Extracto
Estudios anteriores han demostrado que el ADN se puede transferir de morir células modificadas a las células vecinas a través de la fagocitosis de los cuerpos apoptóticos, lo que conduce a la transformación celular. Aquí, nos proporcionan la prueba de que se hace uso de las células de cáncer de cuello uterino apoptóticos derivados de células mesenquimales humanas. Curiosamente, HeLa (HPV 18+) o Ca esquí (HPV16 +) las células, que alberga ADN del VPH de alto riesgo integrado, pero no las células C-33 A (VPH), fueron capaces de transformar las células receptoras. fibroblastos primarios humanos envolvieron los cuerpos apoptóticos efectivamente dentro de los 30 minutos después de co-cultivo. Este mecanismo es activo e implica el citoesqueleto de actina.
In situ
hibridación de fibroblastos transformados reveló la presencia de ADN de VPH en el núcleo de un subconjunto de células phagocytosing. Estas células expresan el HPV16 /18 E6 gen, lo que contribuye a la alteración de la vía de p53 /p21, y las células exhiben un fenotipo tumorigénico, incluyendo un aumento de la tasa de proliferación, poliploidía y el crecimiento de la independencia de anclaje. Dicha transferencia horizontal de oncogenes virales a las células que carecen de receptores para HPV podría facilitar la persistencia del virus, el principal factor de riesgo para el desarrollo del cáncer cervical circundante. Este proceso podría contribuir a la progresión de la enfermedad asociado al VPH
in vivo
Visto:. Gaiffe E, Pretet J-L, S Launay, Jacquin E, M Saunier, Hetzel G, et al. (2012) Las células apoptóticas VPH positivo de cáncer de exposiciones La transformación de Propiedades. PLoS ONE 7 (5): e36766. doi: 10.1371 /journal.pone.0036766
Editor: Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Julio, 2011; Aceptado: 6 Abril 2012; Publicado: 4 Mayo 2012
Derechos de Autor © 2012 Gaiffe et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Becas y trabajos fueron apoyados por fondos públicos de la "región de Franche-Comté," "Institut National du Cancer" y "Liga Contra el cáncer, Comité du Doubs." los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, toma de publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los estudios epidemiológicos y experimentales han puesto de manifiesto que los de alto riesgo los virus del papiloma humano (VPH), especialmente el VPH 16 y 18, desempeñan un papel importante en la inducción de carcinomas del cuello uterino [1], [2]. Los aspectos mecánicos de la carcinogénesis inducida por el VPH son más a menudo relacionadas con la supresión de la E2 ORF como consecuencia de la integración del ADN viral en el genoma huésped [3]. Esto conduce a una expresión desregulada de genes virales E6 y E7, que representan los principales genes de transformación. En el corazón de esta transformación son la unión de E6 a p53 y E6AP, que favorece la degradación de p53 [4] y la formación del complejo E7 con la proteína de retinoblastoma pRb [5], lo que resulta en la desregulación de control del ciclo celular, reparación del ADN y la apoptosis .
Durante el desarrollo de tumores, un gran porcentaje de las células se pierde a través de la apoptosis [6]. Dicha muerte celular se desencadena por una variedad de señales extracelulares, incluyendo el agotamiento de factor de crecimiento /supervivencia, la hipoxia y una pérdida de las interacciones célula-matriz, así como señales intracelulares, tales como daño del ADN [7]. Por último, las células apoptóticas se borran por las células fagocíticas especializadas que inactivan y degradan sus componentes celulares [8]. Sin embargo, las células apoptóticas pueden también ser internalizados por células receptoras no especializados. Por lo tanto, los fibroblastos son capaces de fagocitar los neutrófilos apoptóticos [9], y las células endoteliales hepáticas pueden unirse e hígado fagocitan los cuerpos apoptóticos [10]. A través de este proceso de endocitosis, las células apoptóticas pueden actuar como un vector de ADN, y el ADN transferido horizontalmente pueden conferir una ventaja selectiva a la célula receptora.
transferencia horizontal de genes (HGT) ha sido bien documentado en procariotas y contribuye a evolución, ecología y la resistencia a los antibióticos [revisado en [11], [12]]. Mientras que la transferencia horizontal de información genética entre dos eucariotas ha sido reportado en las plantas [13], [14] e invertebrados [15], pocos estudios se han centrado en HGT entre las células de mamíferos. El intercambio de información genética mediada por cuerpos apoptóticos se ha demostrado que se producen entre las células de cáncer de próstata [16]. Los cuerpos apoptóticos de células linfoides transformadas que albergaban copias integradas del virus Epstein-Barr también pueden transferir secuencias de ADN viral [17]. Del mismo modo, el VIH-1 proviral genes se transfieren a las células que carecen de receptores para la entrada viral [18]. El ADN también se ha informado que ser transferido de apoptóticos H-ras
V12- y células c-myc-transfectadas con p53 - /- fibroblastos embrionarios de ratón, lo que conduce a su transformación [19]. Por otro lado, phagocytosing células que expresan p53 o p21 no se transforman, lo que sugiere un mecanismo de protección controlado por la ruta de p53 [20]. Recientemente, Ehnfors J.
et al.
Demostró que los fibroblastos y las células endoteliales son capaces de adquirir y la reproducción de H-ras
V12 y el ADN c-myc cuando las células tumorales apoptóticas contienen el virus de simio 40 T grande ( SV40LT) antígeno [21]. Estas observaciones proporcionaron pruebas de que la eficiencia de transformación se asocia con la expresión de la inhibición de p53 SV40LT [22]. Debido a que la mayoría de los carcinomas cervicales expresan la oncoproteína viral E6, que promueve la degradación de p53, al igual que SV40LT, la hipótesis de que la transferencia horizontal de oncogenes VPH podría ser un mecanismo alternativo de la carcinogénesis.
A continuación, presentamos pruebas de que células apoptóticas se derivan de células de cáncer de cuello uterino-derivado que albergan copias integradas de HPV son capaces de transformar fibroblastos primarios humanos (HPF). Además, demuestran que las células tumorales receptor se pueden caracterizar por una alta tasa de proliferación y hiperploidía. Además, el material genético viral inhibición de la vía p53 /p21 se expresa en las células transformadas. Para nuestro conocimiento, este es el primer informe de la transformación de las células primarias humanas a través de la captación de cuerpos apoptóticos a partir de células de carcinoma cervical infectadas por el VPH.
Resultados
células de carcinoma cervical apoptóticas son internalizados por fibroblastos
La apoptosis de las células del donante de carcinoma cervical se indujo por la irradiación UVB y la exposición estaurosporina como se describe anteriormente [23], [24] y fue documentado por un análisis de la exposición de fosfatidilserina (anexina V tinción), contenido de ADN ( propidio tinción de yoduro) y fragmentación nuclear (DAPI) (Métodos S1 y la figura S1A y S1B). El tratamiento dio lugar a la ausencia de las células vivas, capaces de proliferación en las suspensiones de células apoptóticas (Métodos S1 y la figura S1c y SID). Estudios anteriores han demostrado que los cuerpos apoptóticos derivados de linfocitos EBV-B en libros puede transmitir el ADN por transferencia horizontal y que el ADN de EBV integrado pueden ser transferidos preferentemente en comparación con el ADN celular [17]. En este estudio, nos preguntamos si HPF podrían engullir las células apoptóticas derivados de las líneas celulares de carcinoma cervical HeLa (HPV18), Ca esquí (HPV16) y C-33 A (VPH), independientemente del estado virológico.
La presencia de células apoptóticas fluorescentes en las células receptoras se confirmó por microscopía confocal. Las células apoptóticas HeLa que contienen ADN se enredan en el citoesqueleto de actina de las HPF dentro de las 48 h (Figura 1A). Las células apoptóticas Ca esquí y C-33 A también se recogieron de manera eficiente por parte del receptor (figura 1B). La incubación de la HPF solo o con el sobrenadante de células apoptóticas no se tradujo en CFDA, SE (5- (y 6 -) - éster de diacetato succinimidil carboxyfluoresceine) tinción, lo que sugiere una relación entre la fluorescencia verde y la presencia de células apoptóticas (figura 1B ). Mediante el seguimiento de los tintes fluorescentes en los puntos de tiempo tempranos (de 1 h a 3 h), se observó la contratación de actina cuando las células apoptóticas estaban obligados a HPF (Figura 1CI, flecha blanca). La membrana de fibroblastos expandido alrededor de ambos lados de la célula apoptótica a través de la polimerización de actina (figura 1Cii, flechas blancas). F-actina rodea entonces las células apoptóticas para formar una copa de fagocitosis y cerrado en un anillo (figura 1Ciii). Estas observaciones microscópicas son indicativos de la fagocitosis, aunque no hemos caracterizado específicamente este mecanismo [25], [26]. El uso de marcadores específicos de filamentos intermedios para cada tipo de célula, se confirmó que las células apoptóticas fueron células epiteliales (citoqueratina positivo) que se internaliza por los fibroblastos (vimentina positivo) (figura 1D). Utilizando el enfoque cuantitativo de la citometría de flujo, se evaluó el porcentaje de HPF que afectó a las células de carcinoma apoptóticos teñidos. Independientemente del tipo de células apoptóticas utilizado, la eficiencia de la internalización fue similar (12,5% con apoptosis HeLa; 13% con apoptótica Ca de esquí; 14,5% con apoptótica C-33 A) (figura 1E). Sin embargo, hemos observado que el 12 a 15% de los fibroblastos fueron capaces de asumir las células apoptóticas, mientras que el número de células apoptóticas sembradas era diez veces mayor que la de los HPF. Esto sugiere que los fibroblastos tienen un potencial limitado en la eficiencia y /o la cantidad de la internalización de las células apoptóticas. Cuando las células receptores fueron co-incubaron con células apoptóticas a 4 ° C durante 48 h, el porcentaje de internalización se redujo significativamente a 2%, lo que sugiere que el proceso de internalización sigue una vía dependiente de la energía (figura S2). Estos resultados indican que los fibroblastos primarios humanos pueden fagocitar las células apoptóticas, independientemente de su estado virológico, a través de la fagocitosis.
(A) Co-cultivo de HPF y células HeLa apoptóticas. (B) HPF co-cultivadas con células apoptóticas Ca esquí (superior izquierda), C-33 células apoptóticas A (superior derecha), solo (abajo a la izquierda) y el sobrenadante de las células HeLa apoptóticas (abajo a la derecha). (C) HPF fueron cultivadas con células HeLa apoptóticas para diferentes períodos de tiempo: 1 h (Ci), 2 h (CII) y 3 h (CIII). Las imágenes muestran el reclutamiento y la formación de actina de expansión de membrana (flechas). (D) HPF, células de Ca de esquí y HPF más células HeLa Ca esquí o apoptóticos se tiñeron con anti-vimentina (TRITC) y anticuerpos anti-citoqueratina (Cy2). observaciones al microscopio se realizaron con un microscopio confocal (barra de escala: 1 m). Todos los resultados son representativos de cuatro experimentos independientes. (E) HPF se incubaron con células HeLa apoptóticas, Ca esquí o C-33 células A durante 48 h y la internalización de las células apoptóticas se cuantificó por citometría de flujo.
Sólo las células apoptóticas positivas para el VPH se transforman de manera eficiente las células receptoras
Ehnfors
et al.
demostró que el ADN de las células apoptóticas fibrosarcoma rata transfectadas con H-
ras
V12, c-
myc y
SV40LT se transfiere hacia y transforma fibroblastos primarios [21]. Debido a oncogenes VPH, como SV40LT, son capaces de transformar de manera eficiente las células infectadas y bloqueo de la vía p53, entre otros efectos, hemos probado si fibroblastos cultivados con células apoptóticas fueron capaces de crecer con independencia de anclaje mediante la medición de su capacidad de formar colonias en un agar blando ensayo, como se observa con la HeLa, Ca esquí y C-33 A las células cancerosas (figura 2A, línea superior). Por el contrario, los fibroblastos primarios humanos eran incapaces de crecer sin una matriz sólida (figura 2A, línea superior). Aunque los tres tipos de cuerpos apoptóticos fueron internalizados por los fibroblastos, las células apoptóticas sólo albergan el VPH (HeLa y células de esquí Ca) transforman los HPF (Figura 2A, la línea media). Los controles con células apoptóticas por sí solo no dio lugar a la formación de colonias (figura 2A, línea inferior). Estos hallazgos demuestran que la incubación de células apoptóticas con el ADN del VPH-inducida integrado eficazmente el crecimiento independiente de anclaje de HPF, un sello distintivo de transformación y un
in vitro
correlato de tumorigenicidad
in vivo
[27 ]. El estado de transformación de los HPF se ensayó adicionalmente mediante ensayos de límite de dilución. De hecho, en contraste con fibroblastos primarios, los fibroblastos transformados por HeLa apoptótica (FH) y Ca esquí células (FC) tenían la capacidad de formar colonias en multicapa cuando fueron cultivadas a baja densidad (figura 2B). En esta etapa, el FH y FC comenzaron a exhibir un fenotipo transformado, con algunas de las células de apariencia redondeada, a diferencia de los HPF de control, que muestran una forma de huso (Figura 2C). Por otra parte, los fibroblastos transformados consistían principalmente en células pequeñas de relleno o agregados tales como las células HeLa y Ca de esquí, mientras que los fibroblastos primarios forman una monocapa aplanada.
HPF (A) y HeLa, Ca esquí y C-33 A células de cáncer cervical (línea superior); HPF después de 48 h de exposición a células apoptóticas (apo HPF, apo HeLa, apo Ca de esquí, apo C-33 A) (línea media) se cultivaron en agar blando durante 21 días. Las células apoptóticas por sí sola también se cultivaron como control (línea inferior). Las fotografías fueron tomadas con una lente de aumento 20 ×. HPF (B y C), células HeLa, células de Ca de esquí y fibroblastos transformados por HeLa apoptóticas (FH) y las células apoptóticas Ca esquí (FC) (después de la selección en agar blando), se cultivaron en un límite de dilución durante 21 días. (B) Las colonias teñidas con cristal violeta se contaron, y la eficiencia en placas (PE, el porcentaje de células capaces de formar colonias; SD, desviación estándar) se calculó. (C) aumentos de colonias se fotografió con una lente de 40 aumentos.
Figura 3A muestra que los fibroblastos transformados, FC y FH, no son positivos para la tinción de citoqueratina, a diferencia de las células epiteliales HeLa y Ca esquí, revocando la posibilidad de que las células observadas transformadas son células cancerosas sobreviviente raras y una evolución clonal de células Ca esquí. Como se ilustra en el panel superior izquierdo de la figura 3B (marcador de D18S61, un ejemplo de 20 marcadores de tipificación de ADN utilizado), fibroblastos transformados tienen un patrón de ADN que es diferente de las células tumorales originales. Otros resultados de los experimentos de tipificación de ADN mostraron que las células FC eran diferentes de las células de Ca de esquí, pero contienen algunos alelos de ADN de esquí Ca (TP53 y los marcadores D8S264), que refleja la transferencia de pequeños fragmentos de ADN. FC ADN también contiene partes de los cromosomas (marcadores D17S250), lo que refleja la transferencia de grandes fragmentos de ADN como se describe por Holmgren [17], [19]. A pesar de estos resultados demuestran la reorganización cromosómica (pérdida y ganancia de alelos) de las células FC, no podemos excluir la posibilidad de contaminación cruzada, a pesar de ser muy poco probable.
HPF (A), Ca esquí, HeLa, FC células y se analizaron por FH inmunocitofluorescencia para la expresión citoqueratina (barra de escala: 1 m). (B) ADN de células de esquí y FC Ca se amplificó por PCR fluorescente utilizando 20 microsatélites. Se muestran cuatro amplificaciones de microsatélites representativos. Los diferentes tipos de alelo se observa utilizando cuatro marcadores:. D18S61 TP53, D8S264 y D17S250
A continuación, se determinaron los efectos de la transformación HPF en la tasa de proliferación usando una curva de crecimiento y los resultados del MTT ( 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazolio bromid) ensayo de proliferación se muestra en la Fig. 4A y 4B, respectivamente. El FH tenido un tiempo medio de duplicación de la población de 15 h, y el FC tuvo un tiempo medio de 16 horas, mientras que el tiempo de duplicación HPF fue mayor en un factor de 19 (298 h) (figura 4A). La actividad mitocondrial medida por el ensayo de proliferación de MTT fue concordante con los resultados de la curva de crecimiento (Figura 4B). Estas modificaciones tasa de crecimiento apoyan el potencial tumorigénico de los fibroblastos recién transformadas. Por lo tanto, hemos probado si el aumento de la tasa de crecimiento y la transformación de las células receptoras se asociaron con modificaciones genéticas que conducen a hiperploidía. ensayos de citometría mostraron que el contenido de ADN aumenta con los pasajes de fibroblastos transformados (Figura 4C). En nuestros experimentos, un HPF intensidad media de fluorescencia (MFI) de 154 correspondieron a células diploides (Figura 4D). El MFI aumentó a 205 y 250 después de 5 (P5) y 15 (P15) pasajes de células FH, respectivamente. Hemos observado resultados similares para las células Fc (219 en P5 y P15 en 264). La MFI a 15 pasajes de la HF y el FC representado hypertriploidy. Aneuploidía, como se ve en nuestro modelo, a menudo es causada por un tipo particular de inestabilidad genética y es una de las propiedades más comunes de cáncer [28].
(A y B) y HPF HPF transformado por apoptosis HeLa (FH) o células apoptóticas Ca esquí (FC) se hicieron crecer durante las longitudes de tiempo indicado. La proliferación celular se controló cada día contando el número total de células (A) y por ensayos de MTT (B). Los gráficos presentan la media (+/- SD) de tres experimentos independientes. (C) HPF, FH y FC en pasajes 5 (P5) y 15 (P15) se tiñeron (10
6 células) con una solución de yoduro de propidio y se analizaron mediante citometría de flujo. (D) El MFI del pico G0 /G1 (media de tres experimentos independientes +/- SD) muestra la ploidía del HPF, FH y el FC al P5 y FH y el FC al P15.
apoptótica las células de cáncer asociado al VPH transferir eficientemente oncogenes virales a los fibroblastos
Debido a que sólo las células del donante HeLa y Ca esquí apoptóticas fueron capaces de transformar fibroblastos, la hipótesis de que los oncogenes VPH podrían ser transferidos a las células receptoras. Nuestro análisis de microscopía confocal sugirió que el material genético se transfirió de las células apoptóticas a los núcleos de fibroblastos después de 6 h de co-cultivo (Figura 5A, flechas blancas). La reorganización del citoesqueleto de actina apareció para entregar la célula apoptótica hacia el núcleo para la transferencia de ADN, como se ha visto con gran ampliación mediante la superposición de la luz transmitida con faloidina o tinción DAPI imágenes. A raíz de estas observaciones, se determinó la transferencia de ADN de VPH en los receptores de fibroblastos utilizando
In situ
hibridación (ISH) con una sonda hibridada específicamente al ADN del VPH de alto riesgo. células HeLa y Ca Ski se utilizaron como controles positivos. Confirmando nuestra hipótesis, se observaron las señales de hibridación como puntos de color púrpura en las células apoptóticas y los núcleos de los fibroblastos transformados (FH y FC), mientras que no se detectó señal en los HPF (Figura 5B). Estos datos validan la hipótesis de la transferencia horizontal de oncogenes virales. Un segundo enfoque consiste en amplificar el ADN E6 de HPV 16 y 18 confirma la presencia de ADN viral en los fibroblastos transformados (figura 5C). Además, se analizó la expresión de E6 de HPV16 y HPV18 E6 por la transcriptasa inversa seguido de PCR en tiempo real cuantitativa. La Figura 6A ilustra que se detectaron los transcritos de E6 en las células FH y FC transformadas con niveles sin embargo más bajas que en las células HeLa y CaSki parentales. Estos datos sugieren que la transferencia de oncogenes virales es eficiente y funcional. Para examinar más a fondo el papel de los oncogenes E6 transferidos como inhibidores de la expresión de p53, que immunoblotted para p53 y uno de sus objetivos, p21. Por consiguiente, los niveles de p53 y p21 de los HPF transformadas disminuyeron sustancialmente, similar a la disminución de células de cáncer de donante (figura 6B). En general, estos resultados ponen de relieve un papel crítico de la transferencia de oncogén viral en la transformación de células primarias, un proceso que no pasa por la ruta de p53.
(A) Las imágenes ilustran la transferencia de ADN de las células apoptóticas a los receptores de fibroblastos (flechas). Las observaciones microscópicas se realizaron con un microscopio confocal (barra de escala: 1 m). ADN (B) VPH de alto riesgo fue detectado por
In situ
hibridación en células HeLa parentales y apoptóticas y Ca esquí, FH y el FC pero no en HPF. Las células fueron counterstained con eosina (barra de escala: 1 m). electroforesis (C) Gel de agarosa de la albúmina humana amplificada y E6 de HPV18 y HPV16 E6 ADN (MW: peso molecular). Las imágenes son representativos de tres experimentos independientes.
(A) E6 de HPV18 y HPV16 E6 cuantificación del ARN del HPF, células de los padres y los fibroblastos transformados por las células HeLa apoptóticas o células apoptóticas (Ca esquí llamado FH y FC respectivamente) se realizó por PCR en tiempo real cuantitativa después de la transcripción inversa. Los gráficos representan la media de tres experimentos independientes (+/- SD). análisis (B) La inmunotransferencia de p53 y p21 expresión en líneas celulares de cáncer, HPF y FH y el FC fibroblastos transformados, utilizando anticuerpos monoclonales de ratón contra p53 y p21. Las transferencias también se probaron con un anticuerpo β-actina.
Discusión
Los resultados de este estudio proporcionan evidencia directa del potencial oncogénico de células apoptóticas positivas de HPV. La transferencia de ADN viral derivado de células cancerosas de cuello uterino VPH positivas a través de HGT promovió el crecimiento y la transformación de HPF y podría representar un mecanismo alternativo para la transformación celular asociado al VPH. Bergsmedh
et al.
Previamente demostrada transferencia oncogén horizontal entre las células eucariotas [19]. En su modelo, las células del donante fueron fibroblastos primarios de roedores modificados para sobreexpresar c-
myc Opiniones y H-
ras
V12 y un gen resistente a la higromicina que permite una selección muy rigurosa de células receptoras transformadas después de HGT.
En nuestro estudio, las tasas de internalización de las células cancerosas apoptóticas fueron similares, independientemente de la condición de VPH. Sin embargo, el descubrimiento de que las células cancerosas sólo HeLa y Ca esquí que porta oncogenes VPH naturalmente integrados, pero no en C-33 células VPH-negativos A son capaces de transformar phagocytosing fibroblastos proporciona apoyo a la hipótesis de que el ADN viral transferido por las células apoptóticas se puede reutilizar y expresado por las células receptoras.
El
in vitro
receptor en la transformación celular por el ADN transferido horizontalmente, facilitado por la fragmentación del ADN, se demostró que era dependiente de p53 [29]. De hecho, las células p53 o p21 deficiente, pero no de tipo salvaje fibroblastos p53, se hizo semejante a un tumor después de su absorción de c-myc
y H-
ras
oncogenes V12 , lo que indica que la vía de señalización Chk2 /p53 /p21 protege a las células contra la propagación de ADN potencialmente perjudiciales [19], [20], [30]. Por otra parte, SV40LT, lo que facilita la degradación de p53, puede superar esta vigilancia genética que tanto el
in vitro
y
in vivo
[21]. Al igual que SV40LT, las oncoproteínas E6 de VPH tipo 16 y 18 están asociados físicamente con p53 de tipo salvaje y favorecen su degradación proteosomal [revisado en [31]]. Un análisis de los fibroblastos transformados reveló que contenían E6 de HPV16 o HPV18 E6 ADN. Además, ISH demostró que el ADN del VPH a partir de las células cancerosas apoptóticas se transfiere a los núcleos de los fibroblastos receptores. Una vez que el ADN se transfirió, se detectó la expresión de genes HPV E6 a nivel del ARN hasta 15 semanas después del inicio de los experimentos de co-cultivo. Las células receptoras que expresan E6-mostraron una disminución de los niveles de p53, así como su objetivo, p21, lo que podría explicar en parte las alteraciones en los circuitos de control del crecimiento.
Tenemos la intención de confirmar por genotipo que los fibroblastos transformados eran únicas y se derivaron a partir de fibroblastos primarios y líneas celulares de cáncer de los padres. Mediante el estudio de varios microsatélites, encontramos que en realidad albergaban algunos alelos idénticos a los identificados en las células de cáncer de cuello uterino apoptóticas. Sin embargo, debido a la pérdida de fibroblastos primarios a la senescencia, no hemos podido confirmar que se derivaron de los fibroblastos primarios. Por ello no podemos excluir completamente la posibilidad de contaminación cruzada con una línea celular no relacionado, aunque esta posibilidad parece improbable. Sin embargo, los fibroblastos alterados viralmente que fueron capaces de formar colonias mostraron características morfológicas peculiares, una alta tasa de proliferación y aneuploidía. La transición de diploidia a aneuploidía, una característica observada en casi todos los tipos de cáncer [28], se ha observado en las lesiones asociadas al VPH de alto riesgo tempranos del cuello del útero [32] y se ha atribuido al efecto sinérgico de E6 y E7 oncoproteínas [ ,,,0],revisado en [31]]. Sin embargo, las células inmortalizadas de VPH de alto riesgo son no tumorigénicos, y la activación de oncogenes celulares c-
myc
, H-
ras Opiniones y c-
fos
es necesario para superar completamente la función de anti-oncogénica de p53 y para dar como resultado el desarrollo del cáncer cervical [33], [34], [35]. El estudio adicional de la expresión de estos oncogenes celulares activados posiblemente ayudará en la comprensión del mecanismo de la transformación de fibroblastos. No obstante, la transmisión oncogén HPV podría tener un papel más importante que considerado, ya que la expresión de HPV16 E6 oncogén en 33 células C VPH negativos A confiere un fenotipo agresivo, como se muestra por la resistencia a la radiación en tumores trasplantados [36].
escape de mecanismos de vigilancia inmune puede representar el factor de riesgo principal para la persistencia del ADN del VPH y la progresión de la lesión, mientras que la transferencia viral a partir de cuerpos apoptóticos en las células que carecen de receptores para el VPH
in vivo que rodea
podría facilitar la persistencia del VPH en el cuello del útero. Por otra parte, dicha transferencia podría explicar la propagación de HPV a células mesenquimales, como se observa por ISH en carcinomas de cuello uterino [37], [38], y la posibilidad de un depósito del estroma para el VPH. Por otra parte, en los tumores sólidos humanos, un subconjunto de células cancerosas, llamadas células madre del cáncer, es probable que se inician como consecuencia de HGT causan cánceres muy agresivos con una alta propensión a la diseminación metastásica [39]. Esto podría explicar la asociación positiva entre la tasa de apoptosis intratumoral y varios parámetros de tumores cervicales, tales como el tamaño del tumor, grado de lesión, fenotipo metastásico y la supervivencia de los pacientes [7], [40], [41], [42].
Además, el aumento de la prevalencia de células apoptóticas después de la quimioterapia y /o radiación podría ser en parte responsable de la recurrencia de lesiones del VPH mediante la inducción de la transformación de nuevas células en el mismo o diferentes ubicaciones de meses o años después de la remisión anatómicas [43 ], [44]. Las investigaciones de esta posibilidad se justifica, además de los esfuerzos para encontrar nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a los oncogenes E6 /E7 para limitar su transferencia horizontal y controlar el desarrollo de tumores.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y apoptosis inducción
HPF fueron aisladas de piel humana adulta después de la abdominoplastia como se describe anteriormente [45] y se cultivaron en DMEM completo (Lonza) que contiene 10% de FBS (Lonza), penicilina /estreptomicina y L-glutamina. HPF extraídos de residuos quirúrgicos no están sujetos a la validación de un comité de ética y el consentimiento del paciente de acuerdo con la ley L.1245-2 del "Código de Salud Pública" aplicado en Francia. Por otra parte, el laboratorio de ingeniería de la piel del departamento de dermatología del Prof. Philippe Humbert, proporcionando fibroblastos humanos, tiene que indican documentos manuscritos no oposición del paciente para el uso de sus residuos quirúrgicos para la investigación médica de acuerdo con la ley L.1211-2. líneas celulares de carcinoma cervical humano (ATCC), HeLa (VPH 18, p53 de tipo salvaje) y C-33 A (VPH negativo, p53 mutado) se cultivaron en EMEM completo (Lonza), y Ca esquí células (HPV16, p53 de tipo salvaje ) se cultivaron en RPMI completo (Lonza). Ellos fueron monitoreados mensualmente y se encontró que estar libre de micoplasmas. Doce horas antes de la inducción de la apoptosis, las células de carcinoma se sembraron a 2 x 10
4 células /cm
2. Se trataron a continuación con 20 mJ cm
irradiación /2 UVB seguido de 300 nM de estaurosporina (STS) (Sigma Aldrich) durante 48 h. Las células apoptóticas fueron cosechadas después de la centrifugación del sobrenadante a 300 g durante 10 min. La detección de la apoptosis se llevó a cabo como se describe en la información suplementaria (Métodos S1). Las células apoptóticas se incubaron con HPF en una proporción de 10:01. Esta relación fue elegido debido a una mayor relación causa la muerte de fibroblastos y una menor proporción disminuye la tasa de internalización.
apoptótica internalización celular análisis
Las células apoptóticas se tiñeron con 1 mg /ml CFDA, SE (Invitrogen Ltd) diluido en DMEM con 2% de FBS durante 13 min a 37 ° C. Después del lavado, se incubaron durante 48 h con las células receptoras. Para el análisis de citometría, los fibroblastos incubados con las células apoptóticas se recogieron por tripsinización y se analizaron usando una celda de Lab Quanta ™ SC citómetro de flujo (Beckman Coulter). Las células apoptóticas fueron etiquetados con CFDA, SE y HPF se distinguían de las células apoptóticas por su diámetro tal como se evaluó por citometría de flujo. Eventos con diámetros pequeños (& lt; 13 micras) y positivo para CFDA SE, se consideraron células apoptóticas ;, eventos de gran diámetro (& gt; 13 micras) y negativo para CFDA, SE, eran HPF, y eventos con grandes diámetros y positivas para CFDA, sE, eran HPF con células apoptóticas envueltos
.
en la microscopía confocal, fibroblastos cultivados en cubreobjetos fueron fijadas con paraformaldehído al 3,7% durante 20 min a 4 ° C y se permeabilizaron usando 0,1% de Triton X100 durante 10 minutos a la habitación temperatura (RT). Las células se tiñeron con TRITC (tetrametilrodamina-isotiocianato) faloidina conjugada (Sigma Aldrich) durante 30 min a 4 ° C y con 300 nM 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol, dihidrocloruro (DAPI; Invitrogen) durante 5 min a RT. La imagen 3D (z proyección) se reconstituyó a partir de 32 cortes 2D horizontal obtenidas por microscopía confocal. Otro conjunto de células se incubaron con dos anticuerpos primarios: un anticuerpo citoqueratina ratón anti-humano monoclonal (clon AE1 /AE3, DakoCytomation) se usa a las 1:50 y un anticuerpo vimentina conejo anti-humano monoclonal (clon SP20; GeneTex) utilizada a 1 :100 dilución. Correspondiente anticuerpos secundarios (Jackson ImmunoResearch) acoplados a cianina 2 (CY ™ 2 conjugado con AffiniPure de cabra anti-IgG de ratón) o a rodamina (rodamina (TRITC) conjugado con AffiniPure de burro anti-IgG de conejo) se utilizaron a una dilución de 1:50. Los cubreobjetos fueron finalmente examinaron mediante el uso de una Olympus FluoView 1000 microscopio de fluorescencia (Olympus).
ensayo de formación de colonias, el crecimiento celular y el análisis de aneuploidía
ensayos de agar blando se realizaron en placas de 24 pocillos en semi medios -solid (DMEM, 10% de FBS, 0,35% de agar; Invitrogen) con 8 × 10
3 y 3 × 10
5 células /ml en una capa de base para medios (RPMI, 10% de FBS, 0,5% de agar ). Las células se cultivaron durante 21 días, y se observaron las colonias utilizando un microscopio Axiovert 25 invertido (Zeiss) [27]. Las colonias se recogieron por raspado de la superficie de las dos líneas celulares de fibroblastos transformados por HeLa apoptótica (FH) y Ca esquí (FC), las células se derivaron y utilizados para experimentos adicionales en agar blando y
.
fibroblastos primaria transformación también fue probado por las culturas límite de dilución en placas de 6 pocillos a 5 x 10
2 células /pocillo durante 21 días. Las colonias fueron teñidas con una solución de cristal violeta (0,1% de cristal violeta (w /v), etanol 5%) y se fotografiaron con una cámara Nikon Coolpix 4500 digital (Nikon) [46].
La proliferación de las células transformadas se controló mediante el recuento del número total de células en cada pocillo individual al día durante 10 días con un laboratorio de la célula Quanta ™ SC citómetro de flujo. La proliferación también se monitorizó utilizando la prueba de MTT con el kit de proliferación celular I (MTT) (Roche) durante 5 días consecutivos.