Extracto
α-solanina, un esteroide glicoalcaloides en patata, se encontró que tenía la proliferación de la inhibición de la apoptosis y el efecto de promoción en múltiples células de cáncer, tales como clon, el hígado, las células de cáncer de melanoma. Sin embargo, la eficacia antitumoral de la α-solanina sobre el cáncer de páncreas no ha sido plenamente evaluado. En este estudio, hemos investigado el efecto anti-cancerígeno de α-solanina contra las células de cáncer de páncreas humanos. En el presente estudio, se investigó el efecto anti-cancerígeno de α-solanina contra las células de cáncer de páncreas humanos. In vitro, inhibió la proliferación α-solanina de PANC-1, SW1990, MIA PaCa-2 células de una manera dependiente de la dosis, así como la migración celular y la invasión con dosis atóxicos. La expresión de MMP-2/9, inductor de metaloproteinasas de matriz extracelular (EMMPRIN), CD44, eNOS y E-cadherina fueron suprimidas por α-solanina en las células PANC-1. Por otra parte, la disminución significativamente la expresión y el tubo de formación vascular factor de crecimiento endotelial (VEGF) de las células endoteliales se disciernen después del tratamiento α-solanina. fosforilación de Akt, mTOR, y STAT3 suprimida, y fortalecer la fosforilación de β-catenina se encontró, junto con una marcada disminución tran-nuclear de NF-kB, β-catenina y TCF-1. Tras la administración de α-solanina (6 mg /g durante 2 semanas) en el modelo de xenoinjerto, el volumen del tumor y el peso se disminuyó en un 61% y 43% (p & lt; 0,05) respectivamente, que muestran la disminución de MMP-2/9, PCNA y VEGF expresión. En conclusión, α-solanina mostró efectos beneficiosos sobre el cáncer de páncreas in vitro e in vivo, lo que puede a través de la supresión de la proliferación de vía, la angiogénesis y la metástasis
Visto:. Lv C, Kong H, Dong G, Liu L, Tong K, Sun H, et al. (2014) Eficacia antitumoral de α-solanina contra cáncer pancreático in vitro e in vivo. PLoS ONE 9 (2): e87868. doi: 10.1371 /journal.pone.0087868
Editor: Jia Yu-Chang, de la Universidad de Medicina de Taipei, Taiwán
Recibido: 2 Octubre, 2013; Aceptado: December 26, 2013; Publicado: 5 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Lv et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio contó con el patrocinio de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de china (Nº 81070372, Nº 81370563), Programa Provincial de Zhejiang para el cultivo de talentos de alto nivel de salud innovadores y una Administración Provincial de Medicina tradicional china de la provincia de Zhejiang, china (NO. WKJ2012-2 -033, Nº 2011ZA072), un Programa de Investigación y Desarrollo del Distrito de Longwan Distrito de Wenzhou, Zhejiang, china (Nº 2010YS5). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma de páncreas es una de las enfermedades más agresiva y letal debido a la falta de un diagnóstico precoz, resistencia a las drogas y el mal pronóstico, y como tal es la cuarta causa de mortalidad por cáncer en todo el mundo [1], [ ,,,0],2]. Actualmente, el tratamiento estándar del carcinoma de páncreas depende de la cirugía, la radiación y las drogas. Sin embargo, sólo alrededor del 25% de los pacientes con cáncer de páncreas diagnosticado con la forma resecable atribuir a la invasión de la enfermedad [3]. Gemcitabina, un tratamiento estándar de primera línea del cáncer de páncreas metastásico al presidente, es ampliamente utilizado, pero muestra pobre efecto terapéutico para la adquisición de la quimio-resistencia y una variedad de reacciones adversas [4]. Por lo tanto, la búsqueda de nuevos medicamentos eficaces contraponer para mejorar la capacidad anti-angiogénico y frenar la metástasis se necesita desesperadamente para el cáncer de páncreas, apuntando sus tumores más altamente vascularizados e invasoras.
Además de la inducción de la apoptosis de las células del cáncer y necrosis , la inhibición de la proliferación celular, la infiltración y la metástasis es de primordial importancia. metástasis tumoral es un proceso muy coordinada que es promovido por diversas enzimas proteolíticas que degradan la matriz extracelular (ECM) y la membrana basal (BM). Se cree que las metaloproteinasas de la matriz (MMPs) de dominar participar en la migración de células tumorales, invasión de tejidos y metástasis [5]. MMP-2 y MMP-9 desempeñan un papel clave en el proceso de metástasis entre los MMPs. molécula de adhesión celular E-cadherina, la regulación de la polaridad celular, la diferenciación, la proliferación y la migración a través de su íntima asociación a la red del citoesqueleto de actina [6], muestra una menor expresión en el cáncer pancreático que en el tejido pancreático normal [7]. Además, Wnt /β-catenina cascada de señalización ha sido pertinente para el cáncer y la proliferación vascular, la especificación del destino y la metástasis de las células. ligando Wnt se une a su receptor Frizzled para inactivar el complejo destrucción β-catenina, lo que lleva a la acumulación de β-catenina no fosforilada tanto en citoplasma y núcleo. En el núcleo, β-catenina forma un complejo heterodimérico con la familia TCF /LEF de las proteínas de unión a ADN y por lo tanto activa la transcripción de genes diana de Wnt, comprometiendo c-Myc, survivin, cyclinD1, y MMPs [8]. Estudios recientes han demostrado que la fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) -Akt /diana de la rapamicina en mamíferos (mTOR) vía también está implicado en tumores endocrinos pancreáticos (PET) tumorigénesis y la progresión [9], [10], la supervivencia celular, la adhesión celular y la metástasis [11], [12]. A través de la interferencia con Wnt, NF-kB y vías de MAPK, Akt /mTOR actividad promueve la proliferación de células de cáncer, la inhibición de la apoptosis y la metástasis [13], [14]. Además, las proteínas Stat constitutivamente activadas se encuentran en múltiples tumores [15], [16], [17], [18]. Por otra parte, Wnt /β-catenina y vías /mTOR Akt regulan la expresión de MMPs por factores de transcripción, como NF-kappa B [19], [20]. Más pruebas de que NF-kappa B desempeña un papel clave en la proliferación, la inhibición de la apoptosis y la angiogénesis del cáncer de páncreas [21]. Por lo tanto, el bloqueo de Wnt /β-catenina y vías /Akt mTOR, así como estadísticas y NF-kB proporcionar objetivos potenciales para estrategias terapéuticas contra el cáncer.
α-solanina, un componente bioactivo de los principales glicoalcaloides esteroidales en las patatas se bien estudiado por su impacto en las propiedades antitumorales. Varios informes han demostrado que la inhibición del crecimiento exposiciones a-solanina y la inducción de la apoptosis en múltiples células del cáncer [22], [23]. La evidencia también muestra α-solanina poseen efectos anti-inflamatorios en vitro mediante la reducción de la interleucina-2 y la interleucina-8 producciones [24]. La eficacia y los mecanismos moleculares asociados debido a la a-solanina contra el cáncer de páncreas no han sido evaluadas aún. Por lo tanto, se evaluó la eficacia de α-solanina que utiliza el cáncer de páncreas, tanto in vitro como in vivo en el presente estudio.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
En este estudio , cuidado de los animales y los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo aprobado por la inspección de ética Animal Experimental de Laboratorio Animal Centre, Wenzhou Medical College (Permiso Número: wydw2013-0001). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
1. Línea celular y Reactivos
α-solanina, dimetilsulfóxido (DMSO) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). kit de ensayo de proteína se obtuvo de Bio-Rad Labs (Hercules, CA, EE.UU.). medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y se adquirió de Gibco /BRL (Gaithersburg, MD, EE.UU.). Matrigel fue de BD Biosciences (Bedford, MA, EE.UU.). kit de extracción de ARN total y el kit de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) procedían de Viogene (Sunnyvale, CA, EE.UU.). Los anticuerpos contra MMP-2, MMP-9, E-cadherina, TCF-1, STAT3 y STAT3 fosforilado se adquirieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE.UU.). Los anticuerpos contra la β-actina, VEGF, PCNA, β-catenina, Akt, mTOR, proteínas fosforiladas se adquirieron de Abcam (Cambridge, MA, EE.UU.). PANC-1, SW1990, MIA PaCa-2 y células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA, EE.UU.). líneas celulares de cáncer de páncreas se mantienen en DMEM con 10% de FBS y se incubaron en un CO 5%
2 incubador humidificado a 37 ° C, HUVECs se cultivaron en medio M199 con 10% de FBS. a-solanina se fundió en DMSO y se diluyó con medio de cultivo (la concentración final de DMSO fue de menos de 0,1%).
2. Viabilidad de la célula de ensayo y Colonia Ensayo
Siembra de 20.000 células de cada línea celular de cáncer en cada pocillo de placa de 96 pocillos y sustitución del medio de cultivo que contiene diversas concentraciones de α-solanina (3,6,9,12 g /l) después de 24 h. Continuando a desarrollar durante 24 y 48 h, a continuación, el medio se reemplazó con la inclusión medio fresco de 10% CCK8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japón). Después de 1-4 h, los sobrenadantes se midieron por espectrofotometría a 450 nm.
independiente del anclaje crecimiento celular se evalúa mediante la realización de ensayo de colonias (GENMED SCIENTIFECS INC, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. En resumen, 1,5 ml Base Agar Matrix capa se dispensa en cada pocillo de una placa de 12 pocillos (muestras se analizaron por triplicado). Placa se enfrió a temperatura ambiente hasta que se solidifiquen. A continuación se añadió 1,5 ml capa de agar de crecimiento que constaba de 2500 células en cada pocillo. Placa se enfrió a temperatura ambiente hasta que la fase de crecimiento se congeló. Se añadió una 500 l medio de cultivo que contiene además varias concentraciones de α-solanina en la parte superior de la capa de crecimiento. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO
2 se contaron por 2 semanas y colonias totales.
3. Migración celular y la invasión ensayos
La migración celular se estudió mediante la realización de ensayos de curación de heridas. 10.000 células de cada línea celular de cáncer de páncreas se sembraron en altas 35 mm mu-platos con insertos de cultivo (ibidi, Martinsried, Alemania). Cuando las células crecieron hasta confluencia, insertos se eliminan posteriormente con pinzas estériles para crear un campo herida de aproximadamente 500 micras. Después de retirar los restos celulares con PBS, las células se expusieron a diversas concentraciones de α-solanina para 24 h. La migración celular se percibe por microscopio invertido y se fotografía (100 aumentos). El área de la herida fue escalado por Image Pro Plus. El porcentaje de cierre de la herida se calculó mediante la ecuación: Cierre de la herida% = [1- (área de la herida después de 24 h /zona de la herida después de 0 h) x 100%
se llevaron a cabo ensayos de invasión celular utilizando cámaras transwell 6,5 mm. equipada con membranas de policarbonato de tamaño de poro 8,0 m. En estos ensayos, los champán superiores se recubrieron primero con 50 l de Matrigel a una dilución 1:05, y se incubaron a 37 ° C durante 2 h. Después de tratarse con α-solanina de 24 h las células, libres de suero se cargaron (10.000 células /pocillo) medio de suspensión de cada línea celular de cáncer de páncreas en la cámara superior de la transwell. Las cámaras inferiores se rellenaron con DMEM 500 l suplementado con 10% FBS. Después de incubación a 37 ° C durante 6 h, las células no invasivas se rasparon físicamente de la membrana con los hisopos de algodón. Las células invasoras se tiñeron con DAPI durante 5 minutos y se observaron con un microscopio de fluorescencia (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). células fluorescentes se contaron usando Image Pro Plus.
4. In Vitro Ensayo de angiogénesis
Análisis de la formación de capilares se realizó mediante ensayos de formación de tubo (ibidi, Martinsried, Alemania) según las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, a 15 μ-Slides así se recubrió con 10 l de Matrigel, que se dejó solidificar a 37 ° C. Para evaluar el efecto de α-solanina, las células PANC-1 se trataron con diversas concentraciones de α-solanina durante 24 h, después se recogió el medio acondicionado. HUVEC se pusieron en el pozo μ-Slide y se incubaron con medio condicionado de las células PANC-1 por 6 h. La generación de redes celulares fueron fotografiados y evaluado cuantitativamente por Image Pro Plus.
5. Cuantitativa en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa
ARN total fue extraído de PANC-1 con el reactivo TRIzol (Ambion, Carlsbad, California, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN total (1 g) de cada muestra se sometió a RT cebada con oligo-dT con ReverTra Ace qPCR RT kit (Toyobo, Osaka, Japón). En tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó para un análisis cuantitativo de MMP-2, MMP-9, VEGF, EMMPRIN, E-cadherina y la expresión CD44 mRNA utilizando SYBR Green en tiempo real PCR Master Mix (Toyobo) en un tiempo real 7500 PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 95 ° C durante 1 min, 40 ciclos a 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 60 s. El primer secuencias de GAPDH, MMP-2, MMP-9, VEGF, ENOS, EMMPRIN, E-cadherina y CD44 fueron sintetizados a partir de Invitrogen y se enumeran en la Tabla 1. Análisis de cuantitativa en tiempo real PCR se realizó datos sobre los valores Ct.
6. Extracción de proteínas y Western Blot Analysis
células Panc-1 se lisaron en tampón de ensayo radioinmune precipitación (RIPA) que contiene la proteasa y inhibidor de fosfatasa (Roche, Basilea, Suiza). proteínas nucleares y citoplasmáticas se extrajeron con el nucleares y citoplasmáticas de extracción Reactivos (Beyotime, Jiangsu, China) según las instrucciones del fabricante. Las proteínas se fraccionaron mediante electroforesis en geles de dodecilsulfato de sodio de sulfato-poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de PVDF (Solarbio). Las membranas se bloquearon con leche en polvo desnatada al 5% se incubaron con anticuerpos relevantes durante la noche a 4 ° C. A continuación, las membranas se lavaron tres veces con TBST y se incubaron con anticuerpos secundarios durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con TBST, se detectaron bandas de destino utilizando ECL (Advansta, Menlo Park, California, EE.UU.) y se expusieron en una película. La densidad de las bandas de proteínas se midieron por Cantidad Uno.
7. El análisis de MMP-2 y MMP-9 Actividades por gelatina Zymography
Las actividades de MMP-2 y MMP-9 se ensayaron por zimografía de gelatina. células PANC-1 se incubaron con medio libre de suero con diversas concentraciones de α-solanina para 24 h. a continuación, se recogió y se concentró el medio acondicionado. Cada muestra (20 g) se mezcló con tampón de carga y se sometió a 10% de gel de SDS-poliacrilamida que contiene 0,1% de gelatina. La electroforesis se realizó a 100 V durante 1,5 h a 4. Los geles entonces se lavaron con tampón de lavado (2,5% de Triton X-100, 50 mmol /L Tris-HCl, 5 mmol /L CaCl
2, pH7. 6), seguido de incubación a 37 ° C en tampón de reacción (50 mmol /L Tris - HCl, 5 mmol /CaCl2, 0. 02% de Brij-35, pH 7,6). Después de 42 h, los geles se tiñeron con azul de Comassie (0,05% Comassie azul, 30% de metanol, 10% de ácido acético) durante 3 h y se destiñeron con solución decolorante (20% de metanol, ácido acético 10%, 70% ddH2O) hasta que la se visualizaron las bandas claras.
8. Animales y tumores
atímicos (nu /nu) ratones desnudos masculinos se obtuvieron del Laboratorio de Shangai. Centro de Investigación Animal (Shanghai, China) y alojados en condiciones normales de laboratorio (condiciones pathogenfree con un 12 h luz /12 h oscuridad calendario). Para producir animales tumorales, 5 × 10
6 células PANC-1 se inyectaron por vía subcutánea en los flancos de cuatro semanas de edad nu /nu ratones macho atímicos. Cuando los tumores eran medibles, los ratones se dividieron en dos grupos (6 /grupo) aleatoriamente. cuidado de los animales y los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo aprobado por el Animal Experimental Inspección Ético de Laboratorio Animal Centre, Wenzhou Medical College.
9. Método de tratamiento y el tumor Estudio xenoinjertos
El grupo de control, en el que se inyectó 1 l /g (peso de los ratones) de DMSO en la cavidad abdominal de cada ratón; el grupo solanina, en el que se inyectó 1 l /g (peso de los ratones) solanina de la misma manera. La concentración de solanina es 5 g /l. Solanina tenía una seguridad notable a la dosis de 5 mg /g (peso de los ratones), y no hubo diferencias clínicas e histológicas entre el tratamiento y los grupos de control [25]. Cada grupo fue tratado con fármaco 1 vez por día durante dos semanas. El peso corporal de los ratones y sus tamaños tumorales se midieron cada día. Los ratones se sacrificaron 2 semanas después de la administración del fármaco y los tumores se separaron cuidadosamente y se pesaron. El volumen del tumor se calculó por la fórmula: 0,5236 L1 (L2)
2, en donde L1 es largo diámetro, y L2 es el diámetro corto. Parte del tumor se usó para transferencia de Western y se almacena en 4% de paraformaldehído para inmunohistoquímica, y el resto se congeló en nitrógeno líquido.
10. Western Blot para la MMP-2 y MMP-9 y la tinción inmunohistoquímica para PCNA y VEGF
La proteína xenoinjerto procedimiento de extracción del tumor y de los procesos de tratamiento es igual que la que se ha mencionado anteriormente. secciones de 4 micras contiguos fueron cortadas de parafina embebido tejidos tumorales para inmunohistoquímica. Las secciones se bloquearon con suero de cabra y se inmunotiñeron después de la desparafinación y rehidratación. Las secciones fueron incubadas con una dilución 1/200 de anticuerpo primario contra PCNA o VEGF durante la noche a 4 ° C, seguido por incubación con anticuerpos secundarios durante 60 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se desarrollan con diaminobenzidina y de contraste con hematoxilina. El índice de proliferación (por 400 × campo microscópico) se determinó como el número de células PCNA positivas /número total de células x 100. La densidad óptica integrada (IOD), se analizó para la cuantificación de VEGF. 6 campos fueron seleccionados al azar de cada sección. a continuación, se compararon los niveles medios de IOD entre dos grupos. Se utilizó la imagen-Pro Plus 6.0 del software para el análisis.
11. Análisis estadístico
Todos los análisis se llevaron a cabo por el software SPSS17.0. Los datos mostrados son imágenes representativas o expresados como medias ± S.E.M. de cada grupo. Se analizó la diferencia entre los grupos de células mediante ANOVA, y se utilizó la prueba t para muestras independientes para el análisis entre los grupos en vivo. P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
1.. α-solanina afecta a la viabilidad celular y la formación de colonias Inhibe
Hemos encontrado que el tratamiento de la α-solanina (3,6,9 g /l) durante 24 h o 48 h no cambió la viabilidad de PANC-1 , SW1990 y las células MIA PaCa-2 significativamente (Fig. 1A). La viabilidad celular se redujo significativamente después del tratamiento de α-solanina a 12 mg /l. Los resultados revelaron que la citotoxicidad de las células de cada línea celular no fueron causados por α-solanina a los 3, 6, 9 mg /l durante 24 hy 48 h. Se utilizó dosis no tóxicas de α-solanina para los experimentos in vitro.
Las células (A) de cada línea celular de cáncer fueron tratados con diferentes concentraciones de α-solanina para 24 hy 48 h. (B) Fotos de crecimiento celular independiente de anclaje de la PANC-1 (100 aumentos). se cuantificaron (C) El número de colonias y los datos se calcula a partir de tres experimentos independientes. Cada barra representa la media ± S.E.M. (N = 3). ** P & lt;. 0,01, en comparación con el control
Para dilucidar las funciones de α-solanina en el crecimiento independiente de anclaje de células de cáncer de páncreas, se utilizó un ensayo de agar blando. Las células sin tratar formado más y más grandes colonias de células tratadas con alfa-solanina (Fig. 1B, C), lo que indica que el crecimiento independiente de anclaje de células de cáncer pancreático α-solanina fue inhibida por α-solanina de una manera dependiente de la dosis.
2. α-solanina inhibe la migración celular y la invasión
Heridas ensayo de curación y transwell ensayo de invasión se realizó para observar el efecto de α-solanina en maigratoin celular y la invasión. Los resultados mostraron que α-solanina migración y la invasión de células de cáncer pancreático suprimido de una manera dependiente de la dosis (Fig. 2).
Las células se trataron con varias concentraciones de α-solanina para 24 h. Las células fueron fotografiadas (A) (100 aumentos). (B) El área de la herida se cuantificaron en cuatro campos de cada tratamiento, y los datos se calcula a partir de tres experimentos independientes. (C) Las células se fotografiaron (100 × maginfication). (D) Las células invadidas se cuantificaron contando fo células DAPI-manchado. Cada barra representa la media ± S.E.M. (N = 3) * p & lt;. 0.05, ** p & lt; 0,01, en comparación con el control
3.. α-solanina inhibió la formación del tubo de PANC-1 inducida por ECS y expresión de VEGF
Se encontró que el medio condicionado de células PANC-1 induce la formación de tubos de HUVEC, mientras que los medios acondicionados procedentes de PANC-1 tratada por α-solanina la formación de tubos de HUVEC suprimido de una manera dependiente de la dosis (Figs. 3A, 3B). VEGF, como un factor angiogénico, promueve la angiogénesis. Nuestros resultados también mostraron que α-solanina (3, 6 y 9 g /l) disminuyó notablemente la expresión de ARNm y de la proteína de VEGF en las células PANC-1 de una manera dependiente de la dosis (Figs. 3C, 3D y 3E). Los datos revelaron que α-solanina inhibe la angiogénesis en al restringir la expresión del VEGF.
(A) micrografías representativas (100x) de tubo después del tratamiento de medio acondicionado durante 6 h. HUVECS se sembraron en los pocillos -precoated Matrigel y se cultivaron en medio condicionado de células Panc-1 tratados con durante 24 h. (B) Las longitudes de los tubos se midieron por Image-ProPlus 6.0. (C) La expresión de mRNA de VEGF se presenta como medias ± S.E.M. de tres experimentos independientes. (D) Análisis de transferencia Western de la expresión de VEGF. GAPDH se utilizó como control de carga. (E) Cuantificación de los resultados de transferencia Western se realizó mediante el cálculo de la relación entre el valor para el grupo de control. * P & lt; 0,05, ** p & lt;. 0,01, en comparación con el control
4. α-solanina Ejerce Expresión de metástasis asociados Molecule
La expresión de genes asociados con la progresión del cáncer y la metástasis se realizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real (Figs. 4A). La activación de MMPs es un paso crucial para la degradación de ECM, que induce la invasión de células. Los resultados mostraron que α-solanina suprimió la expresión de mRNA de MMP-2, MMP-9, ENOS, EMMPRIN y CD44 de una manera dependiente de la dosis. Expresión de proteínas de MMP-2 y MMP-9 también fueron suprimidas en una manera dependiente de la dosis (Figs. 4B, 4D). ensayo de zimografía de gelatina también mostró que la MMP-9 y MMP-2 actividades se redujeron notablemente por el 6 y 9 g /l α-solanina (Fig. 4E, 4F). Por otra parte, α-solanina no regulada la expresión de E-cadherina (Figs. 4c, 4d), que puede aumentar la adhesión entre las células. Por lo tanto, α-solanina podría inhibir la metástasis al afectar a la activación proteolítica y la capacidad adhesiva.
(A) La expresión del ARNm de la MMP-2/9, EMMPRIN, CD44, ENOS y Ecadherin se presentan como medias ± S.E.M. de tres experimentos independientes. (B) Las expresiones de MMP-2 y la proteína MMP-9 se analizaron por Western blot. (C) Las expresiones de proteína Ecadherin se realizó por transferencia de Western. Se llevaron a cabo (D) La cuantificación de los resultados Western Blot mediante el cálculo de la relación entre el valor para el grupo de control. (e) la actividad de MMP-2 y MMP-9 fueron analizados por gelatina Zymography. (F) La cuantificación de los resultados de gelatina zimografía se llevaron a cabo mediante el cálculo de la relación entre el valor para el grupo de control. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, en comparación con el control. GAPDH se utilizó como control de carga.
5. α-solanina Regulado proteínas asociadas de señalización
La investigación indicó que Wnt /β-catenina, Akt /mTOR y JAK /STAT vías están involucrados en la expresión de las MMP y la inducción de la metástasis. α-solanina indujo la expresión de la fosforilación de β-catenina y se inhibe la fosforilación de STAT3 de una manera dependiente de la dosis y el tiempo (. Figs 5). Los datos también mostraron que α-solanina reduce la fosforilación de Akt y mTOR de una manera dependiente de la dosis y el tiempo (. Figs 6). Además, α-solanina el regulado el nivel de β-catenina y TCF-1 en el núcleo (. Las figuras 7). Por lo tanto, α-solanina podría suprimir la invasión de células y la expresión de MMP-2/9 parte a través de la inhibición de Wnt /β-catenina, Akt /mTOR y JAK /STAT vías.
células PANC-1 se trataron con diversas dosis de α-solanina durante 24 h, o 9 g /l de α-solanina para 6,12,18,24 h. El nivel de fosforilación de β-catenina (A, B), Stat3 (C, D) se determinó mediante Western blot. GAPDH se utilizó como control de carga. (E, F, G, H) Cuantificación de los resultados Western Blot se realizaron mediante el cálculo de la relación entre el valor para el grupo de control. * P & lt; 0,05, ** p & lt;. 0,01, en comparación con el control
células PANC-1 se trataron con diversas dosis de α-solanina durante 24 h, o 9 g /l de α- solanina para 6,12,18,24 h. (A, C) El nivel de fosforilación de Akt y mTOR se determinaron por Western blot. GAPDH se utilizó como control de carga. (B, D) Cuantificación de los resultados Western Blot se realizaron mediante el cálculo de la relación entre el valor para el grupo de control. * P & lt; 0,05, ** p & lt;. 0,01, en comparación con el control
células PANC-1 se trataron con diversas dosis de α-solanina para 24 h. (A, C) El nivel de NF-kB /p65, β-catenina y TCF-1 en el núcleo se determinó mediante Western blot. Laminb1 se utilizó como control de carga de proteína nuclear. (B, D) Cuantificación de los resultados densitométricos se llevaron a cabo mediante el cálculo de la relación entre el valor para el grupo de control. * P & lt; 0,05, ** p & lt;. 0,01, en comparación con el control
6. α-solanina disminuyó la expresión de NF-kB /p65 en el núcleo de las células PANC-1
El nivel relativo de nuclear NF-kB /p65 en las células PANC-1 se determinó usando el ensayo de Western blot. Se encontró que el tratamiento con α-solanina decreasd significativamente la expresión de NF-kB /p65 en PANC-1 células (Figs. 7A, 7B). La activación constitutiva de NF-KB puede promover la proliferación celular, inhibir la apoptosis de las células, y regular la expresión de genes asociados con la angiogénesis. Por lo tanto α-solanina podría mejorar la inhibición del crecimiento y la proliferación celular y promover la apoptosis de las células de cáncer de páncreas mediante la inhibición de la expresión de NF-kB.
7. a-solanina Suprime el crecimiento in vivo de cáncer de páncreas celular PANC-1 xenoinjertos de tumores
La administración de solanina a ratones desnudos inhibió el crecimiento de xenoinjertos de tumores PANC-1 (. 8 figuras). Al final de los 14 días del estudio en PANC-1 xenoinjerto, solanina disminuyó tumor volumen /ratón de 701.97 ± 157.86 mm
3 en el grupo control a 273.54 ± 57.27 mm
3, correspondiente a un 61% (P & lt ; 0,05) la reducción en el volumen del tumor. Del mismo modo, el peso del tumor en el grupo tratado solanina también se redujo de 250 ± 37,42 mg en el grupo control a 143,33 ± 26,29 mg, correspondiente a un 43% (p & lt; 0,05) en la reducción de peso del tumor. Se observó que había una pequeña caída en el peso corporal tanto en el grupo control y en el grupo tratado solanina. La razón de que no estaba claro aún.
PANC-1 células fueron inyectadas por vía subcutánea en los costados de ratones desnudos. Cuando los tumores eran medibles, los ratones recibieron DMSO o α-solanina durante 2 semanas. (A) El volumen del tumor /ratón como una función del tiempo. (B) El ratón de cada grupo se controló el peso corporal una vez al día. Se analizaron La media de peso corporal /ratón como una función del tiempo. (C) El volumen del tumor /ratón y (D) el peso del tumor /ratón al final del estudio. * P & lt;. 0,05, en comparación con el control
8. α-solanina suprime la metástasis, la proliferación celular y la angiogénesis en xenoinjertos de modelos
MMP-2 y MMP-9 desempeñan papeles clave en el proceso de metástasis entre las MMP. Examinamos xenoinjerto de tumor de páncreas por Western blot y encontramos α-solanina puede disminuir significativamente la expresión de MMP-2 y MMP-9 (Figs. 9A, 9B). La proliferación y la angiogénesis son los dos biomarcadores utilizados ampliamente, que se han empleado para medir la agresividad de los tumores sólidos. Por lo tanto, se analizaron los tumores de anti-proliferación y anti-angiogénesis de α-solanina por PCNA y tinción VEGF a través de métodos inmunohistoquímicos. La tinción PCNA y tinción VEGF de tumores mostraron pobres inmunoreactividad en el grupo tratado solanina en comparación con el grupo control (Figs. 9B, 9C). La cuantificación mostró 78 ± 4% de células PCNA positivas en el grupo control frente a 29 ± 3% en el grupo tratado solanina que representa el 63% de disminución (p & lt; 0,01), y el IOD promedio de tinción VEGF realiza 70% de disminución (p & lt; 0,01) en el grupo tratado solanina comparación con el grupo control. Este estudio confirmó en el mecanismo antitumoral in vivo de la eficacia contra la solanina PANC-1 de crecimiento del tumor.
Cuando se separaron xenoinjertos de tumores, se utilizaron piezas de tumor de Western blot e inmunohistoquímica. (A) Las expresiones de MMP-2 y MMP-9 de proteína se analyzede por Western blot. (B, C) tissus tumor se analizaron innunohistochemically de células PCNA positivas y densidad de tinción de VEGF. fotografías representativas de tinción inmunohistoquímica de PCNA y VEGF se muestran en 400 × aumentos. Barra de escala: 50 micras. Los datos se presentan como la media ± SE. * P & lt; 0,05, ** p & lt;. 0,01, en comparación con el control
Discusión
α-solanina es una clase de alcaloides esteroides que hayan producido por las plantas de la familia sloanaceae . La alta concentración de α-solanina puede generar efectos citotóxicos que inducen rápida de los daños de la membrana plasmática que causa el trastorno letal del metabolismo [26]. Varios estudios muestran que la α-solanina inhibe el desarrollo de preimplantación de embriones [27], [28], las células hepáticas humanas normales [22]. Por otra parte, α-solanina se ha demostrado para reducir de citoquinas y producciones de óxido nítrico en células Jurkat Con A inducida por macrófagos y primas estimulada por LPS [24], inhibir factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) y la interleucina (IL) -6 en el ratón peritoneal macrófagos debido a la supresión de p38, JNK y ERK1 /2 [29]. Estudios recientes han demostrado que la α-solanina realiza eficacia anti-tumor, tales como restricción de la proliferación de líneas celulares de cáncer y la inducción de la apoptosis y la disminución de la mutación de p53 de líneas celulares de cáncer gástrico [22], [23], [30]. En el presente estudio, se utilizó la concentración no tóxica de α-solanina (3, 6 y 9 g /l) y se encontró que α-solanina inhibe la metástasis in vitro, tales como la invasión, la migración y la angiogénesis, lo que indica que el efecto inhibidor de α-solanina sobre la metástasis no era por su función citotóxica. Nos primero evaluó la eficacia de α-solanina in vivo y encontramos α-solanina puede inhibir la proliferación, la angiogénesis y la metástasis en xenoinjerto de tumor en ratones desnudos atímicos.
Metástasis
cáncer es un proceso de múltiples facetas que las células cancerosas genéticamente inestables desarrollan adaptación y ecesis a un microambiente del tejido que está distante del tumor primario [31], que implica la pérdida de adhesión celular, aumento de la migración y la invasión, la circulación a través de los sistemas vasculares /linfáticos y la germinación de los tumores coloniales en sitios distantes [32], [33] . La degradación de ECM y BM por las enzimas proteolíticas y la invasión de conformidad son indispensables para la metástasis [34]. MMPs son las enzimas proteolíticas importantes que degradan la ECM y BM. Entre ellos, MMP-2 y MMP-9 son altamente expresado en el cáncer de páncreas [35]. La inhibición de la metástasis de las células de cáncer de páncreas mediada por la regulación negativa de la expresión de MMP-2 y MMP-9 [36], [37]. EMMPRIN, la estimulación de los fibroblastos peritumoral para producir MMP, realizada con una alta expresión particular en células de cáncer de páncreas [38]. la invasión de células de cáncer pancreático y la metástasis podrían ser suprimidos a través de la terapia de EMMPRIN contra [39]. CD44, una glicoproteína transmembrana con dominios de unión para el ácido hialurónico que es el componente crucial de la ECM, es altamente expresado en el cáncer de páncreas [40].