Extracto
galectina-3 (Gal-3), un miembro de 31 kDa de la familia de proteínas beta-galactósido de unión, se ha implicado en la progresión de diversos cánceres humanos. Sin embargo, las funciones propuestas son muy diferentes, que van desde la promoción de tumores funciones celulares y el impacto negativo en el pronóstico del paciente a las propiedades de supresión de tumores y el impacto pronóstico positivo. Nosotros y otros han identificado previamente Gal-3 como sobreexpresa en el cáncer de páncreas en comparación con pancreatitis crónica y tejido pancreático normal. El propósito de este estudio fue así el análisis exhaustivo de las funciones celulares putativos de Gal-3 por transitoria, así como el silenciamiento estable o sobreexpresión de Gal-3 en un panel de 6 líneas celulares de cáncer de páncreas bien establecidos. Nuestros resultados confirman que la galectina-3 está regulada positivamente en el nivel de mRNA en el cáncer de páncreas y expresa fuertemente en la mayoría de líneas celulares de cáncer de páncreas. En líneas celulares individuales, caída transitoria de Gal-3 de expresión dio lugar a los efectos inhibidores moderados sobre la proliferación, la migración o crecimiento independiente de anclaje de las células, pero estos efectos no fueron consistentes a través del espectro de líneas celulares analizadas. Por otra parte, los efectos funcionales de la modulación de la expresión de Gal-3 no se observaron en desmontables o sobreexpresión enfoques estables
in vitro Opiniones y no alteró las características de crecimiento de tumores de xenoinjertos de ratón desnudo
in vivo
. Nuestros datos así no apoyan un papel funcional directa de Gal-3 en la transformación maligna de las células epiteliales pancreáticas, aunque no se excluyen los efectos paracrinos o sistémicas de Gal-3 de expresión
Visto:. Hann A, A Gruner , Chen Y, Gress TM, Buchholz M (2011) Análisis detallado de las celular La galectina-3 no revela ninguna función oncogénica consistente en células de cáncer de páncreas. PLoS ONE 6 (6): e20859. doi: 10.1371 /journal.pone.0020859
Editor: Iris Schrijver, Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Abril, 2011; Aceptado: 10-may de 2011; Publicado: 16 Junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Hann et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado en parte por el ministerio Federal alemán de educación e investigación (BMBF) en el marco del programa NGFN de la investigación genómica médica (PACA-Net; ID del proyecto PKB-01GS08), así como la Unión Europea FP6 subvención LSHB-CT-2006- 018771 (Proyecto integrado "MolDiag-Paca"). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal, la forma más común de cáncer de páncreas, tiene una tasa de supervivencia global a 5 años de & lt; 5%. Más del 80% de los pacientes se presentan en una etapa avanzada de la enfermedad sin la opción para la resección del tumor potencial curativo [1], [2]. Aunque la quimioterapia combinada con un inhibidor de pequeña molécula dirigida a diana de señalización del receptor de EGF recientemente se ha demostrado que resulta en un aumento modesto, pero significativo de la supervivencia en tumores localmente avanzado o metastásico, el pronóstico sigue siendo pésimo, con supervivencia media no superior a 6,2 meses [3] . Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevos enfoques diagnósticos y terapéuticos que mejoren los resultados.
La familia de proteínas de unión a beta-galactósido-(Galectinas) se compone de 14 miembros en los mamíferos. Una característica común que distingue Galectinas de otras lectinas es su dominio de hidratos de carbono-reconocimiento. La galectina-3 (Gal-3), el miembro 31 kDa de esta familia, se ha relacionado con una variedad de tumores, aunque con funciones muy diferentes [4]. Gal-3 sobreexpresión en tejido canceroso se ha asociado con un mal pronóstico en diferentes tipos de cáncer, incluyendo el carcinoma hepatocelular [5], [6], el carcinoma renal de células claras [7], [8] y el cáncer de vejiga [9]. Por el contrario, la reducción de Gal-3 de expresión en el tejido tumoral en comparación con el tejido normal se informó en el cáncer de ovario [10], uterino adenocarcinoma [11], cáncer de mama [12], [13] y la neoplasia cervical [14]. En el cáncer colorrectal, los informes han sido contradictorios. Algunos autores describen una asociación positiva de altos niveles de Gal-3 de expresión con etapas avanzadas de tumores y mal pronóstico [15] - [17], mientras que otros correlacionan disminución de la expresión de Gal-3 con mal pronóstico [18] - [20]. En el cáncer gástrico, Okada et al informaron de que la reducción de expresión de Gal-3 correlaciona con metástasis en los ganglios linfáticos y el estadio tumoral avanzado [21], mientras que otros dos grupos identificados aumento de la expresión de Gal-3 en el cáncer gástrico, pero no encontró una correlación con histopatológico diferenciación o la progresión del tumor [22], [23].
a pesar de los resultados contradictorios con respecto a un posible papel pronóstico de Gal-3 de expresión, algunos informes han descrito las funciones de promotores de tumores de Gal-3 en las líneas celulares de tumores
in vitro
. Desmontables de Gal-3 resultó en la migración celular reducida y el crecimiento celular en células de cáncer de próstata [24], la inducción de apoptosis mejorada en células de cáncer gástrico [25], e inhibido
vitro
la formación de colonias en, así como de xenoinjerto de ratón desnudo inducción en células de cáncer de mama [26]. Nosotros y otros han demostrado previamente que Gal-3 se sobreexpresa consistente en cáncer de páncreas en comparación tanto con pancreatitis crónica y el páncreas normal [27] - [30]. Sin embargo, no se ha informado de las investigaciones sobre un posible papel funcional de Gal-3 expresión en células de cáncer de páncreas. El propósito de este estudio fue de este modo la evaluación experimental de los efectos de la sobreexpresión o desmontables de Gal-3 en un amplio conjunto de líneas celulares de cáncer pancreático (PATU 8988s, Patu 8988t, S2-007, S2-028, IMIM-PC-1 y MIA PaCa-2). Análisis funcionales incluyen ensayos para la viabilidad celular, la apoptosis, la proliferación, la migración y el crecimiento independiente del anclaje, así como el crecimiento del tumor en un modelo de xenoinjerto de ratón. Aparte de los efectos aislados de líneas de células individuales, la modulación de la expresión de Gal-3 no tuvo ningún efecto consistente sobre las características de tumor relevante de las células de cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Los tejidos humanos y líneas celulares
La línea celular de adenocarcinoma pancreático humano IMIM-PC-1 [31] fue proporcionado amablemente por FX Real (Insituto Municipal de Investigación Médica, Barcelona, España). S2-028 y S2-007 [32] eran de T. Iwamura (Miyazaki Medical College, Miyazaki, Japón). MIA PaCa-2 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC, RMD, EE.UU.). Patu Patu 8988t y 8988s fueron amablemente proporcionados por H. P. Elsasser (Institut für Klinische Zytobiologie und Zytopathologie, Philipps Universität, Marburg, Alemania). Todas las líneas celulares se mantuvieron en medio mínimo esencial modificado por Dulbecco (Gibco, Invitrogen Corp., Nueva York, EE.UU.) suplementado con 10% de FCS (Gibco, Invitrogen Corp., Nueva York, EE.UU.) y gentamicina 0,045 mg /ml (Gibco, Invitrogen Corp. , Nueva York, EE.UU.).
Ética Declaración
resecado quirúrgicamente adenocarcinoma de páncreas y tejidos con pancreatitis crónica fueron proporcionados por los servicios de cirugía en las universidades de Ulm y Homburg /Saar
. muestras de páncreas normales se obtuvieron de zonas sanas en las fronteras de resectates con pancreatitis crónica. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes antes de usar las muestras de tejido. El estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Ulm, Alemania (Ethikkommission der Universität Ulm), así como el comité de ética de la Universidad de Homburg /Saar, Alemania (Ethikkommission der Universität Homburg).
La transfección de líneas celulares
pequeños ARN de interferencia (siRNA) se transfectó en Patu 8988s, S2-007 y S2-028 células usando el reactivo siLentFect de lípidos (Bio-Rad, Munich, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. transfección ARNsi en las células MIA PaCa-2 se realizó utilizando Transmessenger reactivo (Qiagen, Hilden, Alemania) y células IMIM-PC-1 se transfectaron con X tremeGENE-siRNA reactivo de transfección (Roche, Mannheim, Alemania) de acuerdo con los protocolos de los fabricantes, respectivamente. Los siRNAs Gal-3-específicos fueron: Sigal-3-1, Hs_LGALS3_1 FlexiTube siRNA SI00470036 y Sigal-3-2, Hs_LGALS3_2 FlexiTube siRNA SI00470043 (Qiagen). Silenciador de control negativo de Ambion se utilizó como control no silenciar.
El vector de expresión Gal-3 se construyó clonando el marco de lectura abierto Gal-3 amplificado por PCR en el vector /V5 dest pcDNA V3.2 utilizando la tecnología de clonación de recombinación gateway (Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe, Alemania). Después de la transfección de las células 8988t Pätu utilizando Lipofectamine 2000 reactivo de transfección (Invitrogen), la selección de clones de células transfectadas de forma estable se realizó mediante la adición de 800 mg /ml de G418 al medio de cultivo.
A Gal-3-específica construcción de expresión shRNA en el vector pGIPZ fue adquirido de Applied abierto, Huntsville, aL, EE.UU. (cat.#RHS4430-99137619). No silenciar shRNAmir (cat.#RHS4348, Open Biosystems) se utilizó como el control negativo. La transfección estable de las células S2-007 se realizó utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). clones transfectadas de manera estable fueron seleccionados por la adición de la higromicina (400 g /ml) al medio de cultivo.
Extracción de ARN y QRT-PCR
ARN a partir de líneas de células se extrajo usando peqGold RNA Kit total (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Alemania) de acuerdo el protocolo del fabricante. muestras de tejido tumoral a granel se homogeneizaron en nitrógeno hielo /líquido en seco utilizando un mortero y una mano de mortero. El ARN se extrajo usando el kit RNeasy Mini (Qiagen) según el protocolo del fabricante. Primera línea de cDNA se sintetizó a partir 1 g de ARN total usando el Kit de Omniscript RT (Qiagen) según el protocolo del fabricante. PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR) se realizó utilizando SYBR Green Mastermix (Applied Biosystems, Wellesley, MA, EE.UU.) y pares de cebadores específicos diseñados con el programa PrimerExpresss (Applied Biosystems). Los siguientes pares de cebadores se utilizaron para QRT-PCR: proteína ribosomal, grande, P0 (RPLP0) FWD: 5'-TGGGCAAGAACACCATGATG-3 '; Rdo. 5'-AGTTTCTCCAGAGCTGGGTTGT-3 '; La galectina-3 fwd: 5'-AGAGGGAATGATGTTGCCTTCC-3 '; rev:. ACAATGACTCTCCTGTTGTTCTCATT-3 'se llevó a cabo
Fraccionamiento subcelular y la inmunotransferencia
Fraccionamiento subcelular como se describe anteriormente [33]. Brevemente, las células se lavaron dos veces con PBS enfriada con hielo y se recogieron por centrifugación a 1.600 r.p.m. a 4 ° C. Los lisados se resuspendieron en tampón A (HEPES 10 mM pH 7,9; KCl 10 mM; EDTA 0,1 mM; EGTA 0,1 mM; DTT 1 mM; inhibidores de proteinasa) durante 15 minutos y posteriormente se centrifugaron durante 20 min a 3.600 r.p.m. Los sobrenadantes se transfirieron a nuevos vasos y se centrifugaron a 14.000 r.p.m. durante otros 4 minutos. Los sedimentos se resuspendieron en 30 a 100 ml de tampón C (20 mM Hepes pH 7,9; NaCl 0,4 M; EDTA 1 mM; EGTA 1 mM; DTT 1 mM; inhibidores de proteinasas) y se incubaron en hielo durante 30 min. Una etapa de centrifugación final a 14.000 r.p.m. durante 10 min se realizó para separar las proteínas nucleares de los desechos celulares. Para la transferencia Western, los extractos de proteínas nucleares resultantes se sometieron a electroforesis a través de un gel de SDS-poliacrilamida al 7,5% y se transfirieron a membranas de PVDF Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) como se describe anteriormente [34]. Las membranas se sondearon con anticuerpos anti-Gal-3 (monoclonal de ratón, cat.#A3A12, Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-ORC2 (policlonal de conejo, cat.#559266, BD Biosciences), anti-PARP (policlonal de conejo, gato .#9542, Cell Signaling Technology, Boston, MA, EE.UU.), o anti-β-actina (monoclonal de ratón, gato.#A1978, Sigma-Aldrich, St Louis, MI, EE.UU.) anticuerpos, se lavaron en tampón de lavado TBS y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa. Se utilizó el sistema de reacción de quimioluminiscencia (Roche) para la visualización.
MTT ensayo de viabilidad celular
Las células se sembraron de nuevo 24 horas después de la transfección en 3,9 cm
2 platos en 60.000 a 100.000 células /pocillo . Después de 24 h adicionales o 48 horas de cultivo, el medio se sustituyó por medio que contenía MTT (azul de tiazolilo, Carl Roth, Karlsruhe, Alemania) y los platos se incubaron durante 2 horas a 37 ° C. El MTT conteniendo medio se reemplazó por solución de solubilización (10% de Triton X-100 (Carl Roth), ácido clorhídrico 0,1 molar (Fisher Scientific, Schwerte, Alemania) disuelto en isopropanol (Sigma-Aldrich)) y extinción medida a 570 nm. 48 valores de h se dividieron por 24 valores de h para corregir las posibles variaciones en el número de células sembradas.
se midió la proliferación de células BrdU ensayo
replicación del ADN como una medida directa de la actividad mitótica de la célula usando el proliferación ELISA, BrdU kit de quimioluminiscencia (Sigma) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, 5000 a 10000 células se sembraron de nuevo 24 horas después de la transfección en unas placas de 96 pocillos μClear (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania). Se añadió BrdU que contiene medio de 4 o 6 horas. Después de la eliminación del medio que contiene BrdU, las células se fijaron durante 1 h y posteriormente se incubaron con el anticuerpo anti-BrdU conjugado con peroxidasa durante 1,5 h. La reacción de quimioluminiscencia se midió en unidades relativas de luz por segundo (RLU /s).
Trail apoptosis inducida por
Con el fin de inducir la apoptosis en extrínsecamente Pätu 8988s células, se sembraron 300.000 células en 9,6 cm
2 placas de cultivo y se trata con la proteína de la ruta (I + amp; D Systems, Minneapolis, MN). a una dosis de 25 ng /ml durante 24 h
la migración de células de ensayo
Modificado Boyden Los ensayos se realizaron por la cámara de resiembra de 20.000 a 40.000 células resuspendidas en medio sin suero en transwell insertos con un tamaño de poro de 8 micras (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania). Los insertos se suspendieron en 24well placas llenas de medio suplementado con 1% de FCS. Las células se dejaron migrar hacia la cara inferior de la membrana durante 2 o 4 h a 37 ° C. Las células no migradas fueron retirados de la parte interior de los insertos utilizando hisopos de algodón. Las células migradas se tiñeron sumergiendo las membranas en 0,2% de cristal violeta disueltos en 20% de metanol durante 10 min. Las células migradas se contaron usando un microscopio óptico a una ampliación de 10 aumentos.
ensayos de agar blando
Con el fin de evaluar el potencial de crecimiento independiente de anclaje, se realizaron ensayos de agar blando como se describe anteriormente [ ,,,0],35]. En resumen, 1 × 10
4 células por 9,6 cm
2 placa de cultivo de células se sembraron en DMEM /0,33% de Bacto-agar sobre una capa inferior de DMEM /0,5% de Bacto-agar. el crecimiento independiente de anclaje se midió después de 7 días de incubación mediante el recuento del número de colonias viables.
xenoinjertos de ratón desnudo
NMRI-
nu /nu
ratones fueron propagadas y mantenidas en un entorno libre de patógenos. Los ratones hembra de 6-8 semanas de edad, fueron utilizados en los experimentos. Para generar los xenoinjertos, 10
6 fueron inyectados células tumorales en 0,1 ml de DMEM libre de suero subcuntaneously en los flancos de los ratones. Tres semanas después de la inoculación, se sacrificaron los ratones, los tumores se explantaron y se determinaron los tamaños tumorales. Una media de cada tumor se almacenó en 2% de formaldehído y se incrustó en parafina para el examen histológico e inmunohistoquímico. La otra mitad se congeló rápidamente en nitrógeno líquido para el aislamiento de ARN y proteínas.
Resultados
La sobreexpresión de Gal-3 en el cáncer de páncreas
En los análisis previos de microarrays de alto contenido, hemos identificado Gal-3 como uno de los genes sobreexpresados en microdissected tejidos de cáncer de páncreas [28]. Con el fin de validar estos resultados, hemos realizado cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) en un conjunto de muestras de tejidos incluyendo el cáncer de páncreas 10, 5 pancreatitis crónica y 5 muestras de tejido pancreático normal. los niveles de mRNA gal-3 fueron ligeramente elevados en las muestras pancreatits crónicas, y fueron fuertemente upregulated en la mayoría de muestras de cáncer (Fig. 1A), lo que confirma los datos de microarrays. El análisis posterior de las líneas celulares de cáncer de páncreas demostró una fuerte expresión, tanto en el ARNm, así como en el nivel de proteína, en 5 de 6 líneas celulares ensayadas (Fig. 1B).
se determinaron
niveles Gal-3 ARNm por cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR) (A, B). proteína ribosomal, grande, P0 (RPLP0) se utilizó como gen de referencia. PC: cáncer de páncreas; CP: pancreatitis crónica; NP: páncreas normal. La expresión de proteínas en diferentes líneas celulares de cáncer de páncreas se determinó mediante Western blot (C) análisis. β-actina se utilizó como control de carga.
El nivel de expresión de Gal-3 no tiene ninguna influencia sobre el crecimiento de células tumorales
in vitro
Para evaluar el papel funcional de la Gal-3 se expresa de forma aberrante en las células de cáncer de páncreas, Gal-3 fue transitoria o estable sobreexpresado o silenciado en diferentes líneas celulares de cáncer de páncreas y los efectos analizados en diversos
in vitro
ensayos funcionales. Para silenciamiento transitorio, se utilizaron dos secuencias de siRNA independientes, así como un ARNsi de control no silenciamiento. Para cada una de las cinco líneas celulares analizadas (PATU 8988s, S2-007, S2-028, IMIM-PC-1 y MIA Paca-2), reactivos de transfección y -condiciones fueron optimizados para lograr eficiencias desmontables & gt; 80% (Fig. 2A).
(a) caída transitoria de Gal-3 fue realizado por transfección transitoria de múltiples líneas celulares utilizando dos-3 Gal secuencias diferentes siRNA (Sigal-3 1 y 2) o un control no silenciando siRNA (NC). (B) desmontables estable en S2-007 se realizó mediante shRNA construcciones de expresión. Tres Gal-3 específicos clones shRNA transfectadas (shGal-3 1, 2 y 3) y tres clones de control nonsilencing shRNA transfectadas (SHC 1, 2 y 3) fueron elegidos para el análisis adicional. (C) la sobreexpresión estable de Gal-3 se consiguió mediante la transfección de células 8988t Pätu con un vector de expresión de Gal-3 (PGAL-3 1, 2 y 3) o un vector de control (PC 1 y 2). U indica células no transfectadas. Lisados celulares totales se analizaron mediante qRT-PCR (paneles superiores) y Western blot (paneles inferiores) para los niveles de Gal-3 de expresión. los niveles de mRNA gal-3 se determinaron en relación a RPLP0. Sigal-3 1 y 2 se normalizaron a NC. β-actina se utilizó como control de carga para las transferencias de Western.
clones desmontables estables se generaron utilizando S2-007 células transfectadas con shRNA secuencias clonadas en el vector pGIPZ. Tres clones transfectados de manera estable, así como tres clones transfectados de control de vectores se eligieron para su posterior análisis (Fig. 2B).
Dado que las células 8988t Pätu mostraron muy bajos endógenos Gal 3-niveles, esta línea celular fue elegido para la construcción de Gal-3 que sobreexpresan estable clones. Se establecieron tres clones independientes. Dos de estos mostraron sobreexpresión moderada de Gal-3 recombinante en el nivel de mRNA, que era mucho más pronunciada en el nivel de proteína (Fig. 2C, carriles 4, 6). El clon restante no mostró expresión recombinante apreciable de Gal-3 (Fig. 2C, carril 5), pero se incluyó en los experimentos adicionales como clon de control adicional. Curiosamente, los clones de control transfectadas con el vector vacío también mostró algo elevadas niveles Gal-3 (Fig. 2C, carriles 2, 3).
En una primera ensayo funcional, la influencia de Gal-3 expresión en la viabilidad celular era se analizaron por ensayos de MTT. Ni caída transitoria en cualquiera de las 5 líneas celulares ensayadas, ni caída estable en células S2-007 o sobreexpresión estable en células 8988t Pätu tenían ningún efecto significativo sobre la viabilidad celular en condiciones de cultivo normales en comparación con los controles adecuados (Fig. 3 A- C).
transitoriamente Gal-3 líneas de células silenciadas (a), de forma estable Gal-3 silenciada S2-007 clones de células (B) o de forma estable Gal-3 que sobreexpresan Pätu clones de células 8988t (C) se cultivaron durante 24 y 48 h seguido de incubación con el reactivo MTT. 48 h los valores se dividieron por 24 valores de h (para corregir las posibles variaciones en el número de células sembradas) y se normalizaron para controlar las células transfectadas siRNA (NC). Los valores de Gal-3 clones de células desmontables estables (shGal-3 1, 2 y 3) y clones de células Gal-3 que sobreexpresan estables (PGAL-3 1, 2 y 3) se normalizaron a la media de vector de control transfectadas clones celulares estables ( SHC 1, 2, 3 y pC 1, 2), respectivamente. Los datos incluyen un mínimo de tres experimentos independientes.
Análisis de la proliferación celular utilizando ensayos de BrdU reveló una inhibición moderada, pero significativa de la actividad proliferativa de las células después de S2-028 desmontables de Gal-3 (Fig. 4A , panel 3). Sin embargo, la tendencia a la reducción de la proliferación no alcanzó significación en Patu 8988s y S2-007 células, estuvo ausente en el IMIM-PC-1 e incluso invertido en MIA Paca-2 células (Fig. 4A). Ni caída estable en S2-007 células, ni la sobreexpresión estable de Gal-3 en células 8988t Pätu tenían ningún efecto significativo sobre la proliferación de los clones de células resultantes.
transitoriamente Gal-3 líneas de células silenciadas (A), de forma estable gal-3 silenciada S2-007 clones de células (B) o de forma estable gal-3 que sobreexpresan Pätu celular 8988t clones (C) se cultivaron con el agente BrdU durante 2 o 4 h. incorporación de BrdU por las células proliferantes se midió por ELISA. Los valores de las células transfectadas transitoriamente con diferentes Gal-3 siRNAs específicos (Sigal-3 1 y 2) se normalizaron para controlar las células transfectadas siRNA (NC). Los valores de Gal-3 clones de células desmontables estables (shGal-3 1, 2 y 3) y clones de células Gal-3 que sobreexpresan estables (PGAL-3 1, 2 y 3) se normalizaron a la media de vector de control transfectadas clones celulares estables ( SHC 1, 2, 3 y pC 1, 2), respectivamente. Los datos incluyen un mínimo de tres experimentos independientes. * Indica
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con las células transfectadas control de siRNA (de doble cara no apareado
t-test
) guía empresas
Del mismo modo, Gal-3 transitoria. knockdown no tuvo efecto sobre la actividad apoptótica (según se mide por la escisión de PARP) de Pätu 8988s células en ausencia (Fig. 5, carriles 1-4) o presencia (Fig. 5, carriles 5-8) del inductor de la apoptosis extrínseca Trail. la escisión de PARP se indujo por el procedimiento de transfección y fue más pronunciado en la presencia de TRAIL (Fig. 5, carriles 2 y 6), pero no se mejoró aún más por desmontables de Gal-3 (Fig. 5, carriles 3-4 y 7 -8).
Las células transfectadas transitoriamente con Gal-3 siRNAs específicos (Sigal-3 1 y 2), control nonsilencing siRNA (NC) o células no transfectadas (u) se analizaron por transferencia de Western para el poli ADP-ribosa polimerasa (PARP) de escisión. El aumento de la escisión, indicada por la señal mejorada de la banda inferior, se observó en todas las células transfectadas. PARP división fue reforzada por el tratamiento con el inductor de la apoptosis Trail extrínseca, pero no fue influenciado por Gal-3 desmontables. ß-actina se utilizó como control de carga. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos individuales.
La repetición de este conjunto de experimentos en condiciones libres de suero producido resultados similares, no demostrar ninguna influencia constante de la modulación de la expresión de Gal-3 sobre el crecimiento celular o apoptosis en las líneas celulares ensayadas (datos no mostrados).
efecto inconsistente de Gal-3 sobre la migración celular
ext analizó la influencia de Gal-3 de expresión en la migración celular en un Boyden cámara de ensayo. Las células fueron capaces de transmigrar a través de un filtro a lo largo de un gradiente de suero de ternera fetal. Números de Gal-3 transitoriamente células migraron silenciados se normalizaron a las células transfectadas no silenciar el control de siRNA. caída transitoria de Gal-3 dio lugar a una tendencia a la disminución migración de células en tres de las cinco líneas celulares analizadas, aunque este efecto no alcanzó significación en la mayoría de los casos (Fig. 6A). Por otra parte, este efecto no se reproduce en los S2-007 clones de células con estable Gal-3 desmontables (Fig. 6, B). En analogía inversa para los resultados de los experimentos desmontables transitorios, la sobreexpresión estable de Gal-3 en células 8988t Pätu inducida por una tendencia hacia el aumento de la migración de células (Fig. 6, C), aunque esta tendencia de nuevo no alcanzó significación y también fue evidente en clon PGAL-3 2, que mostró baja o ausente expresión de Gal-3 recombinante (véase Fig. 2C). En su conjunto, la modulación de la expresión de Gal-3 tuvo un efecto suave y poco consistente en los ensayos de cámara de Boyden, argumentando así contra un papel importante de Gal-3 celular en la migración dirigida de células de cáncer de páncreas.
transitoriamente Gal- 3 líneas de células silenciadas (a), de forma estable Gal-3 silenciados S2-007 clones de células (B) o de forma estable Gal-3 que sobreexpresan Pätu celular 8988t clones (C) se cultivaron en insertos de cámara de Boyden para 2 o 4 h. Las células que migran a través de los poros de las piezas de inserción a lo largo de un gradiente de suero de ternera fetal se fijaron, se tiñeron con azul de metileno y se contaron usando microscopía de luz. El número de células migradas transfectadas transitoriamente con diferentes Gal-3 siRNA (Sigal-3 1 y 2) se normalizaron para controlar las células transfectadas siRNA (NC). Gal-3 desmontables células estables migrado (shGal-3 1, 2 y 3) y las células Gal-3 que sobreexpresan estables (PGAL-3 1, 2 y 3) se normalizaron a la media de vector de control transfectadas clones celulares estables (SHC 1, 2, 3 y pC 1, 2), respectivamente. Los datos incluyen un mínimo de tres experimentos independientes. * Indica
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con las células transfectadas control de siRNA (de doble cara no apareado
t-test
) guía empresas
La inhibición de la expresión de Gal-3. perjudica el crecimiento independiente del anclaje en un subconjunto de líneas celulares de cáncer de páncreas, pero no tiene efecto sobre el crecimiento de tumores de xenoinjertos
in vivo
El potencial de crecimiento independiente de anclaje de las células cancerosas se evaluó mediante la evaluación el número de colonias formadas en ensayos de agar blando. caída transitoria de Gal-3 dio lugar a una clara reducción de la capacidad de formación de colonias de las líneas celulares Pätu 8988s, S2-007 y IMIM-PC-1, con el efecto más fuerte y la más alta significación estadística observada para S2-007 células (Fig. 7A ). A la inversa, PaCa-2 células S2-028 y MIA no se vieron afectadas por la caída Gal-3. Dado que los informes anteriores han indicado que las funciones de promotores de tumores de Gal-3 en otros sistemas celulares pueden depender de la localización subcelular de la proteína [26], [36], [37], se analizó si el efecto diferencial de Gal-3 knockdown la capacidad de formación de colonias en correlación con diferente localización subcelular de Gal-3 en las líneas celulares ensayadas. proteína Gal-3 se distribuye por igual entre el núcleo y el citosol en 2-Paca y S2-007 células MIA y fue ligeramente sobrerrepresentadas en las fracciones citosólicas en Patu 8988s, S2-028 y las células (Fig. 7B) 1 IMIM-PC-, por tanto, que no muestran correlación con la sensibilidad hacia Gal-3 knockdown
.
(a) Gal-3 fue silenciado transitoriamente en líneas celulares de cáncer pancreático usando dos secuencias de siRNA independientes (Sigal-3 1 y 2). desmontables células y de control se sembraron en agar blando formación y la colonia evaluado después de 7 días. Resultados se normalizaron para controlar las células transfectadas siRNA (NC). Los datos incluyen un mínimo de tres experimentos independientes. * Indica p & lt; 0,05 en comparación con las células transfectadas con siRNA de control (de doble cara no apareado
t-test
). (B) Análisis de transferencia Western de nuclear (N) y citoplasmáticas fracciones (c) de proteínas derivadas de líneas celulares de cáncer de páncreas. Gal-3 se muestra en el carril superior. tinción de ß-actina se utilizó como control de carga. La tinción para el factor nuclear ORC2 se utilizó para evaluar la pureza de las fracciones subcelulares. (C) xenoinjertos de tumores se indujeron en ratones desnudos por inyección subcutánea de dos Gal-3 knockdown S2-007 clones celulares estables (shGal-3 2 y 3) de control y dos nonsilencing shRNA transfectadas S2-007 clones (SHC 2 y 3). Se analizaron seis ratones por grupo experimental. diagramas de caja y bigotes ilustran los volúmenes del tumor en el día 22 después de la inyección. Barbas denotan 1,5 × rango intercuartílico (RIC). Los valores fuera de este rango se muestran como triángulos rellenos. (D) los niveles de ARNm de Gal-3 en tejido grueso de xenoinjertos de tumores en determinados por QRT-PCR. RPLP0 se utilizó como gen de referencia.
A continuación, probamos si el efecto sobre el crecimiento independiente de anclaje de células S2-007 también se tradujo en diferencias en el crecimiento del tumor
in vivo
.
Para este fin, los tumores de xenoinjertos fueron inducidos en ratones desnudos por inyección subcutánea de células S2-007 con 3 Gal-células estables desmontables o de control transfectadas con el vector, respectivamente. No se observó ninguna diferencia significativa en los volúmenes tumorales entre Gal-3 tumores desmontables y de control (Fig. 7C). El examen histológico de los tumores también no reveló diferencias sistemáticas en la diferenciación, invasión local o la densidad de microvasos entre los diferentes grupos (datos no mostrados).
Con el fin de confirmar la reducción persistente de Gal-3 niveles en el derribo tumores, ARNm se preparó a partir de tejido tumoral mayor y analizados por QRT PCR. Como era de esperar, los niveles de ARNm de Gal-3 fueron significativamente inferiores en los tumores derivados de los clones S2-007 desmontables que en los derivados de los clones de control transfectadas con vector (Fig. 7D).
Discusión
la desregulación de la expresión de Gal-3 ha sido descrita en varios cánceres humanos, aunque el significado pronóstico de los cambios observados sigue siendo un tema de controversia [37], [38]. adenocarcinoma ductal pancreático se encuentra entre los tumores humanos en la que está bien establecida una sobreexpresión significativa de Gal-3 tanto en mRNA, así como en el nivel de proteína [27], [30]. Nuestros propios resultados de análisis de microarrays de tejidos tumorales pancreáticas microdissected indicó que Gal-3 se expresa por las propias células tumorales en lugar de por las células del estroma que normalmente constituyen la mayor parte del tumor [28]. En el estudio actual, confirmamos la sobreexpresión de Gal-3 mRNA en los tejidos tumorales mediante QRT-PCR y demostramos que la fuerte expresión de Gal-3 se mantiene en la mayoría de las líneas celulares de cáncer pancreático
in vitro
.
Como es el caso con los datos sobre el papel pronóstico en el cáncer, los informes sobre las funciones celulares putativos de Gal-3 en las células cancerosas se encuentran en la parte concluyente o incluso contradictorias. Mientras Honjo et al. la pérdida de informe (suero-independiente) capacidad proliferativa y la derogación de crecimiento independiente de anclaje de células de cáncer de mama después de silenciamiento de la expresión de Gal-3 [26], Matarrese et al. no observaron ninguna diferencia en el crecimiento celular o la proliferación en la modulación de Gal-3 expresión, pero describir una mayor resistencia a la apoptosis después de la sobreexpresión de Gal-3 [36]. Del mismo modo, el mismo grupo que observó los efectos inhibidores de crecimiento de Gal-3 silenciamiento en células de cáncer de mama descrito fuertes efectos anti-tumorales de Gal-3 desmontables en las células de cáncer de próstata, incluyendo la migración reducida celular, invasión, proliferación celular, colonia independiente de anclaje la formación, y el crecimiento tumoral en xenoinjertos de ratones nude [24]. Por el contrario, Califice et al. no observaron ningún efecto de Gal-3 de expresión en la proliferación de células de cáncer de próstata en cualquier constelación, e informó de que la invasión de Matrigel, el crecimiento independiente de anclaje y la formación de xenoinjerto de ratón desnudo fue promovido sólo por citoplasmática expresión de Gal-3, mientras que la localización nuclear de Gal -3 tenido el efecto contrario [37].
un tema común en muchos de estos estudios es el hecho de que se analizó a menudo muy pocos o sólo una única línea celular, y que algunos de los efectos se observaron únicamente en condiciones experimentales muy específicas. Jiang et al.