Extracto
Antecedentes
Entre los cánceres ginecológicos, cáncer de ovario es el segundo más común y tiene el mayor índice de mortalidad. El cáncer es una enfermedad genética y se presenta debido a la acumulación de mutaciones somáticas en los genes críticos. La comprensión de la base genética del cáncer de ovario tiene implicaciones tanto para la detección precoz y para la intervención terapéutica en esta población de pacientes.
Metodología /Principales conclusiones
Quince líneas celulares de cáncer de ovario, comúnmente utilizados para los experimentos in vitro, fueron seleccionados para mutaciones utilizando la secuenciación directa bidireccional en todas las regiones codificantes del
BRAF
,
MEK1
y
MEK2
.
BRAF
se identificaron mutaciones en cuatro de las quince líneas celulares de cáncer de ovario estudiados. En conjunto, estas cuatro líneas celulares contenían cuatro
BRAF
mutaciones diferentes, dos de los cuales eran nuevos. ES-2 tenía la mutación común p.V600E B-Raf en el exón 15 y Hey contenía un exón 11 mutación sin sentido, p.G464E. Los dos nuevos mutantes B-Raf identificados fueron un 5 amino ácido deleción heterocigota p.N486-P490del en OV90, y un missense p.Q201H exón 4 sustitución en OVCAR 10. Una de las líneas celulares, ES-2, contenían una mutación en MEK1, en concreto, una novela missense sustitución heterocigótica, p.D67N originada como consecuencia del G nt 199 → una transición. Ninguna de las líneas celulares contenían codificación región mutaciones en
MEK2
. Caracterización funcional de la MEK1 p.D67N mutante mediante transfección transitoria con el análisis de transferencia Western posterior demostró un aumento en la fosforilación de ERK en comparación con los controles.
Conclusiones /Importancia
En este estudio, se presenta la novela
BRAF
mutaciones en el exón 4 y el exón 12 y también informan de la primera mutación en
MEK1 servicios asociados con el cáncer humano. Los datos funcionales indican la alteración
MEK1
mutación puede conferir a través de la activación de la vía MAPK. La importancia de estos hallazgos es que
BRAF
y
MEK1 /2
mutaciones pueden ser más comunes de lo previsto en el cáncer de ovario que podría tener importantes implicaciones para el tratamiento de los pacientes con esta enfermedad y sugiere posibles nuevos vías terapéuticas
Visto: AL. Estep, Palmer C, F McCormick, Rauen KA (2007) Análisis de mutación de
BRAF
,
MEK1
y
MEK2
en 15 líneas celulares de cáncer de ovario: implicaciones para la terapia. PLoS ONE 2 (12): e1279. doi: 10.1371 /journal.pone.0001279
Editor Académico: Amanda Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 25 Julio, 2007; Aceptado: 13 Noviembre 2007; Publicado: 5 de diciembre 2007
Derechos de Autor © 2007 Estep et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Subvención del NIH HD048502 (KAR) proporcionó financiación parcial. Fundación Canaria proporcionó financiación parcial. La Fundación Canaria no tuvo un papel en la recopilación, análisis e interpretación de los datos
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es el segundo cáncer ginecológico más común en los Estados Unidos que afecta a aproximadamente 22.000 mujeres cada año causando un estimado de 15.200 muertes [1]. El cáncer es un trastorno genético que surge de la acumulación de mutaciones somáticas en los genes implicados en las vías celulares críticas. Estas mutaciones típicamente dar como resultado proteínas que exhiben su efecto oncogénico mediante la alteración de la señalización a través de redes de transducción de vitales, o en la haploinsuficiencia de proteínas críticas supresores de tumores.
La comprensión de la base genética de cáncer de ovario tiene implicaciones tanto para la detección precoz, así como para la intervención terapéutica en esta población de pacientes. Los genes que se han encontrado somáticamente mutado en el cáncer de ovario incluyen
KRAS
[2] - [5],
ANR
[2],
PIK3CA
[5] - [9 ],
PTEN
[5], [10], [11],
TP53
[5], [12], [13] y
BRAF
[2] - [4]. B-Raf, el producto proteico de
BRAF
, es una proteína quinasa de serina /treonina y la primera en la cascada activada por mitógenos proteína quinasa (MAPK), que es una de las muchas vías efectoras aguas abajo de Ras. estímulos extracelulares conduce a la activación de Ras, que a su vez activa Raf (A-Raf, B-Raf, y /o C-Raf-1). Raf fosforila y activa MEK1 y /o MEK2 (MAPK quinasa). MEK1 y MEK2 son treonina /tirosina quinasas con ambas isoformas que tienen la capacidad de fosforilar y activar ERK1 y ERK2 (MAPK). ERK, una vez activado por MEK, tiene numerosos citosólicas y nucleares sustratos [14]. aguas arriba de señalización aberrante que resulta en hyperactivated ERK juega un papel clave en la patogénesis y progresión de aproximadamente 30% de los cánceres humanos, incluyendo el cáncer de ovario [15]. Como resultado, esta vía ha sido un objetivo atractivo para el desarrollo de inhibidores de moléculas pequeñas para el tratamiento del cáncer [16].
genes que comprende la vía MAPK,
BRAF
,
MEK1
y
MEK2
, fueron escaneados de forma sistemática en busca de mutaciones en 15 líneas celulares de cáncer de ovario mediante secuenciación directa bidireccional de todos los exones. Los informes anteriores han demostrado que la B-Raf está mutado en aproximadamente el 28-37% de los carcinomas serosos de bajo grado [3], [17]. Con esta información, nuestra búsqueda se amplió para incluir
MEK1
y
MEK2
, dos genes junto con
BRAF
, que hemos determinado recientemente para ser causal para cardio-facio (CFC) síndrome -cutaneous (MIM 115150), un síndrome de malformación congénita múltiple mediante el cual los individuos tienen dismorfia craneofacial característico, defectos cardíacos y anomalías ectodérmicas [18]. Curiosamente, a diferencia de las mutaciones germinales identificados en el síndrome de CFC, no hay mutaciones somáticas han sido jamás identificados en
MEK1 /2
en cualquier tipo de cáncer. En nuestro análisis, la novela
BRAF
se identificaron mutaciones en el exón 4 y el exón 12 de dos líneas celulares diferentes. Además, se presenta la primera mutación funcional en
MEK1 servicios asociados con el cáncer humano. La importancia de estos hallazgos es que
BRAF
y
MEK1 /2
mutaciones pueden ser más comunes de lo que se reconoce en el cáncer de ovario, lo que podría tener importantes implicaciones para el tratamiento de pacientes con cáncer de ovario.
resultados
BRAF y MEK1 mutaciones
El ADN genómico de 15 líneas celulares de cáncer de ovario se proyectó para
BRAF
mutaciones en los exones 1-18 de codificación. Cuatro mutaciones se identificaron en cuatro líneas celulares individuales: OVCAR 10, OV90, Hey y ES-2 (Figura 1). Ninguna de las otras líneas celulares tenían
BRAF
mutaciones. Dos de los cuatro
BRAF
mutaciones identificadas fueron novela. OVCAR 10 contenía una G → T transversion nt 603 causando una sustitución p.Q201H missense heterocigótica en el exón 4 (Figura 1A). OV90 contenía una novela heterocigotos 5 deleción de aminoácidos, p.N486-P490del, en el exón 12 (Figura 1B). Además de los dos novela
BRAF
mutaciones identificadas, se identificaron dos mutaciones adicionales que han sido reportados previamente en el cáncer. Hey contenía una nt 1391 G → Una transición que resulta en una mutación missense exón 11, p.G464E (Figura 1C). El electroferograma demostró la pérdida de heterozigosidad en este locus. ES-2 contenía un exón 15, T → A transversion en el nt 1799, sustituyendo el ácido glutámico por valina en la posición 600 (p.V600E) (Figura 1D). Ninguna de estas mutaciones se identificaron en los controles.
Cuatro
BRAF
mutaciones se identificaron en cuatro líneas de células individuales. A) OVCAR 10 contenía una G → T transversion nt 603 causando una sustitución p.Q201H missense heterocigótica en el exón 4. B) OV90 contenía una deleción heterocigota novela de partida en el nt 1457 (flecha) que resulta en una deleción de 5 aminoácidos, p.N486 -P490del, en el exón 12. C) Hey contenida una nt 1391 G → a transición que resulta en la pérdida de heterozigosidad. D) ES-2 contenía un exón 15, T → A transversion en el nt 1799, sustituyendo el ácido glutámico por valina en la posición 600 (p.V600E). E) Una nt 199 G → A transición en el
MEK1, España exón 2 resultó en un cambio de sentido erróneo heterocigóticos, p.D67N.
Todos los once exones de codificación de
MEK1
y
MEK2
también fueron secuenciados en las mismas líneas celulares y los controles. Una mutación en
MEK1
fue identificado en ES-2 que consiste en una novela missense sustitución heterocigótica, p.D67N, originada como consecuencia del nt 199 G → Una transición (Figura 1E). No se identificaron otras sustituciones no sinónimas en MEK1. Los once exones de
MEK2
se secuenciaron y no hay sustituciones no sinónimas fueron identificados codificación.
Variación de nucleótidos
Además de estas mutaciones, un total de cuatro polimorfismos de nucleótido único sinónimo diferentes (SNPs) se identificaron en
BRAF gratis (Tabla 1),
MEK1 gratis (Tabla 2), y
MEK2 gratis (Tabla 3). Tres de estos cuatro SNPs se encontraron en cinco o más de las quince líneas celulares y se ha informado anteriormente (www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/). En orden de frecuencia, los tres SNP base de datos sinónimo incluyen: i) MEK2 p.I220I (rs10250) presente en 11 de las 15 líneas celulares (73%), ii) BRAF p.G634G (rs9648696) se encontró en seis de la celda 15 líneas (40%) y, iii) MEK2 p.D151D (rs17851657) identificado en cinco de las líneas 15 celulares (33%). Había una identificación única MEK1 SNP en OVCAR 10 resultante de una G heterocigotos nt 348 → A transición en el exón 3, p.Q113Q (Tabla 2). Todos sinónimo SNPs se caracterizaron por SIFT (Clasificación intolerante De Tolerante) y decidido a ser tolerado.
Caracterización funcional de los mutantes
SIFT se utilizó para caracterizar la importancia funcional de las sustituciones de aminoácidos no sinónimas identificados en B-Raf y MEK1. B-Raf p.G464E, p.N486-P490del, p.V600E y p.D67N MEK1 se prevé que ser sustituciones nocivos que causan una alteración de la función de la proteína, mientras que B-Raf p.Q201H se predijo a ser tolerado.
Para corroborar la alteración funcional de la novela mutante MEK1 p.D67N identificado en ES-2, la transfección transitoria de células HEK 293T con el análisis de transferencia Western demostró posterior aumento de la actividad quinasa como se mide por la fosforilación de ERK (Figura 2). El mutante p.D67N MEK1 había aumento de la fosforilación de ERK en comparación con wildtype MEK1. El nivel de fosforilación de ERK fue menor que el mutante p.Y130C CFC MEK1 que se sabe que tiene un alto nivel de actividad (control positivo).
células 293T de riñón embrionario humano se transfectaron transitoriamente con el vector vacío, silvestre escriba MEK1, p.Y130C MEK1 (mutante control positivo que ha conocido alto nivel de actividad [18]) y el mutante MEK1 p.D67N. ERK (ERK1 y ERK2 p44 p42) fosforilación se ensayó por transferencia Western utilizando anticuerpos fosfo-específicos. El mutante MEK1 p.D67N había aumento de la fosforilación de ERK en comparación con el nivel inducido por el vector vacío y de tipo salvaje MEK1. El nivel de fosforilación de ERK inducida por MEK1 p.D67N es ligeramente menor que el mutante p.Y130C CFC MEK1 que se sabe que tiene una mayor actividad [18]. Myc-etiquetados MEK1 se muestra la eficiencia de transfección y ERK total se indica como control de carga.
Discusión
alteraciones en la señalización a través de la vía MAPK en el cáncer a menudo resulta de mutaciones en los componentes de nivel superior de ERK, incluyendo K-Ras, N-Ras, H-Ras, C-Raf-1 y B-Raf [15]. Los estudios moleculares de líneas celulares de cáncer de ovario y las muestras de tumor han identificado mutaciones genéticas en algunos de estos genes,
KRAS
,
ANR
y
BRAF
, que dan como resultado la alteración de señalización a través de esta vía fundamental [2], [19] - [23].
Las mutaciones somáticas en
BRAF
se han reportado con una frecuencia elevada en numerosos tipos de cáncer como el melanoma, tiroides, colon y de ovario. Aproximadamente 70 mutaciones sin sentido que afectan a 34 codones se han reportado (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic). En el cáncer, la mayoría de los somática
BRAF
mutaciones dan lugar a sustituciones de cambio de sentido que se encuentran en, pero no limitado a, el exón 11 (el bucle rico en glicina) y el exón 15 (el segmento de activación) en el dominio de la proteína quinasa [ ,,,0],24]. Una mutación sin sentido en el exón 15 que resulta en un cambio de sentido erróneo, B-Raf p.V600E, representa más del 90% de los
BRAF
identificaron mutaciones en el cáncer humano. La estructura cristalina de B-Raf muestra que el segmento de activación se lleva a cabo en una conformación inactiva por asociación con el G-bucle. Las mutaciones en estas dos regiones, el bucle rico en glicina y el segmento de activación, se cree que interrumpir esta interacción, la conversión de B-Raf en su conformación activa [25].
Además de las mutaciones somáticas, las mutaciones en línea germinal
BRAF
recientemente se han identificado como causantes de síndrome de CFC, un trastorno anomalía congénita múltiple mediante el cual los individuos tienen dismorfismos características craneofaciales, defectos cardíacos, anomalías ectodérmicas y retraso en el desarrollo [18], [26]. La mayoría de las mutaciones en el síndrome de CFC caen fuera del dominio quinasa exón 11 y el exón 15 de la proteína. El causante CFC mutación más común, p.Q257R, reside en el exón 6 del dominio rico en cisteína. Como la mayoría de las mutaciones que causan cáncer en
BRAF
, estudios bioquímicos han determinado que la mayoría de las proteínas mutantes novela CFC B-Raf han aumentado la actividad quinasa en relación con la actividad quinasa de tipo salvaje de B-Raf [18], [26 ]. Estos estudios marcan el hecho de que
BRAF
mutaciones ocurren no sólo somáticamente, sino también en la línea germinal, y que las mutaciones que confieren un aumento en la actividad de quinasa no se limitan a las que normalmente se asocia con el cáncer.
secuenciación bidireccional de todos los exones codificantes de
BRAF
en 15 líneas celulares bien caracterizadas y altamente utilizados con cáncer de ovario identificaron cuatro líneas celulares con
BRAF
mutaciones. Sólo una línea celular tenía el exón 15 común
BRAF
mutación. ES-2 que se deriva de carcinoma de células claras de ovario [27] tenía la mutación heterocigota p.V600E missense común. Los informes anteriores han demostrado que la B-Raf se muta con mayor frecuencia en los carcinomas de ovario seroso de bajo grado con una frecuencia de aproximadamente 28-37% y que todas las mutaciones son la variante común p.V600E B-Raf [3], [17]. Curiosamente, las dos líneas de células serosas-derivados examinados en este estudio (Hey y OV90) no tenían la mutación común p.V600E B-Raf; Sin embargo, ambos hicieron contener
BRAF
mutaciones. Hey, derivada de un carcinoma seroso papilar [28], que contiene un exón 11 mutación de sentido erróneo, p.G464E. Esta mutación sin sentido se ha descrito previamente (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic) y también es un codón que está mutado en el síndrome de CFC ([29]; Rauen, datos no publicados). OV90 que se deriva de un adenocarcinoma seroso [30] contenía una nueva mutación en el exón 12 que resulta en una deleción de cinco aminoácidos heterocigotos, p.N486-P490del. Aunque es extremadamente raro, el exón 15 somática B-Raf en el marco de deleción-inserciones se han reportado en el cáncer [31], [32]. Además, se identificaron dos individuos CFC con pequeñas deleciones en marco en el exón 11 (Rauen, datos no publicados). Finalmente, OVCAR 10, que se deriva de un cáncer epitelial de ovario humano, tenía un p.Q201H sustitución missense heterocigótica único en el exón 4. Este nonsynonymous SNP no se ha identificado en el cáncer o el síndrome de CFC y se determinó que era tolerado por SIFT, por lo quizás B-Raf p.Q210H representa un polimorfismo poco frecuente.
Sólo dos de las líneas celulares de cáncer de ovario tenía mutaciones en el exón típicamente afectados 11/15 regiones en el dominio de la proteína quinasa B-Raf. Este hallazgo plantea la posibilidad de que los casos de cáncer asociados
BRAF
mutaciones fuera del exón 11/15 puede ser más común de lo previsto. Dado que la gran mayoría de los
BRAF
estudios de encuestas mutación publicados están restringidas a los exones 11 y 15, otras posibles mutaciones fuera de estas regiones pueden pasarse por alto.
Para explorar el significado funcional de estos nuevos B- mutantes Raf, todos los identificados en este estudio se analizaron por SIFT (http://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html), un programa de análisis de mutación en línea que predice la consecuencia funcional de las sustituciones de aminoácidos no sinónimas [33], [34]. Todos los
BRAF
mutaciones identificadas se prevé que han alterado la función de proteínas a excepción de p.Q201H. La importancia funcional de
BRAF
mutaciones en los exones de codificación distintos del 11 y 15 se apoya en estudios bioquímicos de nuevas mutaciones en la línea germinal identificados en el CFC. Al igual que las mutaciones somáticas, la mayoría de las mutaciones de la línea germinal CFC confieren un aumento de la actividad quinasa, mientras que algunos están deteriorados quinasa. Sin embargo, todas las mutaciones de CFC que han sido caracterizados bioquímicamente función de las proteínas alter hasta cierto punto ([18], [26]; Rauen, datos no publicados).
B-Raf tiene sólo dos efectores conocidos, MEK1 y MEK2 . En un esfuerzo por caracterizar la mutación del espectro de la vía MAPK en cáncer de ovario, también secuenciado
MEK1 /2 y
identificado un nuevo MEK1 sustitución missense heterocigótica, p.D67N, en ES-2, que resultaron de un nt 199 G → A transición. Esta es la primera mutación MEK funcional identificado asociado con el cáncer y no representa un polimorfismo poco frecuente en que esta mutación no se identificó en 40 controles normales (80 alelos) o en 52 CFC individuos (104 alelos) se han secuenciado hasta la fecha ([18 ]; Rauen, datos no publicados). Curiosamente, a pesar de que no habíamos identificado este MEK1 mutante p.D67N en nuestra cohorte de CFC, esta misma mutación MEK1 Recientemente se ha informado que una mutación germinal en el síndrome de CFC [29]. Además de un
MEK1
mutación, ES-2 también tenía una sustitución p.V600E missense B-Raf. Estas dos mutaciones pueden haber estado cooperando eventos oncogénicas. Lo que hace que este hallazgo particularmente interesante es el hecho de que los estudios de secuenciación anteriores del dominio MEK1 /2 de la proteína quinasa no identificaron ninguna mutación en los gliomas, tumores de células germinales testiculares, cáncer de mama y el cáncer de pulmón [35] - [38]. Cabe destacar que el p.D67N en ES-2 se encuentra fuera del dominio quinasa de proteína que se extiende desde AA 68-271 (www.ensembl.org/Homo_sapiens). Muchas mutaciones de la línea germinal de CFC se encuentran 5 'del dominio de la proteína quinasa ([18], [29], [39]; Rauen, datos no publicados). Los estudios funcionales de estos nuevos mutantes de CFC han demostrado una mayor actividad
in vitro
sobre MEK de tipo salvaje en la estimulación de la fosforilación de ERK, pero estos mutantes de CFC no son tan activos como un mutante de MEK constitutivamente activa generada artificialmente ([18]; Rauen, datos no publicados). Otros estudios han demostrado que la alteración de la N-terminal de MEK aumenta la actividad quinasa basal que implican un papel importante regulador junto con el reconocimiento de sustrato [40] - [42].
Para evaluar la consecuencia funcional de MEK1 p. D67N, esta sustitución de aminoácidos se analizó por SIFT y se encontró que ser afectado funcionalmente. Para corroborar esta información, MEK1 p.D67N se transfectó transitoriamente en células HEK 293T, y la fosforilación de ERK se midió por análisis de transferencia Western. El mutante p.D67N MEK1 está activando como se demuestra por el aumento de la fosforilación de ERK en comparación con el vector vacío y de tipo salvaje MEK1, dos controles que no activan ERK. Sin embargo, el nivel de fosforilación de ERK por p.D67N es menor que el control positivo de CFC MEK1 p.Y130C mutante [18]
.
Además de
BRAF
y
MEK1
mutaciones, también se identificaron varios SNP base de datos de sinónimos. B-Raf p.G634G (rs9648696) se identificó en el 40% de las líneas celulares 15, MEK2 p.I220I (rs10250) estuvo presente en el 73% y MEK2 p.D151D (rs17851657) se identificó en el 33% de las líneas celulares. Estas bases de datos SNPs sinónimo estaban presentes a una frecuencia que es comparable a la informada previamente (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp; [43]). Había una identificación única
MEK1
SNP en OVCAR 10 como resultado de un G heterocigotos nt 348 → Una transición en el exón 3, p.Q113Q. Todos sinónimo SNPs se caracterizaron por SIFT y decidido a ser tolerado
.
Nuestros resultados enfatizan que las mutaciones que alteran la función de la vía MAPK juegan un papel importante en el cáncer de ovario [15]. Además, la identificación de mutaciones en los componentes clave de la vía MAPK será importante en la determinación de la capacidad de respuesta del cáncer a la terapéutica, el comportamiento agresivo y metastásico del tumor y el pronóstico del paciente. Cuatro de los 15 (26%) líneas celulares en este estudio tenían
BRAF
mutaciones y 1 de 15 (7%) tenían una mutación MEK. Se sabe que
BRAF
mutaciones han sido identificadas en ciertos tipos de cáncer de ovario; Sin embargo, las mutaciones en los efectores de B-Raf incluyendo
MEK1
y
MEK2
también pueden ser importantes contribuyentes de la tumorigénesis cáncer de ovario. Definición de los pathogenetics de cáncer de ovario puede permitir el uso de terapias dirigidas, tales como inhibidores de molécula pequeña de vía MAPK, que recientemente han comenzado a demostrar una gran promesa [16]. Además, un informe indica que las células con activado B-Raf han mejorado, sensibilidad selectiva para los inhibidores de MEK [44]. Nuestros resultados subrayan la importancia de que la caracterización adicional de la sensibilidad de los diferentes mutantes BRAF y MEK a la inhibición de moléculas pequeñas es una importante vía para seguir hacia el desarrollo de tratamientos eficaces para el cáncer de ovario.
Métodos
líneas celulares y Aislamiento de ADN genómico
Quince líneas celulares de cáncer de ovario, de uso general para
in vitro
experimentos, se hacen pruebas de mutaciones: OVCAR 3, SKOV 3, TOV-112d, A2780, OV90 , ES-2, TOV-21g, Caov-3, A1847, IGROV 1, OVCAR 5 de 2008, OVCAR 10, PEO1 y Hey. Los sedimentos celulares de cada una de estas líneas celulares fueron amablemente proporcionados por los Dres. Charles Drescher y Beatrice Knudsen. ADN genómico se aisló de los sedimentos celulares utilizando el kit QIAamp Tissue DNA (Qiagen, Valencia, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuarenta controles humanos sanos se incluyeron en este estudio. ADN genómico se aisló de linfocitos de sangre periférica utilizando el kit QIAamp DNA Blood Midi (Qiagen, Valencia, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras de control se obtuvieron en una junta de revisión institución aprobada por la Universidad de California en San Francisco.
PCR y secuenciación bidireccional
Los cebadores de PCR se diseñaron para amplificar todos los exones de codificación y regiones intrónicas flanqueantes de
BRAF gratis (NM_004333.2),
MEK1 gratis (NM_002755.2) y
MEK2 gratis (NM_030662.2) (Tabla 4 y Tabla 5). Para la secuenciación, los cebadores de PCR se modificaron en el extremo 5 'para incluir M13 hacia delante (GTAAAACGACGGCCAGT) y revertir secuencias (CAGGAAACAGCTATGACC). PCR y secuenciación se realizaron por Agencourt Bioscience Corporation (Beverly, MA). secuenciación bidireccional se llevó a cabo con ABI BigDye v3.1 Ciclo de Secuenciación Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante y se ejecutan en un instrumento de secuenciación capilar ABI3730xl (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Análisis
Los datos de secuenciación se analizaron mediante dos programas de análisis de secuencias, V5.02 PolyPhred Software (Universidad de Washington, Seattle, WA) y SeqScape® software (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Además, la revisión manual se realizó con Mutación Surveyor 3,00 (SoftGenetics LLC, State College, PA). Una evaluación más profunda de las mutaciones detectadas nucleótidos consistió en Ordenando intolerante De Tolerante (SIFT; blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html) y cribado de las bases de datos conocidos: NCBI, cósmicos, UniProtKB /Swiss-Prot y JSNP (www.ncbi.nlm .nih.gov /SNP, www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/, ca.expasy.org/sprot/, snp.ims.u-tokyo.ac.jp/).
plásmidos
humano
MEK1
cDNA (Origene, Rockville, MD) se clonó en un vector pcDNA3 con un Myc-tag en el extremo N-terminal. El
MEK1
nt 199 G → Una transición se introdujo el uso de Quick-Change sitio mutagénesis dirigida (Stratagene, La Jolla, CA) y se verificó mediante secuenciación directa.
Análisis de transitorios transfecciones y Western Blot
riñón embrionario humano (HEK) las células 293T se sembraron un día antes en placas de seis pocillos y se transfectaron, por duplicado, con 2 g de plásmido de ADN total y 5 l de Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se privaron de suero (0,5% de suero bovino fetal) y 24 horas más tarde se lisaron en tampón que contiene la proteasa y cócteles fosfatasa inhibidor (Sigma, St. Louis, MO). Los niveles de expresión de myc-MEK, ERK ERK fosforilada y total de se analizaron por Western blot. Myc (A-14) y p-ERK (E-4) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), y p44 /42 MAP quinasa anticuerpo se adquirió de Cell Signaling Technology (Danvers, MA).
Reconocimientos
los autores agradecen a la Fundación Canaria (www.canaryfoundation.org) para el apoyo financiero y científico y los Dres. Ingrid Revet y William Tidyman para comentarios reflexivos y asistencia técnica.