Extracto
La morfología celular determina el comportamiento celular, la transducción de señales, proteína-proteína la interacción y capacidad de respuesta a los estímulos externos. En el cáncer, estas funciones profundamente contribuyen a los mecanismos de resistencia a radio y quimioterapia. Con respecto a este aspecto, este estudio se comparó la expresión del genoma amplia de genes en crecimiento exponencial líneas celulares de diferentes entidades tumorales, carcinoma de pulmón y carcinoma de células escamosas, bajo más fisiológica tridimensional (3D) frente a condiciones de cultivo celular monocapa. el análisis de microarrays de ADNc del genoma completo se llevó a cabo utilizando el chip de genes Affymetrix HG 2.0 U133 Plus. Importancia del análisis de microarrays (SAM) y el análisis de la prueba t reveló cambios significativos en los perfiles de expresión génica de 3D relativo a las condiciones de cultivo de células 2D. Estos cambios afectaron la matriz extracelular y se asocia principalmente con los procesos biológicos como el desarrollo del tejido, la adhesión celular, el sistema inmune y la respuesta de defensa en contraste con los términos relacionados con la reparación del ADN, que carecía de alteraciones significativas. Selección de genes fueron verificadas por semi-cuantitativos RT-PCR y Western Blot. Además, se muestra que el crecimiento 3D media un aumento significativo en células tumorales radio y quimiorresistencia relativa a 2D. Nuestros resultados muestran importantes diferencias de expresión génica entre los sistemas de cultivo de células en 3D y 2D e indican que la capacidad de respuesta celular al estrés externo, como la radiación y quimioterapéuticos ionizante está esencialmente influenciada por la expresión diferencial de genes implicados en la regulación de la señalización de integrina, forma de la célula y célula-célula contactos
Visto:. Zschenker O, Streichert T, Hehlgans S, N Cordes (2012) análisis de expresión génica de genoma completo en células de cáncer Revela Crecimiento 3D para afectar ECM y los procesos asociados con la adhesión celular, pero no la reparación del ADN. PLoS ONE 7 (4): e34279. doi: 10.1371 /journal.pone.0034279
Editor: Kerstin Borgmann, Centro Médico Universitario de Hamburgo-Eppendorf, Alemania |
Recibido: 21 de junio de 2010; Aceptado: 27 Febrero 2012; Publicado: 11 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Zschenker et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La investigación y los autores fueron en parte con el apoyo de una beca del Ministerio Federal de Educación e Investigación, Alemania (BMBF Contrato 03ZIK041 a Carolina del Norte) y por el EFRE (Fondo Europeo de Desarrollo regional) Europäische Fonds für regionale Entwicklung, Europa fordert Sajonia (100066308). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El microambiente es un regulador fundamental de comportamiento de la célula [1], [2], [3]. Un gran cuerpo de trabajo ha demostrado cómo las interacciones de las células con la matriz extracelular (ECM), como uno de los componentes clave del microambiente, contribuyen a la regulación de las funciones celulares críticas tales como la forma de la célula /arquitectura, la supervivencia, proliferación y diferenciación [2], [4], [5], [6], [7], [8], [9]. las interacciones célula-ECM también controlan la expresión de genes y la organización de la cromatina en un crecimiento y ECM-dependiente manera [10], [11]. hallazgos emergentes recientes muestran que especialmente las condiciones de crecimiento desempeñan un papel esencial para la capacidad de respuesta celular a estímulos externos. Esto se hizo evidente en tres dimensiones (3D) ex cultivos de células in vivo cultivadas en ECM y en modelos esferoide [4], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [ ,,,0],17]. Es importante destacar que estos modelos de cultivo celular 3D imitan mejor un microambiente fisiológico que el plástico de cultivo celular no recubiertas o ECM-pre-revestido convencional [15], [18].
Además de la utilización de modelos de cultivo celular en 3D en el tejido de ingeniería [ ,,,0],19], [20], [21] y los estudios sobre el desarrollo embrionario y la fisiología [18], los cultivos de células en 3D se emplean cada vez más en la investigación del cáncer [7], [8], [9], [12], [16], [22]. En la gran mayoría de los casos, las líneas de células tumorales de diferente origen muestran una mayor resistencia a la radio y quimioterapia en un entorno 3D indicativo por el aumento de clonogenicidad y la disminución de la apoptosis [12], [13], [14], [16], [ ,,,0],17], [23], [24], [25], [26], [27]. Además de un efecto significativo de las interacciones integrina mediada por células ECM [28], una compleja interacción de las vías de señalización bioquímicas y factores biofísicos /relacionados mechanotransduction-se cree que confieren esta resistencia de las células tumorales mejorada cuyos mecanismos subyacentes no se habían determinado tanto en el gen y en el nivel de proteínas [2].
con respecto a la expresión génica, se han realizado grandes esfuerzos para identificar específica de diagnóstico, pronóstico y patrones de expresión génica en las biopsias de varios tumores malignos humanos [2] el seguimiento de la terapia de, [5], [6], [29], [30], [31]. Curiosamente, algunos de estos estudios demostraron una fuerte coincidencia entre in vivo y 3D, pero los conjuntos de datos de cultivo de células no 2D, lo que finalmente permitieron la identificación de los genes de las firmas de predicción de la supervivencia global de los pacientes con cáncer. Queda por aclarar si los cambios en la expresión génica bajo condiciones de crecimiento 3D frente a 2D se pueden explicar o dar consejos en ciertas vías de estrés o de reparación del ADN que participan en la radio- mejorado o quimio-resistencia de las células tumorales crecido en 3D. Si es así, dirigidos enfoques terapéuticos contra los promotores clave tumorales podrían ser optimizados.
Para abordar esta cuestión, este estudio se compara la expresión génica basal de dos líneas celulares de cáncer humano de origen diferente y con diferentes antecedentes genéticos en un andamio 3D ECM o en condiciones de una sola capa 2D convencionales con respecto a su comportamiento a la radiación y la quimioterapia.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares, condiciones de cultivo, y los tiempos de duplicación celular
células tumorales de pulmón A549 línea se obtuvo de ATCC (Manassas, EE.UU.). La línea celular de carcinoma de células escamosas UT-SCC15 fue una especie de regalo de R. Grenman (Hospital Central de la Universidad de Turku, Finlandia). Para el cultivo de células 2D convencional, las células se cultivaron en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; PAA, Cölbe, Alemania) que contiene Glutamax-I (L-alanil-L-glutamina), complementado con suero de ternera fetal 10% (FCS; PAA) y 1 ácidos% no esenciales aminoácidos (AANE; PAA) a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 7% de CO
2. Para el cultivo de células 3D, las células se sembraron en una mezcla de 0,5 mg /ml de la matriz extracelular laminina-rico (Matrigel; BD, Heidelberg, Alemania) y medio completo DMEM sobre una capa de agarosa (Sigma, Taufkirchen, Alemania) en un 24 así placa de cultivo celular (BD) publicada [12], [13], [14], [16].
momento de las células que crecen como monocapas en frascos de cultivo de células se contaron según los protocolos estándar de duplicación. Brevemente, las células individuales se sembraron en 2D o 3D y tripsinizaron y se transfirieron a 10 ml de medio que contiene FCS. Después de mezclar suavemente en el medio, 10 l de la solución de células con una pipeta en una cámara de recuento Neubauer utilizando una dilución apropiada. Las células en 4 cuadrados se contaron microscópicamente (Zeiss, Jena, Alemania) y se calculó el número de células como se describe anteriormente [32]. Para las células que crecen en un entorno 3D Matrigel, las células fueron aisladas como se describe anteriormente [23], [33] utilizando una cámara de recuento Neubauer.
3D y 2D ensayos de formación de colonias
supervivencia Clonigénicas bajo 3D condiciones se ensayó según lo publicado anteriormente [15], [16], [17], [34]. Brevemente, las células individuales se sembraron en 0,5 mg /ml de Matrigel suplementado con DMEM /10% FCS /1% NEAA. Después de 24 h, se irradiaron las células individuales (0-6 Gy) o tratadas con concentraciones crecientes cisplatino (0,1, 1, 5, 10 mM; de 24 h; Neocorp). El cisplatino se eliminó por 3- (2D) o 15 veces (3D) lavado con DMEM /10% FCS /1% NEAA. Entonces, se permitió que las células para crecer a las agrupaciones colonias /célula. En 8 (A549) o 11 días (UT-SCC15) después de la siembra, las colonias crecidas /grupos de células (& gt; 50 células) se contaron microscópicamente. supervivencia de las células 2D se realizó como publicado [23]. Después de 8 días (A549) o 11 días (UT-SCC15), las células se tiñeron con azul de Coomassie (Merck, Darmstadt, Alemania) y las colonias (& gt; 50 células) se contaron. eficiencias Plating se calcularon como sigue: número de colonias formadas /número de células sembradas. fracciones supervivientes se calculan como sigue: número de colonias formadas /(número de células sembradas (irradiados /cisplatino) × chapado eficiencia (no irradiado /sin tratar)). Cada punto de las curvas de supervivencia representa la fracción de supervivencia media de tres experimentos independientes.
La irradiación de los cultivos celulares
La irradiación se entregó a temperatura ambiente usando dosis únicas (0-6 Gy) de 200 kV X rayos gamma (YXLON Y.TU 320; YXLON, Copenhague, Dinamarca) por filtración con 0,5 mm de cobre. La tasa de dosis fue aproximadamente de 1,3 Gy /min a 20 mA. La dosis absorbida se evaluó usando un dosímetro dúplex (PTW, Freiburg, Alemania).
cDNA microarray
Perfil de expresión génica se midió con ARN extraído de 5 × 10
6 células cultivadas en 3D o 2D. Se preparó ARN total usando el kit NucleoSpin RNA II de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Macherey-Nagel, Düren, Alemania). Los procedimientos para la síntesis de ADNc, el etiquetado y la hibridación se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante (Affymetrix) y según lo publicado [35]. Todos los experimentos se realizaron con Affymetrix chip de genes del genoma humano HG U133 Plus 2.0. síntesis de ADNc primer lugar con 90 ng de ARN total, síntesis de cRNA marcado con biotina y limpiar se llevó a cabo utilizando el "Kit de 3 IVT Express (Affymetrix). Para la hibridación, 15 g de cRNA fragmentado se incubaron con el chip en 200 l de solución de hibridación en horno de hibridación 640 (Affymetrix) a 45 ° C durante 16 horas. a continuación, GeneChips se lavaron y se tiñeron con la estación 450 de fluidos Affymetrix según la expresión GeneChip de lavado, las manchas y la exploración manual utilizando el GeneChip hibridación, lavado y kit de tinción (Affymetrix). Microarrays fueron escaneadas con el escáner Affymetrix GeneChip 7G, y las señales fueron procesados mediante el SMOC (v.1.4; Affymetrix). Para comparar muestras y los experimentos se utilizó el algoritmo de RMA (expresión de la consola, V.1.1), análisis adicional se llevó a cabo con TIGR MeV (v.4.6.2). Tres repeticiones fueron utilizados para el análisis de microarrays y estadística. Para el análisis de SAM, se utilizó una relación de la señal de registro de 0,8 (-0,8) como un valor umbral que es igual a un factor de cambio de 1,6 y -1,6, respectivamente. están disponibles los datos de expresión génica en el Nº de Acceso GEO GSE17347. Para la lista de genes, enriquecimiento funcional se utilizó el ToppGeneSuite [36]. Caminos y otras agrupaciones funcionales de los genes fueron evaluados para la regulación diferencial utilizando la herramienta de visualización GenMAPP (Ver. 2.1) como se describe anteriormente [37].
SAM requiere la entrada de un valor "delta". El valor "delta" define el umbral del número de genes falsos positivos en el conjunto de datos validados. Para identificar una lista de genes potencialmente significativos, se calculó la tasa de falso descubrimiento (FDR). La estimación de FDR (la mediana del número de genes falsamente significativos) para cada "delta" dada (valor "delta") se determinó según Tusher et al. [38].
Semi-RT-PCR cuantitativa
Para la validación de los datos de microarrays por PCR, se utilizó ARN total aislado de perfiles de expresión génica. Se preparó ADNc con el kit Superscript ™ III de la transcriptasa inversa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Karslruhe, Alemania). Brevemente, el ADNc se sintetizó en un volumen de 20 l que contiene 1 g de ARN total tratado con DNasa, 1 l de oligo (dt)
20 (50 mM), y 1 l 10 mM dNTP Mix, 4 l de 5 × Primera tampón Strand, 1 l de DTT 0,1 M, 1 l de RNasa OUT y 1 l de superíndice III (200 U /l). ARN, dNTPs y el cebador oligo (dt) se mezclaron primero, se calienta a 65 ° C durante 5 min, y se colocaron en hielo hasta la adición de los componentes de reacción restantes. A continuación, la mezcla de reacción se incubó a 55 ° C durante 45 minutos y se terminó por inactivación por calor a 70 ° C durante 15 minutos. Una reacción idéntica sin la transcriptasa inversa se realizó para verificar la ausencia de ADN genómico. Semi-cuantitativos de RT-PCR se realizó para los genes TXNIP, dusp6, CEACAM1, NPC1 y BCL2A1 usando los cebadores listados en la Tabla 1 (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Alemania), 2 l de cDNA y HotStar Taq polimerasa (Qiagen, Hilden, Alemania ) de acuerdo con protocolos de PCR estándar. cebadores directos para todos los genes fueron seleccionados mediante la búsqueda en la secuencia de oligonucleótidos original del correspondiente número de identificación del gen del chip de genes Affymetrix en el sitio web de Affymetrix (http://www.affymetrix.com/analysis/index.affx). Los cebadores inversos se diseñaron basándose en la secuencia del gen proporcionado en la página web Affymetrix. recocido temperaturas de 50 ° C se utilizaron para TXNIP, dusp6 y BCL2A1 o 55 ° C durante CEACAM1 y NPC1. Para la normalización, un fragmento de β-actina de 540 pb se amplificó simultáneamente usando los cebadores listados en la Tabla 1 [39]. Los resultados de tres experimentos independientes se analizaron utilizando 1% de agarosa (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania) geles y análisis densitométrico con el software Image J® (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, EE.UU.) después de la tinción de geles con bromuro de etidio (Carl Roth).
extractos de proteínas totales y Western Blot
total de extractos de proteínas de cultivos de células 2D 3D de 4 días y se aislaron como se describe anteriormente [13]. En resumen, las células se trataron con tampón RIPA modificado (50 mM Tris-HCl (Carl Roth), pH = 7,4), 1% Nonidet-P40 (Sigma), 0,25% de desoxicolato de sodio (AppliChem, Darmstadt, Alemania), NaCl 150 mM (VWR International, Darmstadt, Alemania), 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (Merck), completa de cóctel inhibidor de la proteasa (Roche, Mannheim, Alemania), mM Navo 1
4 (AppliChem), NaF 2 mM (AppliChem)). Las muestras fueron almacenadas a -80 ° C. La cantidad total de proteínas se midió utilizando el ensayo de ácido bicinconínico (Pierce, Bonn, Alemania). Después de la electroforesis de sodio dodecil sulfato poliacrilamida gel y la transferencia de las proteínas a membranas de nitrocelulosa (Schleicher & amp; Schüll, Dassel, Alemania), se detectaron las proteínas con los siguientes anticuerpos: anti-fibronectina (BD, Heidelberg, Alemania), anti-CTGF, anti- ErbB3 (Santa Cruz, Heidelberg, Alemania), anti-BCL2A1 (LifeSpan Biosciences, Seattle, EE.UU.) y anti-β-actina (Sigma); peroxidasa de rábano picante conjugada con burro anti-conejo, burro anti-cabra y oveja anti-ratón (Amersham, Freiburg, Alemania) anticuerpos secundarios. SuperSignal® West Dura ampliada Duración Substrato (Pierce, Bonn, Alemania) y Amersham Hyperfilm ECL (GE, Munich, Alemania) fueron utilizados para la detección. Densitometría se realizó utilizando el software Image J®. Tres experimentos independientes se han realizado.
Resultados
características 3D y 2D de crecimiento celular y la supervivencia celular después de la radio- o quimioterapia
la forma celular y la morfología fueron diferentes entre 3D y 2D las condiciones de crecimiento celular (Fig. 1a). Cuatro días después de la siembra, las células fueron creciendo de manera exponencial con un tiempo de duplicación similares (fig. 1B). Esta similitud en los tiempos de duplicación celular proporcionado condiciones experimentales comparables para todo el análisis de la expresión de genes del genoma. Es importante destacar que los experimentos previos que evaluaron la supervivencia de radiación de las células A549 y UT-SCC15 se repitieron formando así el fundamento para el estudio presentado en enlace de radio-crecimiento-dependiente y la quimio-resistencia con la modificación de la expresión de genes de crecimiento dependiente [11]. En condiciones 3D, ambas líneas celulares mostraron supervivencia clonogénico significativamente mayor después de la exposición a dosis crecientes individuales de los rayos X o concentraciones crecientes de cisplatino en comparación con 2D (Fig. 1C y D). Estos datos sugieren una conexión entre las condiciones de crecimiento y morfología celular y radio-celular y la quimio-resistencia
.
(A) Representante imágenes y esquemática de 2D (
i
,
iii
) y 3D (
II, IV
) el crecimiento celular como se encuentra en el día 4 inmediatamente antes de aislamiento de ARN. Bares, 50 m. (B) tiempos de cultivos celulares en 2D y 3D en el día 4 de duplicación después de la siembra. Los resultados muestran la media ± SD (n = 3). N. S., no significativo. supervivencia clonogénico de 2D o 3D células crecido expuestos a dosis crecientes de rayos X (2, 4 o 6 Gy) (C) o las concentraciones de cisplatino (0,1, 1, 5, 10 mM) (D) aplicado 24 h después de la siembra. El cisplatino se retiró después de 24 h de 3- (2D) o 15 veces de lavado (3D) con DMEM /10% FCS /1% NEAA. Los resultados muestran la media ± SD (n = 3; t-test). * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01. CDDP, cisplatino. Bar, 200 micras.
genoma análisis de la expresión génica Total de A549 y UT-SCC15 cultivaron en 3D o 2D
Este análisis de la expresión de genes del genoma de ancho se realizó en condiciones no tratados y pretende identificar patrones de expresión de genes específicos de los genes individuales o grupos de genes funcionalmente relacionados que pueden estar vinculados a la radiactividad de las células tumorales y la quimio-resistencia. A partir de los perfiles de genes, la agrupación jerárquica y el análisis estadístico utilizando SAM, era obvio que las condiciones de crecimiento afectan los patrones de expresión de genes (Fig. 2A y B). La tasa de falso descubrimiento estimado (FDR) de 0 hasta el juego de "delta" ( "delta" = 2.873 en el A549; "delta" = 2,445 en UTSCC15). Un mayor número de genes se expresaron diferencialmente en A549 (376 transcripciones) que en células UT-SCC15 (178 transcripciones) (Fig 2A, Tabla 2;. Tabla S1 y S2). En 3D, las células A549 y UT-SCC15 mostraron más genes regulados hasta que las reguladas en comparación con 2D (Fig. 2A y B).
(A) grupos jerárquicos de genes de cultivos de células 2D y 3D en el día 4 después de la siembra. El color rojo indica los genes expresados por encima del promedio; verde indica que los genes expresados por debajo del promedio y negro indica la expresión media después del análisis de la importancia microarrays (SAM). "Positivo" indica los genes regulados positivamente en 3D frente a 2D. "Negativo" indica los genes regulados negativamente en 3D frente a 2D. (B) Parcela de número de transcripciones contra ratios de registro de señales de 3D en comparación con cultivos de células en 2D de las células A549 y UT-SCC15. (C) el trazado de ontología de genes dependiente del número absoluto y porcentaje de genes modificados significativamente en 3D frente a cultivos celulares en 2D según el análisis SAM.
De acuerdo con SAM, las células A549 tenían 242 transcripciones hasta - 134 y las reguladas mientras que las células UT-125 SCC15 tenían transcripciones arriba y hacia abajo 53 transcripciones reguladas (Fig 2A y B, Tabla S1 y S2.). Curiosamente, estas dos líneas celulares diferentes mostraron una superposición de los componentes celulares y funciones biológicas que se ve afectado en condiciones de crecimiento 3D en relación con la ontología de genes (Fig. 2C, los cuadros S3 y S4). células UT-SCC15, en general, demostraron menos genes modificados por el crecimiento 3D en comparación con células A549 (Fig. 2A, Tabla S2). A partir de un gen comparación expresión de uno a uno, se hizo evidente que las modificaciones se producen en diferentes genes dentro de los mismos grupos de componentes celulares o funciones biológicas de una manera dependiente de la línea celular. En la parte superior de la SAM, se realizó un análisis de la prueba t en el que 856 genes son regulados hasta 721 y las reguladas en 3D cultivo de células A549 con relación a 2D (para tomar nota: umbral SLR +/- 0,8). En las células UT-SCC15, 429 genes fueron regulados hasta 277 y las reguladas en 3D en comparación con 2D. La superposición de los genes expresados diferencialmente sobre SAM y t-test para la comparación 3D-a-2D reveló 238 transcripciones hasta reguladas y 128 transcripciones abajo-regulada en células A549 y 119 transcripciones hasta reguladas y 52 transcripciones de las reguladas en UT SCC15 células (Tabla S5 y S6) Estos hallazgos indican que los procesos asociados con la adhesión celular, la adhesión biológica, respuestas del sistema inmune, las respuestas de defensa, el desarrollo del tejido y la respuesta a la sustancia orgánica se regulan predominantemente a través de la expresión génica diferencial cuando las células se transfieren de un 2D a un microambiente basada en matriz 3D. Sin pronunciados cambios de expresión de genes implicados en la reparación del ADN, se puede especular que las células radiactivos y quimiorresistencia de 3D crecido resultados de concreto, aún no identificado, los cambios de la arquitectura celular y modificaciones presente inducidos de la interactome celular en términos de la transducción de señales y proteínas interacciones proteínicas.
validación de datos de microarrays de PCR y Western Blot
Para la validación de datos de microarrays, los genes y las proteínas seleccionadas fueron examinadas usando semi-cuantitativos RT-PCR (proteína tiorredoxina interactuar (TXNIP) , doble especificidad fosfatasa 6 (dusp6), carcinoembrionario molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno-1 (CEACAM1), la enfermedad de Niemann-pick, tipo C1 (NPC1) y la proteína relacionada con BCL2-A1 (BCL2A1)) y Western Blot (fibronectina (FN1),
Los ratios de registro de señal de los genes seleccionados a partir de cultivos de células 3D o 2D se muestran en conectivo del factor de crecimiento de tejido (CTGF), v-erb-b2 leucemia eritroblástica oncogén viral homólogo 3 (ErbB3) y BCL2A1), respectivamente. Figura 3. TXNIP y genes presentes dusp6 expresan cada vez en ambas líneas celulares cuando se cultivan en 3D con respecto a 2D (Fig. 3). inducción CEACAM1 y NCP1 y la represión BCL2A1 solamente se observaron en cultivos de células A549 3D (Fig. 3). Semi-cuantitativos RT-PCR sobre RNA de muestras utilizadas para el análisis de microarrays confirmados indujo la expresión TXNIP en 3D, mientras que el aumento de expresión dusp6 sólo pudo ser confirmada en células UT-SCC15 (Fig. 4A y B). los niveles de mRNA CEACAM1 mejoradas fueron detectables tanto en 3D A549 y cultivos celulares 3D UT-SCC15, que era de confirmación de A549 y marginal de células UT-SCC15 con respecto a los datos de microarrays de ADN (Fig. 4A y B). Los genes NPC1 y BCL2A1 mostraron niveles estables de la amplia análisis del genoma en células A549 o UT-SCC15, respectivamente reducidos o nulos; resultados plenamente confirmadas por semi-cuantitativos RT-PCR (Fig. 4A y B).
La expresión de los genes TXNIP1, dusp6, CEACAM1, NPC1 y BCL2A1 está delineado comparativamente de 3D frente a cultivos celulares de A549 y 2D UT -SCC15 células.
(A) semi-cuantitativos de RT-PCR se realizó como se describe en Materiales y Métodos. Se muestran 1% geles de agarosa con fragmentos de RT-PCR de TXNIP, dusp6, CEACAM1, NPC1 y mRNAs BCL2A1 aisladas de A549 o células UT-SCC15. Las muestras se amplificaron a partir de ADNc generado mediante transcripción inversa de ARN total de 4 días de edad-cultivos de células 2D y 3D. Todos los experimentos (V1, V2, V3) se exhiben. ß-actina expresión sirvió como control de carga (540 pb). mostrar los resultados (B) Los gráficos de análisis densitométrico de la expresión del ARNm indicado después de la normalización de beta-actina. Los resultados muestran la media ± SD (n = 3).
A continuación, un conjunto diferente de genes (FN1, CTGF, ERBB3, BCL2A1) se comprobó en el nivel de proteínas por Western Blot. Los ratios de registro de señales de estos genes generadas por el microarray de ADN fueron: FN1 = 1,6 /n.c. (A549 /UT-SCC15); CTGF = 1,2 /-3,8 (A549 /UT-SCC15); ERBB3 = 2,2 /n.c. (A549 /UT-SCC15); BCL2A1 = -3.8 /n.c. (A549 /UT-SCC15) (Fig. 5A, el cuadro S1 y S2). En cultivos de células A549 3D, el análisis de la expresión de proteínas confirmó la basada en microarrays de ADN sobre regulación de fibronectina, CTGF y ERBB3 así como la baja regulación de BCL2A1 (Fig. 5B y C). 3D UT-SCC 15 cultivos de células no mostró cambios de las proteínas examinadas, incluyendo CTGF, lo que demuestra una fuerte represión de acuerdo con nuestro análisis basado en microarrays (Fig. 5B y C). En la mayoría de los casos, estos datos mostraron resultados similares entre todo el genoma análisis de la expresión génica utilizando el formato de ancho de microarrays y RT-PCR o Western Blot.
(A) ratios de registro de la señal de los genes seleccionados (FN1, CTGF, ERBB3 y BCL2A1 ) a partir de análisis basado en microarrays de ADN se sometieron a análisis de transferencia Western. (B) lisados de células enteras se prepararon a partir de cultivos de células en 3D y 2D en el día 4 después de la siembra. SDS-PAGE y análisis de transferencia Western se realizaron como se describe en Material y Métodos. Imágenes representativas muestran la expresión de la fibronectina (240 kDa), CTGF (38 kDa), ErbB3 (180 kDa) y BCL2A1 (20 kDa). β-actina sirvió como control de carga. (C) Las unidades densitométrico de las bandas de proteínas se muestran en 'B' se trazan sobre la normalización de ß-actina.
Discusión
La pérdida de características funcionales y fenotípicas se produce cuando las células son cultivadas ex vivo en un microambiente 2D [1], [4], [18], [20]. Esto se puede prevenir mediante el cultivo de células en los andamios de ECM 3D fisiológicos que se muestran para diferentes puntos finales, tales como la expresión de proteínas, la morfología, y la predicción de las firmas de genes para el resultado clínico [2], [5], [6], [29], [30] . Teniendo en cuenta estos puntos, nos hemos centrado en los mecanismos que modulan la sensibilidad de las células tumorales a radio y quimioterapia. Para evaluar el impacto de los perfiles de expresión génica basal en el 3D más fisiológica frente a los modelos de cultivo celular 2D artificiales, este estudio se realizó en líneas celulares de cáncer epiteliales humanas procedentes de dos de los cánceres más frecuentes en todo el mundo, es decir, de pulmón (A549) y de cabeza y El carcinoma de células escamosas del cuello (UT-SCC15) [40]. Seleccionado de varios modelos de líneas celulares ensayadas en nuestro laboratorio, estas dos líneas celulares de cáncer varían en su origen y antecedentes genéticos y son los principales ejemplos que muestran los efectos prosupervivencia de crecimiento en un andamio 3D ECM en comparación con plástico de cultivo utilizado convencionalmente [11], [ ,,,0],12], [13], [14]. Mostramos cambios significativos en los perfiles de expresión génica de 3D frente a cultivos celulares en 2D. Mientras que los genes implicados en las vías de reparación del ADN se quedaron sin modificar, la mayoría de los genes alterados en ambas líneas celulares se asociaron con las funciones biológicas como el desarrollo del tejido, la adhesión celular, y la respuesta de defensa. Validación de datos de microarrays se realizó en los genes seleccionados en ARNm y proteínas.
Cultivos celulares
3D se emplean cada vez más en la investigación del cáncer, así como la ingeniería de tejidos, del desarrollo y la biología celular. Para el desarrollo de la terapia, la capacidad de respuesta celular es la cuestión clave y dramáticamente diferente en un entorno fisiológico 3D en comparación con las condiciones de placa de Petri. Con respecto a la supervivencia celular clonogénico después de la exposición a los rayos X o el fármaco quimioterapéutico ampliamente aplicado cisplatino, tanto en células A549 y UT-SCC15 muestran un aumento de las tasas de supervivencia en 3D con relación a 2D. Ya que estos son sólo dos ejemplos de entre varios [12], [13], [14], [15], [23], [24], los paradigmas "de adhesión celular mediada por radioresistance" y "adhesión mediada por resistencia a fármacos de células", principalmente examinado en placas de cultivo celular ECM-revestidos convencionales han de ser re-evaluado mediante la adopción de severas modificaciones en por ejemplo, transducción de señales, los procesos de reparación de ADN, etc en cuenta cuando las células crecen en 3D. Es importante destacar que las diferencias en parámetros tales como la hipoxia, la proliferación y la dosimetría de la radiación que son bien conocidos como determinantes esenciales de radiosensibilidad celular podrían ser excluidos en un anterior análisis comparativo en profundidad entre 3D y 2D condiciones de cultivo celular [11]. Por lo tanto, el modelo de cultivo celular basado en ECM 3D se utiliza aquí es un método razonable y viable para las investigaciones de radio- células tumorales y la quimiosensibilidad y los mecanismos subyacentes.
A pesar de nuestro conocimiento sobre alteraciones graves de patrones de expresión génica mediante la separación de las células de los tejidos para cultivos celulares ex vivo 2D [1], [41], [42], estos resultados han sido ampliamente descuidada. En 2D, tanto el número de genes expresados diferencialmente y los niveles de expresión génica en líneas celulares de tejidos tumorales y normales se disminuido hasta en un 70% y tenía un rango de fluctuación de aproximadamente 1,5 veces en comparación con los tejidos originarios, respectivamente [43 ], [44]. La comparación de nuestro análisis de microarrays con el trabajo de otros, encontramos perfiles de expresión de genes similares. Por ejemplo, tanto A549 y UT-SCC15 mostraron patrones basales distintivos de genes que codifican para proteínas con funciones en la modulación de la ECM como laminina, fibronectina, colágeno, un hallazgo observado de manera similar en un análisis de la expresión génica basal de líneas de células 60 cancerosas y su correspondientes tejidos de cáncer y en un estudio realizado sobre el melanoma [30], [42]. Estos datos apoyan aún más nuestra idea de que los cultivos celulares 3D son más fisiológica y similar a un tejido de 2D. A pesar de las tasas de crecimiento similares de nuestras líneas celulares ensayadas humanas tumorales, procesos de diferenciación celular asociados con modificaciones en, por ejemplo, proteínas ECM podrían pronunciada influencia la capacidad de respuesta de las células tumorales a las diferentes terapias.
De suma importancia para nosotros fue el hallazgo de que cultivos celulares 3D genes diferencialmente expresa involucrados en la "matriz extracelular" y "adhesión celular", así como 'respuesta de defensa', pero no en "la reparación del ADN '. Como la modulación de los genes implicados en la regulación del tamaño celular y la adhesión no es sorprendente cuando las células se transfieren de monocapa a un entorno 3D, estos resultados sugieren fuertemente que el nivel de expresión de genes particulares asociados con la reparación del ADN no está necesariamente ligada funcionalmente a un comportamiento celular observada. En nuestro caso, irradiado o A549 tratados con cisplatino y UT-SCC15 mostró una supervivencia clonogénico superior bajo condiciones de crecimiento 3D en comparación con 2D; sin embargo, un aumento correspondiente en la expresión de, por ejemplo, genes de reparación del ADN, tales como PRKDC (proteína quinasa, ADN-activado, polipéptido catalítico), ATM (ataxia telangiectasia mutada) o MDC1 (mediador de daño de ADN puesto de control 1) estaba ausente. En conclusión y en contraste con estudios de evaluación de la predicción de la radioterapia y la capacidad de respuesta de la quimioterapia, se puede especular que el determinante principal de esta mejora de la supervivencia es probable que sea el interactome proteína y no el transcriptoma. En cuanto a la transferencia de los datos de Bench-a-lado de la cama para la terapia, debe hacerse hincapié en que los datos generados en muestras de tumores con fenotipos conservados, incluyendo perfiles de expresión génica, es probable que sea más relevante que datos 2D y se pueden utilizar para identificar los centros de señalización esenciales para la terapia de destino.
en resumen, los datos presentados demuestran claramente que las condiciones de crecimiento tienen un profundo impacto sobre la expresión génica. Dado que los cultivos de células en 3D reflejan las condiciones de crecimiento fisiológicos y confieren resistencia a la terapia de células cancerosas, estos hallazgos sugieren que, en el nivel del transcriptoma, forma de la célula y célula-célula contacto son dos de los principales determinantes de la capacidad de respuesta celular al estrés externo. Esta noción se puede propagar a una más realista mayor complejidad, en la que los cambios estructurales y comunicativas en el proteoma añaden señales sustanciales para la regulación del comportamiento celular, en particular la resistencia a la terapia. Los estudios futuros en modelos de cultivo celular optimizadas tales como el modelo 3D ECM están garantizados para hacer frente a los mecanismos de transcriptómica y proteómica de la biología de las células tumorales, la capacidad de respuesta terapia del cáncer y la evaluación de nuevas dianas potenciales de cáncer.
información de apoyo sobre Table S1. análisis de la expresión génica en 3D
frente a cultivos de células A549 2D.
doi: 10.1371 /journal.pone.0034279.s001 gratis (DOC) sobre Table S2. análisis de la expresión génica en 3D
frente a cultivos celulares 2D UT-SCC15.
doi: 10.1371 /journal.pone.0034279.s002 gratis (DOC) sobre Table S3.
de Gene ontología análisis, componente celular. La superposición está marcado en cursiva /negrita.