Extracto
Las células cancerosas exhiben alteraciones notables en el metabolismo celular, en particular en su preferencia de sustrato nutriente. Hemos ideado varios métodos experimentales que analizan rápidamente el flujo metabólico sustrato en células de cáncer: la glucólisis y la oxidación de la glucosa importante sustratos de combustible, glutamina, y los ácidos grasos. Utilizando el analizador XF extracelular Flux, estos métodos medida, en tiempo real, la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) de las células vivas en una microplaca a medida que responden a los sustratos y agentes de perturbación metabólicas. En los experimentos de prueba de principio, se analizaron flujo sustrato y bioenergética mitocondrial de dos líneas celulares humanas de glioblastoma, SF188s y SF188f, que se derivan de la misma línea celular de sus padres, pero proliferan a un ritmo lento y rápido, respectivamente. Estos análisis dieron lugar a tres observaciones interesantes: 1) las dos líneas celulares respirado eficazmente con la respiración sustancial sustrato endógeno; 2) las células se sometieron a SF188f un cambio significativo de glicolítica para metabolismo oxidativo, además de una alta tasa de oxidación de la glutamina en relación a las células SF188s; y 3) la respiración mitocondrial ligada a la fuga de protones de las células SF188f aumentó significativamente en comparación con las células SF188s. Es plausible que la fuga de protones de las células SF188f puede jugar un papel en permitir flujo del ciclo del TCA anaplerotic glutamina como combustible continua desacoplando parcialmente el ciclo del TCA de la fosforilación oxidativa. Tomados en conjunto, estos métodos de análisis rápido, sensible y de flujo sustrato de alto rendimiento introducen enfoques de gran valor para el desarrollo de una mayor comprensión de las vías genéticas y epigenéticas que regulan el metabolismo celular y el desarrollo de terapias que se dirigen metabolismo del cáncer.
cita: Pike Winer LS, Wu M (2014) un análisis rápido de glicolítica y oxidativa de sustrato de flujo de células cancerosas en una microplaca. PLoS ONE 9 (10): e109916. doi: 10.1371 /journal.pone.0109916
Editor: Robert W. Sobol, Universidad de Pittsburgh, Estados Unidos de América
Recibido: 25 Agosto, 2013; Aceptado: 1 de septiembre de 2014; Publicado: 31 Octubre, 2014
Derechos de Autor © 2014 Pike Winer, Wu. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo se llevó a cabo en la financiación de Seahorse Bioscience. LSPW es un empleado y MW era un empleado en el momento del trabajo en la empresa. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Lisa S. Pike Winer es empleado en Seahorse Bioscience, North Billerica, MA, ESTADOS UNIDOS. Min Wu era un empleado en Seahorse Bioscience en el momento de este trabajo, North Billerica, MA, EE.UU.. Sin embargo, esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Las células cancerosas
reprogramar significativamente su metabolismo para impulsar el crecimiento tumoral y la supervivencia. Otto Warburg observado primero que en condiciones aeróbicas, los tumores tenían altas tasas de glucólisis en comparación con el tejido circundante, un fenómeno conocido como el efecto Warburg, o la glucólisis aeróbica [1]. Se postula que el aumento de la glucólisis y la alteración de la respiración mitocondrial es la causa principal de cáncer [2]. Más recientemente, un gran cuerpo de evidencia indica que las células cancerosas se someten a la reprogramación metabólica, lo que lleva a un amplio uso de y la dependencia de la glucosa o glutamina para su crecimiento y supervivencia [3] - [9]. Esta reprogramación metabólica ha demostrado ser el resultado de la activación y /o pérdida de las funciones supresoras de tumores oncogén, así como en respuesta a señales ambientales, todos los cuales regulan la captación de sustrato de nutrientes y el metabolismo de [10] - [14]. En función de las combinaciones de estos factores y un contexto celular dado, las células cancerosas pueden manifestar una gran variedad de fenotipos metabólicos [15], que pueden afectar ya sea la selección del tratamiento o la respuesta al tratamiento.
A la vista de los numerosos tipos de genéticamente y metabólicamente diversas células cancerosas, una rápida, informativo, relativamente fácil de realizar y el análisis de alto rendimiento de sustrato flujo puede facilitar una mayor comprensión de los mecanismos genéticos y epigenéticos que regulan el metabolismo de células de cáncer, determinar si hay un número finito de fenotipos metabólicos . entre todos los tipos de células de cáncer, independientemente del origen del tejido, y agentes descubren que se dirigen a las vías metabólicas específicas para el tratamiento del cáncer
Las células producen ATP a través de dos vías principales productores de energía: la glucólisis y la fosforilación oxidativa. La ruta glicolítica convierte la glucosa en piruvato. Un destino del piruvato a lactato es la reducción en el citosol en una reacción bioquímica independiente de oxígeno resultando en la producción de ATP y la producción neta de protones. Los protones son bombeados fuera de la célula por diversos mecanismos para mantener el pH intracelular [16] y el flujo de salida de los protones en el espacio extracelular o medio que rodea las células causa la acidificación extracelular [17] - [21]. La principal sustratos nutrientes de glucosa, glutamina, y los ácidos grasos pueden ser completamente oxidados a en CO
2 y H
2O a través del ciclo del ácido tricarboxílico (ciclo TCA) que requiere la cadena de transporte de electrones (ETC) en las mitocondrias usando oxígeno como aceptor terminal de electrones, y que está acoplado a la producción de ATP por la fosforilación oxidativa. El CO
2 producido se puede convertir a bicarbonato y protones como catalizada por la anhidrasa carbólico [16], otra fuente de protones que causan la acidificación medio. En muchas células diferenciadas no transformadas, tales como neuronas, la fosforilación oxidativa produce la mayor parte del ATP celular. En contraste, las células cancerosas se basan en gran medida en la glucólisis, además de la fosforilación oxidativa para su producción de ATP [22]. Así como alimentando la producción de ATP, glucosa y glutamina son fuentes de carbono esenciales que proporcionan precursores anabólicos, algunos de los cuales (por ejemplo, citrato y oxaloacetato) se producen a través de un ciclo de TCA truncado para la biosíntesis de lípidos, ácidos nucleicos y aminoácidos.
Dado que las células vivas no almacenan ATP, lo producen de forma continua y en la demanda, y por lo tanto consumen constante de oxígeno y combustible sustratos. Por lo tanto, la demanda de ATP en las células (es decir, la disponibilidad ADP) controla la velocidad de consumo de oxígeno. Los electrones (energía) almacenados en sustratos nutrientes se extraen a través de las reacciones del ciclo TCA mitocondriales y transportados por transportadores de electrones reducidos NADH y FADH
2 a la ETC. A medida que los electrones fluyen hacia abajo la ETC, la energía liberada se utiliza para bombear protones desde la matriz en el espacio intramembrane, formando un gradiente de protones transmembrana electroquímico a través de la membrana interna mitocondrial. Al final de la ETC, los electrones se transfieren al oxígeno molecular, reduciéndolo a agua a través de la terminal de citocromo C oxidasa. Como los protones vuelven a la matriz mitocondrial a través del complejo ATP sintasa, la energía almacenada en el gradiente de protones a continuación, acciona la fosforilación de ADP en ATP acoplamiento respiración (transporte de electrones) con la producción de ATP. La fosforilación oxidativa, sin embargo, se acopla de forma incompleta a la respiración. Los protones también pueden volver a entrar en la matriz a través de canales de protones tales como las proteínas desacoplantes (UCP), que se encuentran en la membrana interna, sin pasar por la ATP sintasa y que disipan el gradiente de energía sin producir ATP en un proceso conocido como fuga de protones. Parcialmente reducido especies de oxígeno (ROS) tales como el anión superóxido se pueden producir en diferentes sitios en el ETC dependiendo de las condiciones [23]; la fuga de protones ha sido considerada como un mecanismo celular importante para proteger las células del daño oxidativo a través de la reducción de ROS producidos por el ETC [24].
Teniendo en cuenta la relación entre el consumo de oxígeno y la acidificación extracelular con el metabolismo del sustrato nutriente, el aumento del consumo de oxígeno es una medida de la oxidación de sustratos cuando se añade un sustrato para las células. Del mismo modo, un aumento en la tasa de acidificación extracelular después de la adición de glucosa es una medida de flujo glucolítico.
Varios métodos experimentales tradicionales que analizan metabolismo de los sustratos han contribuido a la comprensión actual de metabolismo celular. Estos incluyen la medición de la acumulación de productos finales radiomarcados tales como H
2O y CO
2 metabolizado a partir de sustratos tales como
3H glucosa marcada y
14C ácidos grasos etiquetados. Otros métodos utilizados previamente (y más recientemente desarrollados) para cuantificar metabolitos son trazadores de isótopos estables junto con espectrometría de masas y análisis de RMN, las cuales han dado información detallada sobre el metabolismo de sustrato. Estas técnicas, sin embargo, no obstante, pueden ser mano de obra intensiva y engorroso, y /o relativamente inaccesibles para muchos laboratorios.
Este estudio tiene dos objetivos principales. La primera consistía en aplicar los principios descritos anteriormente para establecer una serie de métodos rápidos y fáciles de analizar el flujo y oxidativa flujo glucolítico sustrato de las células cancerosas. Esto se consiguió mediante la medición de la tasa de consumo de oxígeno celular y la acidificación extracelular utilizando el analizador de XF extracelular Flux [22]. El segundo fue para llevar a cabo la prueba de principio de los experimentos a través de la aplicación de estos métodos de flujo de sustrato, junto con el análisis de la bioenergética mitocondrial en células de glioblastoma SF188s humanos y SF188f para interrogar a sus redes metabólicas.
Materiales y Métodos
Reactivos
carbonilo cianuro de 4- (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP), myxothiazol, antimicina A, la rotenona, 2-desoxiglucosa, oxamato, aminooxiacetato, glucosa, piruvato de sodio y palmitato de sodio se obtuvieron de Sigma (St. Louis , MO, EE.UU.). L-glutamina se obtuvo de Invitrogen (Carlsbad, CA). Oligomicina se obtuvo de Merck (San Diego, CA, EE.UU.). Se obtuvo albúmina sérica bovina fracción V (ácidos grasos libres ultra) de Roche Diagnostics (Indianápolis, IN, EE.UU.). Todos los compuestos y el medio se preparan de acuerdo con las instrucciones del fabricante a menos que se indique lo contrario.
Líneas celulares y cultivo celular
SF188 células de glioblastoma humano se obtuvieron de la Universidad de California en San Francisco Cerebro Banco de Tejidos . Estas células se mantuvieron en un principio, como se recomienda por el emisor, en un medio MEM que contiene glucosa 5,5 mM y 2 mM L-glutamina. Ellos fueron adaptados por etapas a medio DMEM que contenía glucosa 25 mM y 6 mM L-glutamina como un sistema modelo para el estudio del metabolismo de la glutamina como se informó [6]. Como control, las células parentales también se adaptaron en paralelo con medio DMEM que contenía glucosa 5,5 mM y 2 mM L-glutamina. El primero adquirió una tasa de crecimiento mucho más rápido después de 4 semanas de cultivo en el medio y fue nombrado SF188f (rápido). Este último, sin embargo, mantiene tasas de crecimiento similares a las células de los padres que se mantienen en MEM, y fueron nombrados SF188s (lento). Para mantener su fenotipo de crecimiento distintos, las células SF188s y SF188f siempre fueron cultivadas en DMEM que contenía 5,5 mM de glucosa y 2 mM L-glutamina y 25 mM de glucosa y 6 mM L-glutamina, respectivamente, a 37 ° C en un incubador Forma con 10% de CO
2 y 100% de humedad en el ~ 80% de confluencia en 175 cm
2 frascos T (Corning). células HeLa de cáncer de próstata humano PC-3 y el cáncer cervical se adquirieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.), y se mantuvieron en RMPI1640. Todos los medios de cultivo celular fueron suplementados con albúmina 10% de bovino fetal (FBS, Hyclone, Logan, UT, EE.UU.).
medio de ensayo XF
A medio de base se utilizó para los ensayos descritos en este directa o suplementado con sustratos y cofactores como se especifica en cada uno de los ensayos específicos de estudio (véase más adelante) y para cada experimento. El medio de ensayo de base se preparó como sigue. Medium (DMEM) polvo de Eagle Modificado de Dulbecco (Sigma, número de catálogo D5030) fue el material de partida. No contiene glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio, bicarbonato de sodio, o rojo de fenol, y tiene un fosfato baja (ver Materiales S1 en File S1for detalles de la preparación). Además, un tampón modificado de Krebs-bicarbonato Henseleit- (KHB) que no contiene bicarbonato y fosfato inferior también se puede utilizar (Materiales S2 en File S1) como un medio de ensayo alternativo para la oxidación de ácidos grasos. El uso de tampón libre de aminoácido, en comparación con el medio de base para otros ensayos es posible, pero, puede dar lugar a diferentes resultados experimentales que pueden requerir diferentes interpretaciones de datos. Todos los ensayos descritos aquí se llevaron a cabo únicamente en el medio de base con la suplementación indicada, con la excepción de la oxidación de ácidos grasos que se realizó tanto en medio base y KHB, obteniéndose resultados similares.
Preparación de palmitato-BSA conjugado
palmitato de sodio se solubiliza por calentamiento a 68 ° C en solución de cloruro de sodio 150 mM. A continuación, se une a BSA en solución en una proporción molar de 06:01. El protocolo se describe en Materiales S1 S3 en Archivo.
Medición de la tasa de consumo de oxígeno y las tasas de acidificación extracelular
mediciones de OCR y ECAR se realizaron utilizando el analizador de XF24 o XF96 extracelular Flux (Seahorse Bioscience , North Billerica, MA) como se describe [22]. Brevemente, las células se sembraron en XF24 (V7) o placas de cultivo celular XF96 (V3) de poliestireno (Seahorse Bioscience, North Billerica). células SF188s se sembraron a 30.000 /pocillo (placa de XF24) o 20.000 /pocillo (placa de XF96) y las células SF188f a 20.000 /pocillo (placa de XF24) o 15.000 /pocillo (placa de XF96), respectivamente. las células PC-3 y HeLa se cultivaron en placas a 25.000 y 30.000 células por pocillo, respectivamente, en placas de cultivo celular XF24. Las células se incubaron durante 24 a 28 horas en un humidificado 37 ° C incubadora con 10% de CO
2 (medio DMEM) o 5% de CO
2 (medio RMPI1640 y MEM), respectivamente. Debido a que las dos líneas de células proliferan a diferentes velocidades durante el período de incubación de 24-28 horas, las células SF188s y SF188f se trataron con tripsina y después se contaron para determinar el número de células en cada pocillo después de un ensayo. Estos recuentos de células se utilizaron para normalizar o bien OCR o ECAR. Sus viabilidades, tal como se determina después de los ensayos, fueron casi indistinguibles independientemente de la presencia o ausencia de sustratos exógenos o inhibidores metabólicos en el medio de ensayo. Antes de realizar un ensayo, el medio de crecimiento en los pocillos de una placa de células XF se intercambió con el medio de ensayo adecuado para alcanzar un mínimo de 1:1000 dilución de medio de crecimiento. 600 l (XF24) o de 150 l (XF96) del medio de ensayo se añadieron a las células para un ensayo XF. Mientras se calibraron cartuchos de sensores, placas de las células se incubaron en un 37 ° C /no-CO
2 incubadora durante 60 minutos antes del comienzo de un ensayo. Todos los experimentos se realizaron a 37 ° C. Cada ciclo de medición consistía en un tiempo de mezcla de 3 minutos y un período de adquisición de datos de 3 minutos (13 puntos de datos) para el XF24, y 2 min y 4 min para el XF96. puntos de datos OCR y ECAR se refieren a las tasas promedio durante los ciclos de medición. Todos los compuestos se prepararon a concentraciones apropiadas en medio de ensayo deseada y se ajustaron a pH 7,4. Se añadió un volumen de 75 l para XF24 (25 l para XF96) de compuesto a cada puerto de inyección. En un experimento típico, se tomaron antes de la adición de cualquier compuesto 3 mediciones de línea de base, y se tomaron 3 mediciones de respuesta después de la adición de cada compuesto. OCR y ECAR se informaron como tasas absolutas (pmoles /min para OCR y MPH /min para ECAR) o normalizado contra el recuento de células, o expresados como un porcentaje del consumo de oxígeno de referencia. En este estudio, OCR línea de base o ECAR (un término técnico) se refiere a las tasas de partida antes de la adición de un agente, que pueden ser utilizados para las comparaciones con las tasas después de la adición. En contraste, OCR basal o ECAR (un término biológico) se refiere a OCR o ECAR que se producen en las células en reposo con el fin de mantener la función de la célula básica. A menos que se especifique lo contrario, se utilizó la tercera medición de línea de base o después de la adición de cada sustrato o compuesto para generar valores de OCR o ECAR absolutos. Además, el porcentaje de los valores de referencia OCR se calculó como OCR en la tercera medición después de una inyección de agente dividido por el OCR inmediatamente antes de la inyección. Cada dato se determinó mínimamente por triplicado.
XF sustrato Ensayo de flujo Condiciones
flujo glucolítico y la capacidad glucolítica.
El medio de ensayo consiste en el medio base suplementado con 2 mM de L -glutamine. La glutamina es necesaria para lograr la tasa máxima glucólisis para algunos, pero no todas las líneas celulares. El mismo medio se utilizó para determinar la capacidad glucolítica. La concentración de glucosa añadida para iniciar la glucólisis y medir la capacidad glucolítica era 10 mM, mayor que el punto de saturación en ambas condiciones.
oxidación de la glucosa.
El medio de ensayo fue el medio de base sin ningún exógeno suplementación sustrato de combustible. La concentración de glucosa añadida para iniciar la oxidación de glucosa era 10 mM, que se determinó en experimentos preliminares para estar por encima de la saturación.
oxidación glutamina.
El medio de ensayo fue el medio de base sin ningún combustible exógeno sustrato. La concentración de glutamina añadió a las células para iniciar la oxidación glutamina fue 4 mM, que también fue pre-determinado a estar por encima de la saturación.
oxidación de ácidos grasos.
El medio de ensayo fue el medio de base (o KHB) suplementado con glucosa 5,5 mM y 50 mM carnitina (requerido para el transporte de ácido graso de cadena larga en la mitocondria). ácidos grasos de cadena larga probadas incluyen palmitato de ácido graso, octanoato de ácidos grasos de cadena media y de cadena corta de ácidos grasos butirato. Ellos se titularon para concentraciones estimulantes respuesta máxima OCR. La concentración de trabajo de palmitato conjugado con BSA fue de 150 mM y 1 mM de octanoato, que eran también por encima de la saturación.
Es muy importante que las condiciones de ensayo anteriores se cumplan estrictamente. Cualquier variación en la composición del medio de ensayo puede dar lugar a diferentes interpretaciones y puntos de vista en la red metabólica celular. Concentraciones de saturación del sustrato y concentraciones de compuesto óptimas se determinaron mediante la realización de experimentos de titulación tal como se describe en Materiales y S4 S5 en S1 Archivo. El efecto de las condiciones de ensayo sobre la interpretación de los resultados experimentales se describe en otro lugar.
recuentos de células
células
SF188s y SF188f fueron separadas con tripsina-EDTA y se recogieron inmediatamente después de un ensayo XF. Se determinó el número de células en cada pocillo usando un contador de azul de tripano ViCell automatizado (Beckman-Coulter, Fullerton, CA), y se utilizó para normalizar OCR y ECAR como se indica en las leyendas de las figuras.
El análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± desviación estándar, con al menos tres réplicas utilizadas para cada punto de datos. A menos que se indique lo contrario, un
t
prueba se realizó para cada grupo experimental para evaluar la significación estadística respecto a los controles respectivos.
Resultados
La glucólisis y la capacidad glucolítica
de Student pareada
Hemos demostrado previamente que las cuentas de glucólisis para ~ 80% de ECAR total en un número de células cancerosas como se determina a través de dos métodos: a) la eliminación de la glucosa del medio de ensayo y b) la adición de inhibidores de la vía glicolítica, tales como la hexoquinasa inhibidor 2- DG y lactato deshidrogenasa (LDH) inhibidor oxamato [22]. El 20% restante de la ECAR se puede atribuir a otros procesos metabólicos, como el CO ciclo TCA
2 la evolución. Con el fin de medir la glucólisis utilizando el CERA con mayor precisión y facilidad, tomamos el siguiente enfoque. La glucosa se añadió a las células que se incuban en un medio libre de glucosa, pero suplementado con glutamina (ver Materiales y Métodos). El aumento ECAR después de la adición de glucosa establece la tasa de glucólisis. Una adición posterior de un inhibidor de la glucólisis elimina el aumento ECAR inducida por glucosa. Cualquier acidificación debido a otros procesos metabólicos, como el ciclo de Krebs CO
2 de liberación (de cualquier sustrato, pero la glucosa) se detecta como el CERA antes de la adición de glucosa. La respuesta a la glucosa OCR, monitoreados simultáneamente con el CERA, sirve como un indicador de si la glucosa también se catabolized través de la respiración mitocondrial (Figura 1A).
A. Ilustración esquemática de la vía glicolítica. NADH producido en el citosol como glucosa se convierte en piruvato y se regenera por LDH en el citosol. respuesta B. Kinetic ECAR de células SF188s a la glucosa (10 mM) y 2-DG (100 mM) o oxamato (100 mM), respectivamente. células SF188s se sembraron a 30.000 células /pocillo en placas de cultivo celular XF24 V7 24-28 horas antes de los ensayos. El medio de ensayo fue de medio de base libre de sustrato (como se describe en Material y Métodos) suplementado con glutamina 2 mM. El valor ECAR no se normalizó. Un experimento representativo de al menos tres se muestra aquí. Cada punto de datos representa la media ± SD, n = 4. C. respuesta ECAR de células HeLa a la glucosa (10 mM), 2-DG (100 mM) y antimicina (1 M). Insertar: la respuesta de OCR en los mismos experimentos que muestran el efecto Crabtree y que la glucosa no aumentó OCR. Las células HeLa se colocaron en placas a 30.000 /pocillo en placas de cultivo celular XF24 24-28 horas antes de los ensayos. ECAR valores o de OCR no se normalizaron. El medio de ensayo fue de medio de base libre de sustrato (como se describe en Material y Métodos) suplementado con glutamina 2 mM. Un experimento representativo de al menos tres se muestra aquí. Cada punto de datos representa la media ± SD, n = 5.
Se realizó el experimento usando SF188s y células HeLa. Como se muestra en la Figura 1B, la adición de glucosa a las células SF188s provocó un aumento inmediato ECAR, 38 ± 4 mph /min (ECAR de medición 6 menos que de medida 3), que posteriormente fue abolida por la adición de inhibidores de la glucólisis, o bien 2-DG o oxamato. Este experimento indicó que la glucosa añadida exógenamente se dividió en lactato (LDH ya que la inhibición por oxamato reduce ECAR de manera similar a 2-DG), provocando un aumento ECAR y validando así nuestro diseño experimental. Se obtuvieron resultados similares en células HeLa (figura 1C.), que eran compatibles con nuestro estudio anterior [22], así como con una serie de informes recientes que muestran que la respuesta ECAR paralela a la de la producción de lactato [25] - [27]. Antes de la adición de glucosa a las células, así como después de la adición de 2-DG o oxamato, nuevamente observamos una pequeña ECAR, 6 ± 1 mph /min y 10 ± 2 mph /min (en la medida 3), respectivamente, en SF188s y células HeLa (Figura 1B y C). Nos referimos a esta pequeña pero medible ECAR como la acidificación no glucolítica. La respuesta OCR indicó que la inyección de glucosa no sólo no provocaría un aumento, pero de hecho causó una ligera disminución de OCR (Figura 1C), que es similar al efecto Crabtree, observada por primera vez en las células tumorales por Crabtree en los años 1920 [ ,,,0],28].
las dos fuentes de protones más significativos que pueden contribuir a la acidificación no glicolítica son el ciclo de Krebs y la degradación del glucógeno intracelular, es decir, la glucogenólisis [20]. Para determinar la contribución de la CO ciclo TCA
2 la evolución, se utilizó un complejo antimicina inhibidor III para detener el flujo de electrones y por tanto el flujo del ciclo TCA en las células HeLa. La glucosa se añade en primer lugar para iniciar la glucólisis, seguido de 2-DG abolirla, dejando atrás el CERA no glucolítica. La adición final de antimicina detuvo el ciclo del TCA de la producción de CO
2. Aunque un residuo se mantuvo, 4 ± 1,4 mph /min, antimicina elimina aproximadamente la mitad de la ECAR no glicolítico (Figura 1C), lo que confirma la contribución de ciclo TCA CO protón
2 derivado de la acidificación no glicolítica. Hemos probado si la ECAR antimicina-resistente se debió a la glucogenolisis utilizando CP91149, un inhibidor de la glucógeno fosforilasa (la primera enzima de la degradación del glucógeno), pero no se observó ningún efecto significativo de CP91149 sobre la acidificación no glucolítica (datos no mostrados) , que nos lleva a la conclusión de que la ECAR no glicolítica residual tuvo que explica por otros procesos metabólicos, tales como reacciones de descarboxilación catalizada por la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y /o piruvato deshidrogenasa. En conjunto, estos resultados confirman una vez más que las cuentas de la glucólisis para la mayoría de ECAR observaron en las células cancerosas, y establecieron que el TCA derivados de CO
2 es un contribuyente principal de la acidificación no glicolítica.
determina el flujo glucolítico
in vitro
a niveles de oxígeno en el ambiente refleja tasa de glucólisis basal. Cuando las células experimentan pérdida de la producción de ATP mitocondrial debido a la inhibición de la fosforilación oxidativa, ya sea en baja tensión de oxígeno o por oligomicina, que aumentan su flujo glucolítico y hacer más ATP de las vías glucolíticas para mantener la homeostasis celular de ATP [22]. Nos referimos a este aumento de flujo glucolítico en respuesta a la deficiencia en la producción de ATP mitocondrial como capacidad glucolítica. Experimentalmente, se define como la capacidad glucolítica ECAR glucosa inducida por mitocondrial oligomicina inhibidor de la ATP sintasa.
Para determinar tanto el flujo glucolítico y la capacidad glucolítica de la misma población de células en un experimento, se midió el CERA mientras que la glucosa de forma consecutiva de inyección, oligomicina, y 2-DG. Como se muestra en la Figura 2A, la adición de glucosa a las células HeLa, como se esperaba, desencadenado un flujo glucolítico de 19 ± 0,9 mph /min (EACR en medición 6 menos que en la medición 3) en células HeLa. La adición posterior de oligomicina causó un aumento adicional de ECAR a 44 ± 3,8 mph /min (ECAR en medición 9 menos que en la medición 3), lo que indica un flujo de glucosa elevada hacia lactato y revelando la capacidad glucolítica de células HeLa. La adición final de la glucólisis inhibidor 2-DG abolió la glucólisis general (Figura 2A). El flujo glucolítico calculado y capacidad glucolítica de la glucólisis experimento se muestran en la Figura 2B.
A. respuesta ECAR cinética de células HeLa a la glucosa (10 mM), oligomicina (2 M), y 2-DG (100 mM). Insertar muestra la respuesta de OCR en respuesta a la glucosa y oligomicina. Las células HeLa se colocaron en placas a 30.000 /pocillo en placas de cultivo celular XF24 V7 24-28 horas antes de los ensayos. El medio de ensayo fue el medio de base libre de sustrato suplementado con glutamina 2 mM. ECAR valores o de OCR no se normalizaron. Un experimento representativo de al 5 se muestra aquí. Cada punto de datos representa la media ± SD, n = 4. B. Se calcula el flujo glucolítico, capacidad glucolítica. flujo glucolítico es la diferencia entre los eCars de medida 6 y la medición 3. Asimismo, capacidad glucolítica describe la diferencia entre la ECAR de medición 9 y el de medición 3. * p & lt;. 0.05
Dos experimental deben cumplirse las condiciones en el experimento anterior. En primer lugar, la concentración oligomicina debería inhibir al máximo la respiración. Esto se logró mediante la selección de la concentración oligomicina que resultó en la inhibición OCR máxima en un experimento de valoración. Por ejemplo, se encontró que 0,5 oligomicina M a ser suficiente para lograr la inhibición máxima de OCR en células HeLa (datos no mostrados). En segundo lugar, es crítico para asegurar que el suministro de glucosa exógena está saturando, permitiendo que la maquinaria glicolítica para ser el factor limitante. Se determinó la concentración de saturación de la glucosa para alcanzar la respuesta máxima ECAR en un experimento de valoración concentración de glucosa, en el que se añadieron concentraciones crecientes de glucosa a las células, seguido de la adición de control o oligomicina a la concentración que inhibe al máximo la respiración. En células HeLa, por ejemplo, se encontró que ECAR aumentó continuamente hasta que la concentración de glucosa alcanzó 5 mM, después de lo cual no hubo un aumento ECAR más (Figura S1). Se obtuvieron resultados similares con una docena transformado y líneas de células no transformadas (datos no mostrados). Elegimos una concentración más alta de lo saturando de 10 mM como la concentración estándar para determinar tanto el flujo glucolítico y la capacidad glucolítica.
oxidación de la glucosa
piruvato derivado de la glucosa también puede entrar en la mitocondria, donde se convierte en acetil CoA por la piruvato deshidrogenasa y entra en el ciclo de TCA a través de citrato sintasa (o como oxaloacetato vía piruvato carboxilasa [29]. el radical acetilo finalmente se oxida a CO
2 y H
2O (Figura 3A) . El proceso que consume oxígeno de oxidación de la glucosa en piruvato primero y luego a CO
2 y H
2O se denomina aquí como la oxidación de la glucosa.
ilustración esquemática de ruta bioquímica para la oxidación de glucosa a. . el NADH producido en el citosol como la glucosa se convierte en piruvato se importa en la mitocondria a través de la lanzadera del malato-aspartato y regenerado a través de la ETC para mantener la oxidación continua de la glucosa. B. respuesta cinética OCR de las células PC-3 a la glucosa (10 mM ); respuesta C. OCR a la glucosa (10 mM), oligomicina (1 M) y FCCP (0,3 M). las células PC-3 se sembraron a 25.000 /pocillo en placas de cultivo de XF24 V7. El medio de ensayo fue el medio de base libre de sustrato. Los valores de OCR no se normalizaron. Un experimento representativo de tres se muestra aquí. Cada punto de datos representa la media ± SD, n = 4.
De manera experimental, se utilizó el OCR inducida por glucosa para medir la oxidación de la glucosa. Con el fin de establecer el ensayo de oxidación de la glucosa, elegimos células PC-3 que oxidan activamente glucosa. Para determinar la oxidación de glucosa, se añadió glucosa 10 mM a las células en medio de ensayo que no contiene glucosa o glutamina (ver Material y Métodos). Como se muestra en la Figura 3B, la adición de glucosa a células PC-3 causó un aumento inmediato de OCR, 45 ± 11 pmol /min (OCR en la medición 6 menos que en la medición 3), lo que indica el flujo de glucosa en el ciclo TCA, y en última instancia , el ETC para la oxidación completa. Este diseño experimental proporcionó una medición cuantitativa de la oxidación de la glucosa bajo esta condición experimental. En un diseño de la variante, se expusieron las células PC-3 a la glucosa, oligomicina, y FCCP consecutivamente, con 3 mediciones antes de cada adición del compuesto y después de cada adición del compuesto. FCCP desacopla la respiración de la fosforilación oxidativa, lo que permite la oxidación de cualquier sustrato oxidable presente en el medio de ensayo que se produzca. Como se muestra en la Figura 3C, FCCP estimuló un aumento en OCR después de la adición de glucosa, pero no el control, confirmando además que las rutas bioquímicas para la oxidación de glucosa fueron activos en células PC-3. La respuesta OCR para FCCP confirma y proporciona una evaluación semicuantitativa de la capacidad de las células para oxidar la glucosa. En este diseño experimental, las células se pre-incubaron en medio de base libre de sustrato durante 60 minutos antes de un ensayo, por lo que hay una posibilidad de que puedan se han estresado y alterado su respuesta a la glucosa adición.