Extracto
Antecedentes
Anfirregulina, un ligando del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), es asociado con la eficacia de cetuximab, un anticuerpo contra EGFR, como tratamiento para el cáncer colorrectal (CRC). Por el contrario, el ligando heregulina HER3 se correlaciona con la resistencia a cetuximab. En este estudio, se evaluó cómo los niveles combinados de circulante anfirregulina y heregulina afectan los resultados clínicos en los pacientes que reciben cetuximab como tratamiento contra el CCR avanzado.
Métodos
plasma se midieron los niveles de anfirregulina y heregulina mediante la enzima de ensayo de inmunoabsorción ligado en 50 pacientes con CRC en una cohorte de formación, y en 10 pacientes en una cohorte de validación. La expresión combinada se evaluó a continuación, con el resultado clínico después del análisis de las características de funcionamiento del receptor.
Resultados
tasa de respuesta global fue del 26%, y la mediana de supervivencia libre de progresión fue de 110 días en la cohorte de formación. Los pacientes con alta y baja anfirregulina heregulina tenían tasa de respuesta objetiva significativamente superior al 58% y una supervivencia significativamente más larga libre de progresión de 216 días. Este resultado se confirmó en la cohorte de validación
Conclusión
Un subgrupo de pacientes con CRC con alta y baja anfirregulina responden al cetuximab heregulina terapia mejor que otros pacientes
Cita..: Yonesaka K, Takegawa N, Satoh T, Ueda H, Yoshida T, Takeda M, et al. (2015) Análisis combinado de plasma Anfirregulina y heregulina predice la respuesta a cetuximab en cáncer colorrectal metastásico. PLoS ONE 10 (11): e0143132. doi: 10.1371 /journal.pone.0143132
Editor: Mariko Okada (Hatakeyama), Centro RIKEN para las Ciencias Médicas integradoras, JAPÓN
Recibido: 6 Junio, 2015; Aceptado: 30 Octubre 2015; Publicado: 16 de noviembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Yonesaka et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
financiación:.. los autores no recibieron ninguna financiación específica para este trabajo
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer colorrectal (CRC) con frecuencia sobreexpresan el factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que se asocia con la progresión tumoral y mal pronóstico [1]. Por lo tanto, EGFR es una diana terapéutica, no sólo contra CRC, sino también contra otros tipos de cáncer en las que se expresa en abundancia. Los agentes terapéuticos que se dirigen a EGFR son o bien inhibidores de la quinasa EGFR-tirosina o anticuerpos monoclonales [2]. inhibidores de la quinasa tales como gefitinib y erlotinib son muy eficaces contra no pequeñas de cáncer de pulmón de células con mutaciones de EGFR constitutivamente activa [3]. Por otra parte, los anticuerpos monoclonales tales como cetuximab y panitumumab mejorar el pronóstico en pacientes con CRC y el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello que expresan EGFR de tipo salvaje [4-7].
Los estudios preclínicos indican que algunos tipos de cáncer sensibles a la terapia anti-EGFR también expresan abundantemente ligandos de EGFR, especialmente anfirregulina [8]. Como resultado, EGFR se activa de forma constitutiva en estas células por forma autocrina. En particular, los pacientes con CRC que se abundantemente experiencia anfirregulina expresa significativamente mejores resultados con el tratamiento con cetuximab que los pacientes con baja expresión de CRC anfirregulina [9, 10]. De hecho, los niveles de anfiregulina en el plasma están asociados con la eficacia cetuximab [11].
heregulina, también ligando de HER3, también es altamente expresado en algunos CRC, y en algunos de pulmón, cabeza, cuello y cánceres [12 -15]. Fisiológicamente, herregulina se une a HER3 y desencadena la heterodimerización entre HER2 y HER3, un evento que activa los receptores [16, 17]. A su vez, HER3 activa AKT, y por lo tanto previene la apoptosis. Los datos publicados muestran que la sobreexpresión de heregulina causa resistencia a cetuximab en el CCR, aunque la inhibición simultánea de HER2 y HER3 supera esta resistencia [13, 18]. Además, heregulina de plasma se correlaciona negativamente con la supervivencia libre de progresión y la supervivencia global en pacientes con CRC sometidos a tratamiento con cetuximab.
Es evidente que, anfirregulina y heregulina impactan significativamente el pronóstico de los pacientes con CCR tratados con cetuximab. Sin embargo, los resultados clínicos no siempre se explican por un factor o el otro. Algunos pacientes con CCR expresan abundantemente anfirregulina, así como otros con bajos niveles de heregulina, no responden al cetuximab [11, 13]. Una posible razón podría ser que estas moléculas interactúan. De hecho, los estudios anteriores demuestran que mientras que la línea celular CRC DiFi expresa abundantemente anfirregulina y es sensible a cetuximab, transfección estable con heregulina causa resistencia [18]. Por lo tanto, se examinó si el nivel combinado de circulante anfirregulina y heregulina podía predecir con mayor fiabilidad los resultados clínicos de la terapia con cetuximab en pacientes con CCR.
Materiales y Métodos
Pacientes y tratamiento
el estudio incluyó a pacientes tratados por CCR metastásico en la Escuela de Medicina de la Universidad de Kinki, entre septiembre de 2010 y agosto de 2015. los pacientes habían recibido FOLFIRI (leucovorina, 5-fluorouracilo e irinotecán) o FOLFOX (leucovorina, 5-fluorouracilo y oxaliplatino) como primera o quimioterapia de segunda línea. La mayoría de los pacientes habían recibido, además, bevacizumab, pero no anticuerpos contra EGFR. Como la quimioterapia de tercera línea, los pacientes fueron tratados cada dos semanas con cetuximab, solo o en combinación con irinotecan. A no ser ajustada por el médico tratante, cetuximab se administró en una dosis inicial de 400 mg /m
2 y luego a 250 mg /m
2 semanal. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Kinki. Escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes. Los pacientes se dividieron en una cohorte de formación de 50, y una cohorte de validación 10.
Medición de anfirregulina plasma y heregulina
Las muestras de plasma se obtuvieron de los pacientes antes del tratamiento con anti-EGFR. Anfirregulina y los niveles de heregulina se midieron utilizando comercialmente disponible inmunoabsorción ligado a enzimas (kits de ensayo Amphiregulin Humana y heregulina Quantikine ELISA Kits, R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, una microplaca de 96 pocillos se recubrió con anticuerpo de captura, se lava, y se incubó con las muestras y patrones. La placa se lavó una segunda vez, sondó con anticuerpo de detección, y se marcó con un cromógeno. Por último, la absorbancia a 450 nm se midió utilizando un lector de placas espectrofotométrico. concentraciones Amphiregulin y heregulina se determinaron sobre la base de las curvas de calibración.
Se evaluó la evaluación del tratamiento con cetuximab
Objetivo respuesta a cetuximab, según los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos, ver. 1,1 [19]. La respuesta del tumor fue evaluada por un médico cada 2 a 3 meses mediante tomografía computarizada. La supervivencia libre de progresión se definió como el intervalo desde el inicio de la terapia anti-EGFR hasta la progresión del tumor o la muerte sin evidencia de progresión. La supervivencia global se mide como el número de días entre el inicio del régimen de cetuximab y la muerte.
Los análisis estadísticos
El objetivo primario de este estudio es evaluar la anfiregulina y heregulina como biomarcadores asociados con la respuesta objetiva tasa a la terapia anti-EGFR. Se analizaron ROC (receiver operating characteristics) se curva para determinar los puntos de corte para anfirregulina y expresión heregulina. Los puntos de corte óptimos se definieron como la distancia mínima a partir de (1 -especificidad, sensibilidad) = (0, 1). Las diferencias en la distribución de las variables se evaluaron utilizando
t
prueba para las variables cuantitativas y la prueba exacta de Fisher para las variables cualitativas. Para los grupos clasificados de acuerdo con puntos de corte, la tasa de respuesta objetiva fue comparado por la prueba exacta de Fisher, mientras que libre de progresión y la supervivencia global se compararon mediante curvas de Kaplan-Meier y log-rank test. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras, y un
p
valor & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Los análisis estadísticos y la visualización se realizaron en GraphPad Prism v.5.0 para Windows (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EE.UU.).
Resultados
Características de los pacientes
características de los pacientes se resumen en la Tabla 1. Todos los pacientes tenían de tipo salvaje
KRAS
. De los 50 pacientes analizados, 39 recibieron cetuximab e irinotecán como la quimioterapia de tercera línea. Sin embargo, todos los demás pacientes recibieron cetuximab en monoterapia, debido a la mala salud general o retención de líquidos. Trece pacientes experimentaron una respuesta parcial a cetuximab. Por lo tanto, la tasa de respuesta global fue del 26%. Dieciocho pacientes tenían tumores estables durante más de 8 semanas, mientras que 19 pacientes tuvieron progresión del cáncer a corto plazo. La tasa global de control de la enfermedad fue de 62%. La mediana libre de progresión y la supervivencia global fueron de 110 días y 201 días, respectivamente. El tratamiento se suspendió para todos los pacientes debido a la progresión del cáncer, a excepción de tres pacientes que se trasladaron a otro hospital. La toxicidad no era evidente. No hubo diferencias significativas en la tasa de respuesta cuando los pacientes fueron estratificados por para cada variable, incluyendo edad, sexo, localización del tumor primario, ECOG PS, y el régimen (prueba exacta de Fisher,
p Hotel & gt; 0,05, S1 Tabla) .
circulante anfirregulina y heregulina
concentraciones Amphiregulin y heregulina en el plasma se muestran en la figura 1A y 1B, con una mediana de 11,5 pg /ml (rango de 0 a 327 pg /ml) y 1,357.5 pg /ml (intervalo 0-18,045 pg /ml), respectivamente. No se observó correlación entre las concentraciones de estas moléculas (correlación de Pearson r = 0,067), y los niveles no se correlacionaron significativamente con las características del paciente, como el sexo, edad, localización del tumor primario, el estado funcional y protocolo de tratamiento (Tabla 2,
t
prueba, p & gt; 0,05). Anfirregulina nivel tiende a ser mayor en los pacientes que responden a cetuximab, mientras que el nivel heregulina es significativamente menor en los pacientes resistentes (
t
prueba,
p
= 0,001). Por lo tanto, se realizó un análisis de ROC para determinar los puntos de corte en el que anfirregulina y heregulina tienen una sensibilidad óptima y especificidad para predecir la respuesta o falta de respuesta a cetuximab, respectivamente (Fig 1C y 1D). A 16,8 pg /ml, anfirregulina tuvo una sensibilidad del 76,9% (IC del 95%: 46,2% -95,0%) y una especificidad del 67,6% (IC del 95%: 50,2% -82,0%). El uso de este punto de corte, 22 pacientes (44%) fueron consideradas anfirregulina positivo para predecir la respuesta con la tasa de respuesta del 45% (10/22). Por otro lado, la expresión de herregulina a 1292 pg /ml tenían sensibilidad (CI 95%: 44,8% -77,5%) 62,2% y una especificidad del 69,2% (IC del 95%: 38,6% -90,9%). Sobre la base de este punto de corte, 27 pacientes (54%) fueron considerados heregulina positivo para la predicción de la falta de respuesta con la tasa de respuesta es del 15% (4/27).
anfirregulina plasma (A) y heregulina (B) eran medida mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas. Cada barra representa un solo paciente. Características operativas del receptor (ROC) se muestran para la capacidad de anfirregulina (C) y heregulina (D) para predecir la respuesta y la falta de respuesta a cetuximab.
Asociación de anfirregulina y heregulina con respuesta cetuximab
Hemos investigado si el nivel combinado de anfirregulina plasma y heregulina se asoció con la respuesta a la terapia anti-EGFR (Tabla 3). Los pacientes fueron categorizados en cuatro clases dependiendo de si la expresión de cada molécula era alta o baja, con valores de corte establecidos por el análisis ROC (Figura 2). Por lo tanto, 15 pacientes se consideraron de baja y de alta anfirregulina heregulina, mientras que 13 fueron considera que tienen niveles bajos de ambos. De los pacientes restantes, 10 fueron clasificados como de alto nivel de ambos, y 12 fueron descritos como de alta y baja anfirregulina heregulina. tasa de respuesta objetiva fue evaluado en cada clase. En los pacientes que expresan abundantemente anfirregulina pero no heregulina, la tasa de respuesta objetiva fue del 58%. En particular, esta tasa de respuesta es significativamente diferente (
p
= 0,0069, prueba exacta de Fisher) de la tasa de respuesta del 16% en otros pacientes (n = 38). Por otra parte, la tasa de respuesta fue del 7% en pacientes con bajo y alto anfirregulina heregulina, el 15% en pacientes con baja anfirregulina y baja heregulina, y el 30% en los pacientes que expresan ambos ligandos en abundancia.
Los pacientes se clasificaron en cuatro grupos basados en la mediana de los niveles de anfirregulina (16,8 pg /ml) o heregulina (1292 pg /ml). Los puntos rojos son los pacientes que respondieron a la terapia anti-EGFR.
Asociación de anfirregulina plasma y heregulina con la supervivencia
Se analizó el impacto de los niveles de anfirregulina y heregulina en progresión la supervivencia global y libre. En consonancia con mejores tasas de respuesta, los pacientes que anfirregulina abundantemente expresa pero no experimentaron heregulina supervivencia libre de progresión significativamente más largo que otros pacientes (log-rank test,
p Hotel & lt; 0,05), con una mediana de 216 días y 81 días, respectivamente (Fig 3). Los pacientes que expresan ambas moléculas en niveles altos experimentado una mediana de 65 días libre de progresión, mientras que las que expresan tanto en niveles bajos tenían mediana de la supervivencia libre de progresión de 119 días. Por último, los pacientes que tienen baja anfirregulina y alta heregulina tuvieron la mediana de 76 días libre de progresión (Fig A en S1 Archivo).
Los niveles plasmáticos de anfirregulina y heregulina se midieron por ELISA. Los pacientes se dividieron en subgrupos basados en anfirregulina (AR) o heregulina abundancia (HRG), como se muestra en la figura 2. La curva roja representa la supervivencia en pacientes con alta y baja anfirregulina heregulina (n = 12), y la línea verde representa la supervivencia en el resto de los pacientes (n = 38).
Estas tendencias se reflejan en la supervivencia global. Por lo tanto, los pacientes con altos niveles de anfirregulina y bajos niveles de herregulina tendían a experimentar una mayor supervivencia en general que otros pacientes con la mediana de 356 días (figura 4). Las personas con niveles altos o bajos de ambas moléculas sobrevivieron durante una media de 231 y 164 días, respectivamente. Por último, los pacientes que expresan heregulina en abundancia, pero no tenían anfirregulina supervivencia global media de 150 días (Fig B en S1 Archivo).
Los niveles plasmáticos de anfirregulina y heregulina se midieron por ELISA. Los pacientes se dividen en subgrupos basados en la anfiregulina (AR) o heregulina (HRG) la abundancia, tal como se muestra en la figura 2. La supervivencia en pacientes con alta y baja anfirregulina heregulina (n = 12) se representa en rojo. La supervivencia en todos los demás pacientes (n = 38) se representa en verde.
Anfirregulina
plasma, heregulina, y la respuesta cetuximab en una cohorte de validación
Hemos validado la asociación de ambos ligandos con cetuximab respuesta utilizando un conjunto independiente de 10 pacientes. Tres de estos pacientes tenían alta y baja anfirregulina heregulina, mientras que tres tenían baja y alta anfirregulina heregulina. De los pacientes restantes, tres expresaron ambos ligandos en niveles bajos, y uno expresó tanto en abundancia (Fig C en S1 Archivo). Tres pacientes eran sensibles a la terapia anti-EGFR, todos los cuales tenían alta anfirregulina pero no heregulina (Tabla 4).
Discusión
Nosotros y otros han informado anteriormente de que los ligandos de EGFR, especialmente anfirregulina, están asociados con eficacia cetuximab [8-10]. En contraste, la heregulina ligando HER3 se correlacionó significativamente con la resistencia a cetuximab [13, 18]. Este estudio es el primero en examinar si la expresión combinada de anfirregulina y heregulina afecta el resultado de la terapia anti-EGFR en pacientes con CCR. Se encontró que los pacientes con altos niveles de anfirregulina y bajos niveles de heregulina responden significativamente mejor al cetuximab, con tasa de respuesta objetiva del 58% y 216 días de supervivencia media libre de progresión. La respuesta es notablemente mejor que la respuesta general publicada en la población general CRC [4, 20, 21]. Estos resultados fueron validados en una, pero cohorte independiente más pequeño, y sugieren que la evaluación de ambos anfirregulina y heregulina en el plasma puede predecir con mayor precisión los resultados cetuximab, y por lo tanto pueden servir de base para la optimización de los tratamientos de CRC.
En contraste , los pacientes que expresan abundantemente tanto anfirregulina y la experiencia heregulina malos resultados. Esta observación clínica es consistente con los experimentos de laboratorio utilizando el CRC línea celular DiFi [18]. De hecho, las células DiFi con altos niveles de anfirregulina han aumentado la sensibilidad a cetuximab, mientras que las células que sobreexpresan herregulina son resistentes a cetuximab
in vitro
y en xenoinjertos de ratón. Por lo tanto, los pacientes con estas características pueden requerir tratamientos adicionales, nuevas o alternativas para superar la resistencia. Por ejemplo, se ha demostrado que las células que sobreexpresan herregulina son sensibles a una combinación de cetuximab y patritumab, un anticuerpo contra HER3, a pesar de que cada anticuerpo en sí misma es ineficaz [18]. Por otra parte, la combinación de cetuximab con un inhibidor de aguas abajo de HER3 puede resultar también resultar eficaces. Tales compuestos incluyen inhibidores de PI3K y AKT.
En particular, tres pacientes con bajos niveles de anfiregulina también respondieron a cetixumab, lo que sugiere que EGFR se activa por otros ligandos en un pequeño grupo de pacientes. De hecho, EGFR se sabe que se une a seis ligandos diferentes, incluyendo EGF, factor de crecimiento transformante-α, anfirregulina, betacelluline, de unión a heparina-EGF, o epirregulina [8]. De estos, la expresión de epirregulina en los tumores se ha encontrado que se correlaciona también con una eficacia cetuximab [9, 10]. Al final, todos los ligandos de EGFR pueden tener que ser evaluado para predecir la respuesta al cetuximab.
Sin embargo, este estudio está limitado por el pequeño tamaño de la muestra, y la naturaleza retrospectiva del análisis. Para hacer frente a estas limitaciones, estamos realizando un ensayo clínico aleatorizado prospectivo de la terapia anti-EGFR en pacientes con CCR avanzado, en el que medimos el resultado clínico en función de anfirregulina plasma y heregulina. Anticipamos que este ensayo proporcionará más pruebas de la utilización de anfirregulina y heregulina como biomarcadores.
Apoyo a la Información
S1 conjunto de datos. conjunto completo de datos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0143132.s001 gratis (XLSX)
S1 Archivo. Kaplan-Meier de supervivencia libre de progresión (figura A). Kaplan-Meier de supervivencia global (figura B). Diagrama de dispersión de anfirregulina plasma y heregulina en la validación de cohorte que incluyó a 10 pacientes con cáncer colorrectal (Figura C)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0143132.s002 gratis (PDF) sobre Table S1. La tasa de respuesta cuando los pacientes fueron estratificados por para cada variable
doi:. 10.1371 /journal.pone.0143132.s003 gratis (PPTX)
Reconocimientos
Agradecemos a todos los pacientes que se encontraban inscritos en este estudio.