectadas Ad-REIC NHF se mezclaron con las células de cáncer no tratados y la mezcla fue trasplantado en ratones, el crecimiento de las células cancerosas se suprimió significativamente, lo que sugiere un efecto-tumor supresor indirecta de Ad-REIC mediada por IL-7 [20] . Estos hallazgos muestran que la infección mis-dirigida de células del estroma cáncer por Ad-REIC activa el sistema inmune a través de la producción de IL-7. Además, los autores informaron que REIC /DKK-3 proteína juega un papel de citoquinas como en la diferenciación de monocitos en células dendríticas-Doble Características
in vitro
y que la infiltración de CD11c- y CD8-positivas (dendríticas y no se observó marcadores de las células T asesinas, respectivamente) dentro de las células de los tumores tratados
in vivo
. En el experimento usando un modelo de tumor de próstata ortotópico con pre-establecido metástasis de pulmón, el número de tumores pulmonares metastásicos disminuyó significativamente después de la inyección de Ad-REIC en el sitio del tumor primario, además de la inhibición del crecimiento de los tumores de próstata ortotópico, lo que sugiere que lucha contra el cáncer inmunológico sobre regulación de tratamiento con Ad-REIC en sitios de tumor primario desencadena efectos antitumorales, incluso en el sitio tumoral a distancia [16]. Estos hechos sugieren fuertemente que REIC /DKK-3 muestra un efecto indirecto anti-tumor a través del sistema inmune anti-tumor que es un factor importante en el tratamiento de la enfermedad metastásica. Debido a que Ad-REIC tiene efectos tanto directos como indirectos en la terapia del cáncer, puede ser una opción terapéutica potente como un "uno-bala, y dos brazos" agente anti-cáncer, especialmente para NSCLC, que a menudo hacen metástasis a otros órganos.
en lo que respecta al uso clínico, ya que nuestros datos sugieren que los estados CAR y de expresión GRP78 en las células tumorales predicen la respuesta del tratamiento con Ad-REIC, tratamiento con Ad-REIC se debe realizar preferentemente para los pacientes que están clasificados como de grupo sensible a principios de fase del tratamiento con dosis bajas de Ad-REIC. Para los pacientes cuyas células tumorales revelar eficacia intermedio o pobres con dosis bajas de Ad-REIC, debe ser de fase tardía en el tratamiento con altas dosis de Ad-REIC. Para estos pacientes, la rentabilidad para el tratamiento y la evolución clínica debe ser considerado cuidadosamente. Como para la estrategia de la administración, la administración local puede ser preferible en lugar de administración sistémica para reducir al mínimo el efecto adverso en situaciones clínicas. Hemos confirmado previamente en el modelo de ratón que Ad-REIC podría ser ampliamente distribuida en los cuerpos después de la administración local intratumoral, y la administración local fue eficaz no sólo directamente, sino también indirectamente a través del efecto del sistema inmunológico [16], [23]. Además, la administración local intrapleural podría ser otra estrategia de administración para los pacientes con derrame pleural maligno. Se ha informado de que la administración intrapleural de la terapia génica mediada por adenovirus es un enfoque útil para la generación de respuestas inmunes anti-tumorales en el mesotelioma maligno y derrame pleural metastásico en varios ensayos clínicos [24], [25].
en conclusión, hemos demostrado que Ad-REIC inducida por la activación de JNK y la posterior apoptosis en células de NSCLC con independencia del tipo de alteraciones moleculares conocidos o la sensibilidad a EGFR-TKI. El presente estudio sugiere que Ad-REIC tiene un potencial terapéutico para el NSCLC, y los estados de expresión de GRP78 y CAR puede ser un predictor de la terapia Ad-REIC.
Apoyo a la Información
Figura S1.
La imagen de mapa de calor de la expresión del ARNm de
REIC /DKK-3
gen. El nivel de expresión de ARNm de
REIC /DKK-3
gen se obtuvo de la UCSC Genoma del Cáncer en Examinar, que está disponible gratuitamente base de datos pública (https://genome-cancer.ucsc.edu/) (que descargó el los datos el 16 de julio de 2013), demostraron que
REIC /DKK-3
la expresión génica se redujo en la mayoría de las muestras examinadas de ambos (a) adenocarcinomas de pulmón y (b) los carcinomas de células escamosas, en comparación con los tejidos pulmonares normales.
doi: 10.1371 /journal.pone.0087900.s001 gratis (PDF)
Método S1.
Información complementaria sobre las líneas celulares y análisis de transferencia de Western
doi:. 10.1371 /journal.pone.0087900.s002 gratis (DOC)