Extracto
cáncer del tracto biliar (BTC) es a menudo difícil de diagnosticar definitivamente , incluso a través de un examen histológico. MicroARNs (miRNAs) regulan una variedad de procesos fisiológicos. En los últimos años, se ha sugerido que los perfiles para la circulación de miRNAs, así como aquellos para los miRNAs de tejidos, tienen el potencial de ser utilizado como biomarcadores de diagnóstico para el cáncer. El objetivo de este estudio era confirmar la existencia de miRNAs en la bilis humana y para evaluar su potencial como biomarcadores clínicos para BTC. Tomamos muestras de bilis de pacientes que se sometieron a drenaje biliar para las enfermedades biliares tales como BTC y coledocolitiasis. detección de miRNA basado en la PCR y la clonación de los genes miARN se realizaron para identificar miRNAs biliares. El uso de microarrays miARN basados en la PCR en tiempo real de alto rendimiento, los perfiles de expresión de 667 miRNAs se compararon en pacientes con enfermedad maligna (
n
= 9) y los pacientes de la misma edad con la coledocolitiasis enfermedad benigna (
n
= 9). posteriormente se caracterizaron miRNAs biliares en términos de estabilidad y localización. A través de la clonación y el uso de métodos de PCR, se confirmó la existencia de miRNAs en la bilis. Análisis diferencial de miRNAs biliares demostró que 10 de los 667 miRNAs fueron significativamente más altamente expresado en el grupo maligno que en el grupo benigno a
P Hotel & lt; 0,0005. Ajuste del umbral de especificidad de 100% mostró que algunos miRNAs (
miR-9
,
miR-302c *
,
miR-199a-3p
y
miR 222 *
) tenían un nivel de sensibilidad del 88,9%, y el análisis de las características receptor de funcionamiento demostró que
miR-9 Opiniones y
miR-145 *
podrían ser marcadores de diagnóstico útiles para BTC. Por otra parte, se verificó la estabilidad a largo plazo de miRNAs en la bilis, una característica que los hace adecuados para uso diagnóstico en la práctica clínica. También confirmó que los miRNAs biliares se localizan en el epitelio biliar maligna /benigna. Estos hallazgos sugieren que los miRNAs biliares podrían ser biomarcadores para la enfermedad hepatobiliar informativos y que algunos miRNAs, en particular
MIR
-9, pueden ser útiles en el diagnóstico y manejo clínico de BTC
Visto:. Shigehara K, Yokomuro S, Ishibashi O, Mizuguchi Y, Arima Y, Kawahigashi Y, et al. (2011) PCR en tiempo real basados en el análisis de la bilis humana MicroRNAome Identifica
miR-9
como un biomarcador potencial de diagnóstico para el cáncer del tracto biliar. PLoS ONE 6 (8): e23584. doi: 10.1371 /journal.pone.0023584
Editor: Carlo Gaetano, Istituto Dermopatico dell'Immacolata, Italia |
Recibido: 28 Diciembre, 2010; Aceptado: 21 de julio de 2011; Publicado: 17 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Shigehara et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas-en-Aid el Proyecto "Investigación Core" de la Universidad privada y: Subvención Matching Fund (S0801034) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, Japón. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Entre las neoplasias malignas hepatobiliares, cáncer del tracto biliar (BTC), que incluye el cáncer de colangiocarcinoma y la vesícula biliar intra y extrahepática [1], está aumentando la incidencia. BTC surge del epitelio de las vías biliares y es causa frecuente de estenosis u obstrucción del conducto biliar [2]. Una consecuencia de esta obstrucción es la retención de la bilis, lo que conduce a la ictericia. Los pacientes sospechosos de padecer BTC y que presenten síntomas clínicos como ictericia suelen ser examinadas usando técnicas de diagnóstico por imágenes, incluyendo la ecografía, tomografía computarizada (TC) y la colangiopancreatografía por resonancia magnética (CPRM). Sin embargo, estas técnicas han sensibilidad limitada para la detección de BTC [3], y el establecimiento de un diagnóstico preciso del cáncer en el entorno clínico es a menudo difícil debido a que muchos trastornos benignos muestran síntomas similares. El resultado es a menudo un retraso en el diagnóstico de BTC [4]. La detección temprana de BTC es fundamental para el resultado del paciente porque a) BTC se asocia con un mal pronóstico [4]; b) que se caracteriza por la falta de respuesta /respuesta más débil a la quimioterapia y la radioterapia; y c) el único tratamiento curativo es la resección quirúrgica [5], [6]. pacientes BTC menudo se someten a cirugía antes de su condición se ha determinado definitivamente a ser malignos [7]. Por lo tanto, es necesaria una mejora en la precisión diagnóstica para BTC, particularmente a la luz de la creciente incidencia mundial de la enfermedad. Durante los últimos 10 años, se han realizado considerables progresos en la comprensión de la patogénesis de la BTC, y varios genes y proteínas que contribuyen a los mecanismos moleculares de la carcinogénesis del tracto biliar se han identificado [8], [9], [10], [11 ], [12].
Los microARN (miARN) se expresan de manera endógena, corto, RNAs no codificantes 18-25 nucleótidos de longitud que reprimen la traducción de proteínas mediante la unión a ARNm diana. En el campo del cáncer, un número de estudios se han realizado sobre miRNAs de tejido en un esfuerzo por dilucidar los mecanismos de la enfermedad y mejorar los indicadores de diagnóstico y pronóstico actuales [13], [14], [15]. Recientemente, se han reportado estudios sobre la utilidad de miRNAs de componentes extracelulares, en particular, suero y plasma, [16], [17], [18]. Por ejemplo, se ha demostrado que los miRNAs asociada a la placenta de circulación se correlacionan con la progresión de embarazo [16]. Cogswell
et al.
Recuperó miRNAs de líquido cefalorraquídeo y descubrió de Alzheimer miARN específico de la enfermedad cambia en consonancia con su papel como posibles marcadores biológicos de la enfermedad [19]. Melkonyan
et al.
Detecta una variedad de miRNAs en la orina, incluyendo algunos excreta transrenally, y propone nuevas posibilidades de diagnóstico para análisis de ácidos nucleicos transrenal [20]. En otra parte, Michael
et al.
Extrae miRNAs de exosomas obtenidos a partir de la saliva de los controles sanos y un paciente con síndrome de Sjögren [21]. En el contexto del cáncer, miRNAs en el suero de pacientes con cáncer de mama y el linfoma difuso de células B grandes han demostrado ser estables y altamente predictivo de malignidad y la supervivencia [17], [18]. Estos informes sugieren un papel importante para miRNAs extracelulares, además de los de miRNAs de tejido, en la regulación de muchos procesos fisiológicos. A medida que se desarrolla este campo, estos miRNAs pueden convertirse en objetivos diagnósticos y terapéuticos en situaciones clínicamente relevantes. Estos informes nos promovidos a especular que los miRNAs pueden estar presentes y estable en la bilis humana, al igual que lo son en otros fluidos corporales, y que los miRNAs biliares transmitidas podrían utilizarse como nuevos biomarcadores para BTC.
Los componentes principales de la bilis humana son ácidos biliares, colesterol, bilirrubina, bicarbonatos, electrolitos y agua. La bilis se produce por los hepatocitos en el hígado y fluye a través del conducto biliar en el duodeno, donde ayuda en la digestión de lípidos y la absorción [22]. Como la sangre, la bilis puede ser recogido de pacientes que se someten a drenaje biliar de diagnóstico y /o terapéutico. Por consiguiente, puede comprender la utilidad de un biomarcador BTC en la bilis y /o suero. Un biomarcador bilis podría acelerar el diagnóstico de BTC al incitar a nuevos exámenes histológicos como la citología biliar, cepillo de citología y pinzas de biopsia de la vía biliar.
En este estudio, primero examinamos si existen miRNAs y pueden ser detectados en la bilis humana por pequeña biblioteca de secuenciación de ARN. A continuación, se determinó si la expresión de miRNAs específicos en la bilis difiere entre los pacientes con cáncer y los que no tienen cáncer utilizando microarrays de expresión de miRNA-alto rendimiento en tiempo real basados en la PCR. Por último, se evaluó el potencial de miRNAs biliares como nuevos biomarcadores para BTC.
Materiales y Métodos
colección de bilis
El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética Humanos de Nippon Escuela de Medicina y el Comité de Ética de la Facultad de Medicina Nippon. Los pacientes que firmaron un formulario de consentimiento informado por escrito se inscribieron en este estudio. Las muestras de bilis se obtuvieron de 18 pacientes que sufren de enfermedad biliar (incluyendo BTC y coledocolitiasis) que se sometió a drenaje biliar de diagnóstico y /o terapéutico a través de colangiodrenaje percutánea transhepática, el drenaje de la vejiga biliar transhepática percutánea o drenaje nasobiliar endoscópica. Nueve pacientes fueron diagnosticados histológicamente de adenocarcinoma (siete con colangiocarcinoma y dos con cáncer de vesícula biliar). Se incluyeron nueve pacientes del grupo control de la misma edad con diagnóstico de coledocolitiasis sin tumor maligno actual o anterior o una afección inflamatoria (Tabla 1).
Procesamiento de la muestra y la extracción de RNA
Se extrajo ARN de 5 ml de bilis de cada individuo en el mismo día como colección. La fracción de ácido nucleico se obtiene mediante extracción en fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) seguido de precipitación con etanol (-80 ° C durante 30 min). Se obtuvo el ARN total usando RNAiso Plus (Takara Bio, Tokyo, Japón) de acuerdo con el protocolo del fabricante. RNA de muestras extraídas fueron almacenadas a -80 ° C hasta su uso.
-PCR en tiempo real
El ARN total fue inverso-transcrito utilizando cebadores /cebadores no específicos específicos para cada ARNm /miARN, respectivamente . muestras por triplicado del ADNc resultante se sometieron a PCR en tiempo real utilizando cebadores TaqMan miARN /sondas (Applied Biosystems, Tokio, Japón) con un sistema de PCR en tiempo real 7300 (Applied Biosystems).
RNA Secuenciación de la biblioteca de miRNAs biliares
miARN métodos de clonación se describen en nuestro informe anterior [23]. Brevemente, las muestras de ARN total se extrajeron de la bilis usando RNAiso Plus (Takara Bio) (ver arriba) y se separaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante. a continuación, se recuperó la fracción 18-24 nt. A continuación, 5 'y 3' se ligaron adaptadores a los ARN, y PCR en tiempo real se llevó a cabo. La amplificación de los fragmentos de ADNc se logró a través de dos rondas consecutivas de PCR. digestión con enzimas de restricción específica de los adaptadores permitidos para concatemerization del ADNc en fragmentos más grandes. Estos fragmentos fueron clonados en un vector para crear una biblioteca de ADNc. Concatemerization aumenta las longitudes de las secuencias informativos que pueden ser obtenidos a partir de cada clon. Las pequeñas secuencias de ARN se analizaron por homología con miRNAs conocidos. Anotación de los miRNAs se realizó utilizando el miRBase (última versión) función de análisis de homología.
miARN expresión basado en la PCR en tiempo real de perfiles
Total miARN (350 ng) fue inverso-transcrito utilizando Megaplex Los cebadores RT (Applied Biosystems). Los ADNc resultantes fueron pre-amplificado utilizando cebadores Megaplex preamplificador (Applied Biosystems) y los productos pre-amplificada aplicadas a una matriz TaqMan microARN humano Panel (A y B, v2.0). PCR en tiempo real se realizó con un sistema en tiempo real rápida 7900HT (Applied Biosystems). Los datos de PCR en tiempo real obtenidos mediante el Panel de microARN TaqMan se analizaron con el software de Applied Biosystems (SDS ver. 2.3 y RQ Manager ver. 1.2). los niveles de expresión de miRNAs para el paciente M9 (véase la Tabla 1) se establecen en 1,0. miRNAs cuya expresión no era detectable en M9 paciente (ver Tabla 1) fueron excluidos del análisis. Para la cuantificación, se aplicó el método de CT relativo (método ΔΔCT). U6 se utilizó como control interno. Para los 18 pacientes, este ensayo se realizó con paneles A y B. Se determinó el punto de corte para la significación usando un delta parámetro de ajuste, elegido sobre la base de una tasa de falsos positivos de cero. El conjunto de datos se utilizaron para construir las curvas características (ROC) receptor de funcionamiento mediante el trazado de las relaciones entre los verdaderos positivos (sensibilidad) y falsos positivos (1 - especificidad). El área bajo la curva (AUC), una medida de la precisión de la discriminación, también se calculó.
miARN ensayo de estabilidad
Para evaluar la estabilidad de miRNAs endógenos en la bilis, que mide los niveles de miRNA en la bilis de tres individuos que habían sido incubados a temperatura ambiente durante 0 a 24 h. Brevemente, se incubó 5 ml de cada muestra de bilis, y miRNAs se extrajeron y purificaron en los puntos de tiempo programados usando el método descrito anteriormente. Las muestras de ARN fueron entonces transcrito de forma inversa y se sometieron a PCR en tiempo real. Para medir la estabilidad de los genes miARN exógeno, un sintético
Caenorhabditis elegans
miRNA (
cel-miR-39
) se añadió a cada muestra de bilis en el inicio del periodo de incubación (0 h) y sometido a los mismos procedimientos de extracción y cuantificación. Para normalizar los datos, la sintética
C. elegans
miARN
cel-miR-238
se añadió a la fracción de ácido nucleico inmediatamente antes de la transcripción para servir como un control interno en la PCR en tiempo real.
fraccionamiento bilis revertir
se informa
Bile a fraccionar en cuatro componentes mediante el aumento tanto de la fuerza centrífuga y la duración de la centrifugación [24]. Para evaluar la bilis miRNA localización, fraccionado muestras de 12 ml de bilis de tres individuos por centrifugación diferencial [25] y comparación del nivel de expresión de los miRNAs en cada fracción (Fig. 1). componentes relativamente grandes, tales como células enteras, núcleos, y citoesqueleto celular sedimento en un
baja velocidad gratis (1.000 ×
g
durante 10 min). Gránulos que contienen mitocondrias, lisosomas, peroxisomas y se obtuvieron en un
velocidad media gratis (20.000 ×
g
durante 20 min), y los microsomas y pequeñas vesículas a
de alta velocidad gratis ( 80.000 ×
g
durante 1 h). Por último, se recogieron los componentes más pequeños (por ejemplo, los ribosomas, virus y macromoléculas grandes) en un
muy alta velocidad con
un largo período de centrifugación (150.000 x
g
durante 3 h) ( Figura 1). Se extrajo ARN de cada sedimento usando RNAiso Plus (Takara Bio) de acuerdo con el protocolo del fabricante, y la expresión de algunos miRNAs arbitrariamente seleccionados se midió por PCR en tiempo real como se describió anteriormente. El nivel de expresión del ARNm que codifica el marcador epiteliales biliares citoqueratina 7 (CK-7) también se midió para verificar que el fraccionamiento se había realizado adecuadamente [26], [27], [28], [29].
bilis humana se sometió a centrifugación repetida a velocidades progresivamente más altas para separar las células y orgánulos. Las condiciones de centrifugación (gravedad y tiempo) fueron los siguientes: baja velocidad, 1.000 × g durante 10 minutos; velocidad media, 20.000 × g durante 20 min; alta velocidad, 80.000 × g durante 1 h; velocidad muy alta, 150.000 xg durante 3 h.
Resultados
Confirmación de la existencia de miRNAs en la bilis humana
Hasta la fecha, no ha habido ningún informe en la presencia de miRNAs en la bilis. Nuestra primera prioridad fue determinar si existen miRNAs en la bilis y, en caso afirmativo, para identificarlos. PCR en tiempo real con los cebadores /sondas específicas demostró que
miR-21
estuvo presente en la bilis (Fig. 2A). El uso de bilis como el material de origen, pequeña biblioteca de secuenciación de ARN verificó la presencia de varios miRNAs, con
siendo let-7b of the clonado con mayor frecuencia (Fig. 2B y 2C). Estos resultados mostraron que los miRNAs están presentes en la bilis y la bilis que es un material biológico atractiva para el análisis de miARN
.
(A) basado en la PCR en tiempo real la detección de miRNA de
miR-21
. TaqMan miRNA-PCR en tiempo real utilizando una sonda /cebadores específicos para
miR-21
se realizó en tres muestras de bilis y una muestra de control sin plantilla (NC). Tenga en cuenta la falta de un producto de PCR en el control negativo (NC). (B) cromatograma representativo de los resultados de secuenciación después de la clonación de los genes miARN biliares. Las barras horizontales por encima del cromatograma indican cada miRNA y el enlazador (ver Materiales y Métodos). (C) Tabla que muestra los miRNAs identificados a partir de la clonación, su frecuencia relativa, y si se clonaron a partir BTC o casos benignos.
de gran procesamiento y cuantitativo de perfiles de expresión de microARN de la bilis de pacientes con vías biliares cáncer
Para identificar miRNAs biliares que se expresan de forma aberrante en enfermedades de las vías biliares, especialmente cánceres del tracto biliar, se analizaron muestras de bilis de los 18 pacientes de los genes miARN expresión basado en la PCR en tiempo real de perfiles (Fig. 3A y el cuadro S1 ). Cuantificación relativa de los datos mostró que 335 de los 667 miRNAs fueron significativamente más altamente expresado en el grupo maligno que en el grupo benigno (
P
& lt; 0,05) (Fig. 3A y en la Tabla S1). De estos, destacamos 10 miRNAs (
miR-9
,
miR-145 *
,
miR-105
,
miR-147b
,
let-7F-2 *
,
let-7i *
,
miR-302c *
,
miR-199a-3p
,
MIR -222 *
y
miR-942
) cuya expresión fue significativamente mayor en el
P
. & lt; 0,0005 (figura 3A). Ajuste del umbral de especificidad de 100% [17], [30] mostró que
miR-9
,
miR-302c *
,
miR-199a-3p
, y
miR-222 *
tenían un nivel de sensibilidad del 88,9%, lo que indica que estos miRNAs pueden servir como marcadores biológicos para el cáncer de las vías biliares (Fig. 3B). El nivel de sensibilidad para
miR-145 *
,
miR-105
, y
miR-942
fue del 77,8%, y el de
miR-147b
,
let-7F-2 *
, y
let-7i *
fue del 66,7% (Fig. 3B). Además, el área bajo la curva ROC de la curva mostró que
miR-9 Opiniones y
miR-145 *
podrían ser excelentes marcadores de diagnóstico para BTC (Fig. 3C). Tomados en conjunto, nuestros datos muestran que los miRNAs biliares, en particular
miR-9
, tiene el potencial para ser utilizados como indicadores de diagnóstico para el cáncer de las vías biliares.
(A) mapa de calor miARN expresión, con miRNAs ordenados en función de su
P-valores
. Las muestras se muestran en las filas, y miRNAs en columnas. miARN expresión en M9 paciente (ver Tabla 1) fue ajustado a 1.0. Los resultados completos de microarrays se pueden encontrar en la información complementaria. plot (B) Dot que muestra los niveles de expresión de los 10 miRNAs que fueron significativamente más altamente expresado en el grupo maligno que en el grupo benigna (
P Hotel & lt; 0,0005). El eje vertical muestra logarítmica valores de cuantificación relativos obtenidos en un ensayo de matriz TaqMan. Ajuste del umbral de especificidad de 100% mostró el nivel de sensibilidad para ser 88,9% para
miR-9
,
miR-302c *
,
miR-199a-3p
, y
miR-222 *
; 77,8% en
miR-145 *
,
miR-105
, y
miR-942
; y el 66,7% en
miR-147b
,
let-7F-2 *
, y
let-7i *
. ○, valor de la mediana. Análisis de la curva (C) ROC. El perfil de expresión para cada miARN se utiliza como entrada para el análisis de características operativas del receptor (ROC). La curva ROC muestra la sensibilidad frente a 1 - especificidad. El área bajo la curva (AUC), una medida de la precisión de la discriminación, también se calculó.
Caracterización de miRNAs biliares
Para miRNAs biliares para ser utilizados para el diagnóstico en un entorno clínico, que necesitan para ser estable. Teniendo en cuenta su naturaleza degradante, era importante para determinar la integridad a largo miARN podría mantenerse en la bilis. Como se muestra en la Fig. 4, se confirmó que los miRNAs biliares endógenos
miR-21
,
let-7c
, y
miR-9
se mantuvieron estables en la bilis y que sus niveles de expresión se mantuvo alta , sobre todo dentro de las 4 horas de incubación de 24 horas. Sin embargo, la exógena miARN
cel-miR-238
fue degradada inmediatamente cuando se añade a las tres muestras individuales biliares (ver Materiales y Métodos). Estas observaciones sugieren que miRNAs biliares endógenos están en una forma estable que puede resistir condiciones desfavorables, tales como la actividad de RNasa potente y fuerte acidez, que causan miRNAs exógenos a ser degradados. Por otra parte, los análisis mostraron que el fraccionamiento, para probar las tres muestras, todos los miRNAs, incluyendo
miR-9
, se detectaron en el componente que contiene células epiteliales biliares, núcleos, y citoesqueleto, lo que indica que los miRNAs biliares residen principalmente en el interior las células y los núcleos. (Fig. 5).
Los endógenos miRNAs biliares humanos
hsa-miR-21
,
hsa-let-7c
, y
hsa-miR-9 ¿Cuáles son relativamente estables. Por el contrario, la exógena miARN sintético
cel-miR-39
era degrada rápidamente cuando se añade a la bilis.
Los niveles de ARNm y miRNAs en cada fracción se calcularon a partir de los resultados reales -Tiempo PCR y el volumen de RNA total para comparar la cantidad absoluta simplificada en cada componente. (A) mRNA que codifica el marcador biliar CK epitelio 7 se detectó predominantemente en el componente subcelular, que incluía células enteras, núcleos, y citoesqueletos celulares. (B) El miRNAs
miR-21
,
miR-9
, y
RNU6B
mostró un patrón similar, lo que indica que la mayoría de los miRNAs en la bilis se derivaron de las células epiteliales biliares . Las fracciones que se obtuvieron a través de baja velocidad (2), de alta velocidad (1), de velocidad media (3); y muy centrifugación a alta velocidad (4).
Discusión
A continuación, nos informe sobre la presencia y la estabilidad de miRNAs biliares, sus niveles relativos de expresión, según lo medido por alto rendimiento PCR en tiempo real, y las diferencias en los perfiles de miARN entre las muestras de bilis de pacientes con enfermedad del tracto biliar benignas y malignas. Después de confirmar la existencia de miRNAs en la bilis utilizando cebadores específicos de genes miARN, se realizó un análisis más exhaustivo utilizando microarrays miARN, lo que nos permitió comprobar la presencia de 667 especies de miARN. Aunque se trata de un estudio pequeño, tenemos la confianza de que nuestro concepto del uso de miRNAs para distinguir las enfermedades benignas /malignas del tracto biliar será validado a medida que más se llevan a cabo estudios a gran escala en el futuro. Además de proponer el uso de diagnóstico de miRNAs biliares, hemos desarrollado métodos fiables para la extracción y la evaluación de miRNAs que son compatibles con las pruebas clínicas. Análisis comparativo de los niveles de expresión se identificaron 10 miRNAs cuyos niveles difieren entre las condiciones benignas y malignas (
P Hotel & lt; 0,0005) (Fig. 3B). análisis ROC identificó dos de estos miRNAs como adecuados para uso como biomarcadores BTC (Fig. 3C). En particular,
miR-9
mostraron especificidad de diagnóstico fiable y sensibilidad.
En el contexto de la biología del cáncer, la expresión aberrante de
miR-9
se ha asociado con la metástasis [31 ], [32], [33], [34]. El
miR-9
familia es upregulated [32], [33] o downregulated [31], [35] en diversos cánceres humanos. La diferencia en
miR-9
expresión se ve aquí puede ser similar a la regulación de la etapa específica que fue demostrado por
miR-200
en el cáncer de hígado [36]. Temprano, cuando las células cancerosas se convierten en invasoras y se someten a la transición epitelio-mesenquimal,
miR-200
es downregulated, pero más tarde se upregulated durante la reepitelización de las metástasis distales cuando las células se someten a mesenquimal-epitelial de transición [36]. El mecanismo de
miR-9
desregulación en nuestro estudio sigue siendo desconocida, pero puede implicar la metilación aberrante de la región promotora es [31], [34], [37] o la activación f del factor de transcripción MYC /MYCN [32 ]. Los estudios funcionales adicionales de
miR-9 Hoteles en BTC se necesitan.
investigados posteriormente las características bioquímicas de miRNAs en la bilis. Plasma se ha informado para mostrar una fuerte actividad RNasa [38]. Mitchell
et al.
Confirmó esta actividad RNasa y demostró que miRNAs desnudos estaban sujetos a la degradación, mientras que miRNAs endógenos se mantuvieron estables en el plasma, incluso en la presencia de actividad de RNasa potente [39]. Curiosamente, hemos observado diferencias similares en la estabilidad entre miRNAs endógenos y exógenos en la bilis (Fig. 4). La estabilidad de miRNAs biliares endógenos hace adecuados como marcadores biológicos fiables en situaciones clínicas.
¿Cómo miRNAs endógenos soportar las condiciones de desnaturalización de la bilis aún no se ha explicado. Estudios recientes demostraron que la mayoría de los miRNAs circulantes se encuentran en los exosomas, que los protegen de la degradación y son responsables de su excelente estabilidad [40], [41], [42]. Los exosomas son 40-100 nm vesículas de membrana de origen endocítica que contienen tanto ARNm y miARN. Los exosomas pueden ser transferidos de una célula a otra, y sus componentes pueden funcionar en el nuevo entorno. Varios miARN perfiles de estudios se han realizado sobre los exosomas que circulan en la sangre [40], [41], [42]. Inicialmente se presume que la estabilidad de miRNAs biliares endógenos como resultado de su presencia en los exosomas. Sin embargo, contrariamente a nuestras expectativas, experimentos de fraccionamiento celular reveló que la mayoría de los miRNAs biliares no se encontraron en pequeñas vesículas, pero en células enteras y los núcleos (Fig. 5). Aunque no hay evidencia de que miRNAs biliares tienen las mismas funciones que los de suero o plasma, nuestros hallazgos de los estudios de fraccionamiento y el análisis de PCR de CK-7 sugieren que miRNAs extraídos de la bilis se derivan principalmente de las células epiteliales intactas o células malignas que han sido descamadas del tracto biliar. Por lo tanto, miRNAs endógenos se mantienen estables en la bilis hasta que la degradación de las células descamadas en el que están contenidas. Una vez miRNAs se liberan de estas estructuras en la bilis, lo más probable es rápidamente degradada.
Hay una verdadera necesidad de herramientas innovadoras para diagnosticar con precisión BTC. Actualmente, la presencia de antígeno carcinoembrionario (CEA) y de hidratos de carbono 19-9 (CA 19-9) en suero servir como un estándar para el diagnóstico clínico de BTC. Como se muestra en la Tabla 1, sin embargo, la sensibilidad de esta prueba no es tan alta como la que se consigue por nuestro análisis miRNA. En ocho de los nueve casos de BTC, los niveles séricos de CEA no aumentaron, a pesar de que el cáncer estaba presente. Además, el suero CA-19-9 solamente se incrementaron en ciertos pacientes, probablemente debido a colestasis. imaginando técnicas diagnósticas como la ecografía endoscópica (EUS) y la ecografía intraductal se utilizan cuando se sospecha de BTC. EUS permite una buena vista del árbol biliar extrahepático distal, vesícula biliar, ganglios linfáticos regionales y la vasculatura [5]. Rösch
et al.
Comparó la precisión diagnóstica de la colangiopancreatografía retrógrada endoscópica (CPRE), la CPRM, la TC y la USE en 50 pacientes con estenosis biliares. La sensibilidad /especificidad del diagnóstico de malignidad fue del 85% /75% para la CPRE, 85% /71% para la CPRM, 77% /63% para la TC, y el 79% /62% para la USE [43]. En un estudio prospectivo de pacientes con sospecha de colangiocarcinoma, EUS tenía una sensibilidad diagnóstica del 79% y una especificidad del 62% [44]. Por otra parte, en un reciente meta-análisis, la USE tuvo una sensibilidad del 78% y una especificidad del 84% [45]. La ecografía intraductal con alambre de guiado, calibre fino, sondas de alta frecuencia se lleva a cabo durante la CPRE, y en estudios anteriores mostraron tasas de precisión para distinguir las estenosis benignas y malignas de 76-90% [46], [47], [48]. Además de las técnicas de imagen, métodos histológicos como la citología biliar, cepillo de citología y pinzas de biopsia son obligatorios para el diagnóstico definitivo. citología biliar y el cepillo citología tienen sólo modestas tasas de precisión para la determinación de malignidad, que van desde 30 a 70% en mayoría de estudios publicados [5], [49], [50], [51], [52], [53]. pinzas de biopsia, que tiene un índice de exactitud más alta que las otras pruebas histológicas (43 al 81%), no se utiliza ampliamente, ya que requiere un dispositivo especializado y la técnica [54], [55], [56]. Del mismo modo, la aguja de biopsia más especializada guiada por EUS aspiración, con una sensibilidad diagnóstica del 43 al 86% de las estenosis biliares [7], [57], [58], [59], [60], [61], en la actualidad sólo se utiliza para los tumores pancreáticos y biliares estenosis del conducto inferior y no ha sido aprobado para su uso en otras condiciones. La precisión diagnóstica bajo de algunas de las pruebas que actualmente se utilizan confirma que BTC puede ser difícil de diagnosticar. En vista de la pobre prognosis para BTC [4], es deseable mejorar la facilidad y la precisión de las pruebas. Los resultados de nuestra investigación indican que la medición de miRNAs biliares puede mejorar la velocidad y precisión del diagnóstico de BTC. Por otra parte, el análisis de la bilis es factible porque miRNAs biliares son estables y pueden ser fácilmente extraídos y analizados en el ámbito clínico.
Otras investigaciones con mayor número de pacientes y diferentes poblaciones de estudio, así como estudios de visualización diferencial entre la CTB y pre se necesitan enfermedades -malignant tales como la colangitis esclerosante primaria para lograr la aceptación clínica. Sin embargo, nuestros resultados demuestran que la medición de los niveles de miARN biliares es un enfoque práctico para ayudar a la evaluación de BTC y es comparable a muchos métodos de diagnóstico actuales, incluyendo la citología. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la medición de la expresión de los genes miARN en la bilis sería útil para distinguir entre las condiciones benignas y malignas, especialmente en los casos que permanecen sin diagnosticar. En particular, la bilis
miR-9
tiene un gran potencial para su uso como marcador clínico de los cánceres del tracto biliar.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
niveles de expresión de los miRNAs en la bilis. Un mapa de calor se construyó utilizando datos de los microarrays de genes miARN utilizados para analizar muestras de bilis de pacientes con enfermedad maligna y benigna. miARN expresión en M9 paciente (ver Tabla 1) fue ajustado a 1.0. B, el análisis de la bilis de un paciente con enfermedad benigna; M, el análisis de la bilis de un paciente con enfermedad maligna
doi:. 10.1371 /journal.pone.0023584.s001 gratis (XLSX)
Reconocimientos
Agradecemos Takuji Kosuge y Yoshimi Hinohara por su asistencia técnica de expertos.