Extracto
liberadora de gonadotropina atención fuerte hormona-I (GnRH-I) ha atraído como una herramienta terapéutica hormonal, en particular para pacientes con cáncer de próstata dependientes de andrógenos. Sin embargo, el andrógeno-independencia del cáncer en etapas avanzadas ha estimulado a los investigadores a buscar nuevos tratamientos médicos. En informes anteriores, hemos desarrollado el antagonista de la GnRH-II Trp-1 para inhibir la proliferación y estimular la autofagia muerte de varias células de cáncer de próstata, incluyendo las células independientes de andrógenos. Hemos examinado muchas más antagonistas de GnRH-II para identificar moléculas con mayor eficiencia. Aquí, se investigó el efecto de SN09-2 sobre el crecimiento de células de cáncer de próstata PC3. SN09-2 reducido el crecimiento de células de cáncer de próstata, pero no tuvo efecto sobre las células derivadas de otros tejidos. En comparación con Trp-1, SN09-2 crecimiento de células de cáncer de próstata visible inhibida, incluso a bajas concentraciones. inhibición del crecimiento celular PC3 inducida por SN09-2 se asoció con una disminución potencial de la membrana en la mitocondria donde se acumuló el antagonista, y el aumento de la mitocondria y especies reactivas de oxígeno citosólicas. SN09-2 indujo la liberación de lactato deshidrogenasa en el medio y la anexina V-tinción en la superficie celular PC3, lo que sugiere que el antagonista estimula la muerte celular del cáncer de próstata mediante la activación de vías de señalización de apoptosis. Además, el citocromo c de la mitocondria liberación al citosol y la activación de caspasa-3 se produjo de una manera de la concentración y dependiente del tiempo. SN09-2 también inhibió el crecimiento de las células PC3 xenotransplantados en ratones desnudos. Estos resultados demuestran que SN09-2 induce directamente la disfunción mitocondrial y la consiguiente generación de ROS, lo que no solamente la inhibición del crecimiento sino también la apoptosis de células de cáncer de próstata
Visto:. Parque S, Han JM, Cheon J, Hwang JI , Seong JY (2014) apoptótica de la muerte de las células del cáncer de próstata por una hormona liberadora de gonadotropina-II antagonista. PLoS ONE 9 (6): e99723. doi: 10.1371 /journal.pone.0099723
Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Febrero, 2014; Aceptado: 18-may de 2014; Publicado: 13 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Park et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Programa de Investigación básica (2013R1A2A2A01068295) de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia, TIC, y Planificación futuro y el Plan Nacional de I & amp; D del Programa de control del cáncer, Ministerio de Salud & amp; Bienestar (0520270-1). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es la neoplasia maligna más común que ocurre en el sistema reproductivo masculino. Aunque la mayoría de los cánceres de próstata son de crecimiento lento, que puede causar dolor y dificultad para orinar, y los más agresivos son propensos a sufrir metástasis a otras partes del cuerpo [1]. A nivel mundial, el cáncer de próstata es la sexta causa principal de muerte por cáncer en los hombres [2], y en los Estados Unidos, que ocupa el segundo lugar [3]. Un tratamiento común para el cáncer de próstata avanzado es la terapia hormonal combinada con radioterapia [4]. El objetivo principal de la terapia hormonal es eliminar o reducir el andrógeno en suero, un estimulante del crecimiento potencial para el cáncer de próstata. Sin embargo, en muchos casos, la regresión inicial de los tumores es seguido por re-crecimiento independiente de los niveles de andrógenos, aumento de la agresividad, y alta actividad metastásica [5]. Por esta razón, el desarrollo de fármacos eficaces para el tratamiento del cáncer de próstata independiente de andrógenos es un tema urgente.
En el eje hipotalámico-hipofisario-gonadal, hormona liberadora de gonadotropina-I (GnRH-I) sintetizado en el hipotálamo estimula la secreción de las gonadotropinas de la hipófisis de la hormona luteinizante (LH) y la hormona folículo-estimulante (FSH), que a su vez modulan la síntesis y secreción de andrógenos, incluyendo la testosterona, de los testículos [6]. La administración crónica de un GnRH-I agonista condujo a la regulación por disminución del receptor de GnRH en la glándula pituitaria, dando como resultado una marcada reducción en los niveles circulantes de andrógenos [7]. antagonistas de GnRH-I también reducen los niveles de andrógenos en suero mediante la inactivación del receptor de GnRH [6], [8]. Estos resultados sugieren que las terapias hormonales usando agonistas y antagonistas de GnRH-I son aplicables al tratamiento de la hiperplasia benigna de la próstata y cánceres de próstata dependientes de andrógenos. Además, estudios recientes han demostrado que GnRH-I afecta directamente tanto en células de cáncer de próstata andrógeno-dependientes e independientes de andrógenos. GnRH-I agonistas del factor de crecimiento epidérmico inhibida o la proliferación de células de cáncer de próstata factor de crecimiento estimulada de insulina, e indujo la apoptosis de las células cancerosas en condiciones de privación de suero [9], [10]. Se sugirieron que estos efectos son mediados por el receptor de GnRH-I, que estimula G
i-linked la activación de la señalización dependiente de las proteínas relacionadas con la apoptosis, incluyendo c-Jun NH
quinasa 2-terminal (JNK) [11 ]
en la mayoría de los vertebrados, se identifica el otro tipo de GnRH, llamada GnRH-II, que se conserva estructuralmente en la evolución desde los peces hasta los mamíferos [12] - [14].. GnRH-II se expresa no sólo en el cerebro sino también en los tejidos reproductivos e inmunes periféricos [15]. Este patrón de expresión amplia puede conferir una variedad de funciones fisiológicas en el péptido. Similar a GnRH-I, GnRH-II es capaz de regular la reproducción en las hembras mediante la estimulación de la secreción de LH y FSH [16], [17]. A pesar de que ambos HLGn actúan sobre las células de la granulosa-luteal humanos, exhiben diferentes patrones de regulación hormonal [18], [19]. GnRH-II producida por las células T humanas estimula la expresión del receptor de la laminina y la migración celular [20]. la expresión del receptor de laminina Curiosamente, inducida por GnRH-II no está bloqueado por la GnRH-I antagonista cetrorelix, lo que implica que GnRH-II no interactúa con el receptor de GnRH-I [20]. Recientemente, nosotros y otros grupos identificado el receptor de GnRH-II en especies no mamíferas. El receptor se une a GnRH-II con mayor sensibilidad y afinidad que a la GnRH-I [21], [22]. Además, un receptor de GnRH-II-específico se clonó a partir de mono y se denomina de mamífero receptor GnRH-II [23]. El receptor es altamente selectivo para GnRH-II y parece ser diferente de la del receptor de GnRH-I en términos de la rápida internalización de la interacción ligando y vías de señalización. En humanos, genes similares al receptor de GnRH-II se localizan en los cromosomas 1 y 14. Aunque los ARNm para estos genes se expresan en muchos tejidos incluyendo el cerebro e incluso en muchas líneas celulares, que parecen ser pseudogenes no funcionales debido a un codón de parada prematuro [24], [25]. La ausencia de un G funcional del receptor acoplado a la proteína de la GnRH-II en humanos indica la posibilidad de otros tipos de socios de unión a la membrana plasmática, mientras que sus mediadores funcionales siguen siendo desconocido.
Curiosamente, la GnRH-II exhibe la capacidad para inhibir la proliferación de células de cáncer de ovario, así como células de cáncer de próstata [26], [27]. GnRH-II es probable que funcione en las células de cáncer de próstata mediante la interacción con proteínas desconocidas, basada en nuestra observación anterior de que radiomarcado GnRH-II fue capaz de unirse a diversas células humanas de cáncer de próstata [27]. Esta unión fue desplazada por GnRH sin marcar-II, pero no por GnRH-I. Este hallazgo implica que GnRH-II puede ser un fármaco potencial para el tratamiento de los cánceres de próstata, a pesar de que la unión de GnRH-II a las células de cáncer de próstata de alta afinidad parece no ser debido a la expresión de un receptor de GnRH-II convencional. Recientemente, hemos desarrollado un nuevo antagonista de la GnRH-II, llamado trptorelix-1 (TRP-1). TRP-1 es capaz de inducir la muerte de las células del cáncer de próstata andrógeno-dependientes -independiente y por mecanismos tales como la disfunción mitocondrial seguida de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la autofagia [28] subyacente.
Hemos sintetizado GnRH adicional antagonistas -II para comparar con el efecto Trp-1 y mejoran el efecto de la muerte. A continuación, presentamos otro antagonista, SN09-2 que es capaz de inhibir la proliferación e inducir la muerte en células de cáncer de próstata humano con una eficiencia superior a la de Trp-1. Por otra parte, los mecanismos funcionales de la muerte son diferentes de Trp-1, e implican la activación de las vías de apoptosis.
Materiales y Métodos
análogos de la GnRH y reactivos-II
El antagonista de GnRH-II [Ac-D-Nal (2) -D-Phe (4Cl) D Pal (3) -Ser-Phe-D-Lys-Trp-Tyr-Arg-D-Ala-NH
2], designado como SN09-2, y su isotiocianato de fluoresceína (FITC) y conjugado con forma se sintetizaron por AnyGen (Gawngju, Corea). Trp-1 [Ac-D-Nal (2) -D-Phe (4Cl) D Pal (3) -Ser-Tyr-D-Cit-Trp-Tyr-Pro-D-Ala-NH
2 ] también se sintetizó por la misma empresa [28].
el potencial de membrana mitocondrial detector 5,5 ', 6,6'-tetracloro-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine yoduro (JC- 1), MitoTracker, y 2 ', 7'-dichlorfluorescein-diacetato (DCF-DA) fueron adquiridos de Invitrogen (Palo Alto, CA, EE.UU.). medios de cultivo de células, incluyendo medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y Roswell Park Memorial Institute (RPMI) se obtuvieron a partir Welgene Inc. (Daegu, Corea). de suero fetal bovino (FBS) y penicilina /estreptomicina fueron de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). Todos los reactivos incluyendo Hoechst 33342, Anexina-V, H
2O
2, y albúmina de suero bovino se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO) a menos que se especifique lo contrario. Los anticuerpos contra la caspasa-3 escindido, intacto caspasa-3, y el citocromo C se adquirieron de Cell Signaling Technology (Danver, MA, EE.UU.). Los anticuerpos anti-beta-actina fueron de Sigma.
Cultivo de células
Todas las líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). PC3, las líneas celulares LNCaP, DU145, y DLD1 se cultivaron en RPMI 1640 que contiene 10% de SFB, inactivado por calor 100 unidades de penicilina, y 100 mg de estreptomicina /ml a 37 ° C y humidificado 5% CO
2. Las células HeLa se cultivaron en DMEM que contenía FBS al 10% en las mismas condiciones.
ensayo de gen indicador
CV-1 células fueron cultivo de una noche en placas de 24 pocillos y posteriormente transfectadas con complejo de liposoma que contiene pGL3 /SRE-luc plásmidos con la rana toro GnRHR-II (bfGnRHR-II) o mono verde GnRHR-II (gmGnRHR-II). Otras 48 h más tarde, las células tratadas con GnRH-II (1 nM para bfGnRHR-II, 10 nM gmGnRHR-II) y diferentes concentraciones de SN09-2 o Trp-1 durante 6 h se lavaron con PBS y se solubilizaron con tampón de lisis. La actividad de luciferasa de los extractos celulares se determinó utilizando el sistema de ensayo de luciferasa estándar de BioTek Instrument, Inc. (Winooski, VT). Para determinar la eficiencia de transfección, las actividades de luciferasa se normalizaron a la actividad β-gal. Todos los datos se calculan a partir de al menos tres experimentos independientes se normalizaron a los grupos no tratados.
viabilidad de las células de ensayo
Las células fueron sembradas en placas de 12 pocillos por triplicado (1 × 10
4 células /bien). Después de 24 h, las células se trataron con las concentraciones indicadas de los antagonistas de GnRH-II solubilizados en 0,1% de DMSO cada 24 h para el número indicado de días. Luego, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se disociaron con tripsina /EDTA, y se resuspendieron en 500 l medio de crecimiento completo. El azul tripán (0,4%) las células de colorantes, con exclusión fueron contados bajo un microscopio invertido (Olympus, Tokio, Japón).
liberación de lactato deshidrogenasa ensayo
ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH) se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania). En resumen, las células PC3 se sembraron en placas de 12 pocillos a 2 × 10
4 células /pocillo. Al día siguiente, las células se trataron con diferentes concentraciones de SN09-2 en 5% de FBS que contiene RPMI 1640 durante 3 días. Los medios de cultivo se transfirieron a tubos Eppendorf y se centrifugaron durante 1 min a 5000 rpm. Cien microlitros de cada sobrenadante se transfirió a una placa de 96 pocillos ópticamente transparente. Cien microlitros de mezcla de reacción recién preparada se añadieron a cada pocillo y se incubaron durante 30 min a 25 ° C. La absorbancia de las muestras se midió utilizando el filtro de longitud de onda de 490 nm del lector ELISA.
Anexina V ensayo de tinción
La apoptosis de las células PC3 se evaluó utilizando un kit de detección de apoptosis (Koma Biotech, Seúl, Corea). Después de la exposición a SN09-2 durante los tiempos indicados o a diferentes concentraciones, se recogieron las células PC3 y se lavaron con PBS frío y se re-suspendieron en tampón que contenía isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con unión de la proteína V anexina y yoduro de propidio. Anexina V vinculante y tinción PI se determinaron mediante análisis de citometría de flujo (Becton Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.). Las células apoptóticas se definieron como PI-negativas y anexina V-positivo.
Después del tratamiento con SN09-2, células PC3 en cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 15 min, se lavaron tres veces con PBS, y se incubaron con Cy3 conjugados de anexina V. Las células se lavaron con PBS y se incubaron con poco Heochst33342 (10 mg /ml). Las células teñidas se visualizaron bajo un microscopio confocal LSM510 (Carl Zeiss, Jena, Alemania).
Western blot
Las células (5 × 10
4) se sembraron en placas de 100 mm . El día siguiente, las células se trataron con las concentraciones indicadas de SN09-2 para diferentes tiempos, se recogieron y se incubaron con tampón que contiene HEPES 10 mM (pH7.9), mM KCl 10, DTT 0,5 mM, y cóctel inhibidor de la proteasa (Roche) durante 30 min en hielo. Las células se rompieron con un homogeneizador Dounce de 20 golpes y se centrifuga a 5.900 ×
g
durante 10 minutos para recoger la fracción citosólica. Los sedimentos resultantes se resuspendieron en tampón frío, brevemente sonicó tres veces, y se centrifugó a 5.900 ×
g
durante 10 min para obtener proteínas mitocondriales crudo. Las proteínas de cada fracción (20 g) se aplicaron a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (12% gel) y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA). Las membranas se bloquearon con 3% de albúmina de suero bovino y se incubaron con los anticuerpos apropiados. Después de lavar con solución salina tamponada con Tris que contenía 0,05% de Tween 20, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios de rábano picante y conjugado con peroxidasa y las señales se detectaron utilizando una solución de quimioluminiscencia (GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, Reino Unido).
localización subcelular de SN09-2
Dos días después de la siembra en poli-lisina-D cubierta se desliza en placas de 12 pocillos, las células PC3 se trataron con 66 nM MitoTracker para 30 min y luego con FITC 10 mM SN09-2 durante 10 minutos a 37 ° C. Después de lavar con PBS, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 10 min. Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342. Las señales de fluorescencia se detectaron en el microscopio confocal.
Medición de potencial de membrana mitocondrial potencial
membrana mitocondrial se midió usando JC-1. En las células sanas, JC-1 forma agregados dentro de las mitocondrias, la generación de fluorescencia roja. Sin embargo, durante la despolarización mitocondrial, JC-1 monómeros se difunden por toda la célula, produciendo fluorescencia verde. PC3 células fueron sembradas en la cubierta recubierta con poli-D-lisina se desliza en placas de 12 pocillos. Después del tratamiento con 10 mM SN09-2 durante 3 días, las células se incubaron con PBS que contiene JC-1 (2,5 mg /ml) durante 20 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron, se fijaron con 4% de paraformaldehído, y se observaron bajo el microscopio confocal. Después de la incubación con JC-1, las células PC3 se separaron de plato y aplicados para el análisis de células activadas por fluorescencia (FACS).
Cuentas de conjugación y pull-down ensayo
Perlas conjugación del SN09- 2 se realizó como se describe en el trabajo previo [28]. En resumen, N-hydroxysunninimide-activan perlas de sefarosa se incubaron con SN09-2 en tampón de acoplamiento durante la noche a 4 ° C, y después se lavaron con un tampón que contiene 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5) y un tampón que contiene 0,1 M de acetato (pH 4,5) y 0,5 M NaCl. fracción de membrana de células PC3 se aisló mediante homogenización y centrifugación. Los gránulos resultantes se disolvieron en tampón de lisis que contiene 1% de Triton X-100 y se centrifugó a 20.000 ×
g
durante 15 min a 4 ° C. Los sobrenadantes se incubaron con SN09-2 conjugado de sefarosa y se lavaron con tampón de lisis. Los precipitados se incubaron con 50 mM SN09-2 y los sobrenadantes se aplicaron por SDS-PAGE y transferencia Western con anticuerpos anti-GPR75.
generación intracelular de ROS
especies reactivas de oxígeno (ROS) eran medido usando el DCF-DA. células PC3 (1 × 10
5) se sembraron en placas de 60 mm, cultivadas en 5% de FBS RPMI, y se trató con SN09-2 para 3 h. Después de la incubación con 5 M DCF-DA durante 30 min a 37 ° C en la oscuridad, las células se lavaron, se resuspendieron en PBS, y después se aplican al análisis FACS.
inmunocitoquímica
PC3 Las células (4 × 10
4) se sembraron en cubreobjetos en placas de 12 pocillos y se trata con 10 mM SN09-2 durante 12 h. Las células se fijaron en 4% de paraformaldehído durante 10 min, se permeabilizaron con 0,2% Triton-X en PBS, se lavaron y se bloquearon con BSA 3% en PBS durante 30 min. anticuerpos de conejo policlonales contra la caspasa-3 escindido (1:200) y anticuerpos anti-beta-actina de ratón monoclonal (1:1000) se aplicaron a las células. Activa la caspasa-3 y β-actina se visualizaron por incubación con ambos Alexa anti-ratón conjugado con 594 y Alexa 488-conjugado anti-conejo secundaria de anticuerpos durante 1 h. A continuación, las células se tiñeron con Hoechst 33342 (1 mg /ml) durante 5 min, se montaron en portaobjetos, y se observaron bajo el microscopio confocal.
En vivo
crecimiento de células de cáncer de próstata
seis semanas de edad, los ratones desnudos atímicos macho (BALB /c-nu) se obtuvieron de Harlan (Houston, TX). Los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos específicos en un sistema de jaulas ventiladas individualmente. Todos los procedimientos experimentales se realizaron después de recibir la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del Instituto de Investigación Clínica en el Hospital de la Universidad Nacional de Seúl. células PC3 (6 × 10
6) se inyectaron en el flanco derecho de los ratones. Diez días después de la inyección de células, los tumores con volúmenes de alrededor de 20-25 mm
3 desarrollado en la mayoría de los ratones; volúmenes de los tumores se midieron cada día. Los volúmenes tumorales se determinaron mediante dos dimensiones perpendiculares [longitud (
L
) y anchura (
W
)] y la altura (
H
), medido usando calibradores Vernier (la fórmula es
V
= (π /6) x (
W
×
L
×
H
). A partir de este momento, SN09-2 ( forma de ácido acético) disuelto en 5% de N, N-dimetilacetamida (DMA), 10% de glicerol, y 85% de agua destilada que es solvente biocompatible se inyectaron por vía subcutánea en los ratones durante 25 días consecutivos. se midió el tamaño del tumor en cada ratón cada los días. de seis a siete ratones se utilizaron para cada grupo experimental.
El análisis estadístico
Los datos fueron analizados utilizando el software Prism4 (GraphPad). medias de los grupos se compararon mediante Estudiante de
t
prueba o ANOVA de un factor seguido de comparaciones múltiples de Bonferroni Un
P-
valor & lt;.. 0.05 se aceptó como significativo
resultados
SN09-2 induce células del cáncer de próstata la muerte específico de
Hemos informado anteriormente de que el nuevo antagonista de la GnRH-II Trp-1 inducida por la muerte de las células del cáncer de próstata [28]. Para identificar la molécula más eficaz, se sintetizó 65 análogos a base de Trp-1 estructura y exhibió sus actividades de muerte en PC3 y LNCaP sin ningún tipo de actividad tóxica en fibroblastos de pulmón MRC-5. Finalmente, SN09-2 fue elegido como potencialmente eficaz antagonista de GnRH-II para inhibir el crecimiento de células de cáncer de próstata. En reportero anterior, hemos identificado Trp-1 tiene actividad antagonista sobre GnRHR-II [28]. Nuestro ensayo de gen reportero presente revela que SN09-2 también tiene una actividad antagonista potente sobre GnRHR-II incluso en comparación con Trp-1 (Fig. 1). SN09-2 antagoniza eficazmente el efecto de GnRH-II de la rana toro GnRHR-II (IC
50 = 0,01 M) y el mono verde GnRHR-II (IC
50 = 1,9 M). Sin embargo, Trp-1 inhibe la activación de la única rana toro GnRHR-II con alta potencia (IC
50 = 0,25 M). Las secuencias de GnRH-II, Trp-1, y SN09-2 fueron descritos en la Fig. 2A. células PC3 (células de cáncer de próstata independientes de andrógenos) se trataron con 10 mM SN09-2 en medios de cultivo que contienen diferentes concentraciones de FBS. En concentraciones bajas de suero (menos del 2%) SN09-2 indujo inhibición del crecimiento más de 95% de las células PC3 a 4 días. E incluso en las concentraciones séricas más altas, SN09-2 dramáticamente inhibió el crecimiento celular en más de un 85%, aunque la inhibición fue ligeramente afectado por la concentración en suero (Fig. 2B). El tratamiento con SN09-2 durante 4 días indujo inhibición del crecimiento del 91% y 88% de las células PC3 en condiciones de suero 5% y 10%, respectivamente. Este resultado indica que SN09-2 regula negativamente el crecimiento de células de cáncer de próstata de una manera suero-independiente. A continuación, varias células cancerosas fueron tratados con 10 mM SN09-2 en medios que contienen suero de 5% para determinar el efecto específico de las células del cáncer de próstata del antagonista de GnRH-II. Tres días después del tratamiento con SN09-2, el crecimiento de PC3 y las células LNCaP se downregulated drásticamente, y la de las células DU145 también se inhibió por ≈50%, lo que sugiere que la sensibilidad de las células de cáncer de próstata a SN09-2 pueden ser varias. Sin embargo, el crecimiento de las células de otros tejidos tales como HeLa (cáncer cervical) y DLD1 (cáncer de colon) no fue afectada por SN09-2 (Fig. 2C). Aunque más células deben ser probados, estos resultados pueden indicar SN09-2 tiene efecto inhibidor del crecimiento de células específicas de cáncer de próstata
.
De cualquier bfGnRHR-II o gmGnRHR-II se transfectaron con el reportero SRE-luc en células CV-1 . Las células fueron tratadas con los antagonistas de diferente concentración en presencia de GnRH-II (1 nM para bfGnRHR-II, 10 nM gmGnRHR-II).
(A) secuencias moleculares de GnRH-II, células PC3 Trp-1, y SN09-2 (B) se incubaron en medio RPMI que contenía varias concentraciones de FBS y se expusieron a 10 mM SN09-2 durante 4 días. El número de células viables se contó bajo un microscopio de luz. (C) PC3, DU145 células, LNCaP, HeLa, y DLD1 se incubaron con medio de FBS 5% que contiene SN09-2 mM 10 o DMSO durante 3 días. (D) células PC3 se trataron con diferentes concentraciones de Trp-1 o SN09-2 durante 3 días, y luego se contaron las células viables bajo el microscopio de luz. El número de células de cada grupo se comparó con el grupo tratado con DMSO. CTL: tratado con DMSO. (E) células PC3 se trataron con varias concentraciones de SN09-2 durante 3 días. El uso de sobrenadantes de cultivo de cada grupo, se determinó la actividad de LDH como se describe en Materiales y Métodos. Los datos son medias ± S. E. *,
p & lt; 0,05
; **,
p & lt;.
0,01, frente al control
En un informe anterior, hemos demostrado que Trp-1 inhibe la proliferación de células PC3 [28]. Para investigar la eficacia de la inhibición del crecimiento de los antagonistas de la GnRH-II, las añadimos a las células PC3 cultivadas en condiciones de suero al 5% durante 3 días. En comparación con los grupos de control, ambos antagonistas atenúan significativamente el crecimiento celular de una manera dependiente de la dosis. Además, en todos los grupos tratados con diferentes concentraciones, el crecimiento celular fue más potentemente inhibida por SN09-2 en vez de Trp-1, lo que sugiere que SN09-2 es probable que sea mejor para el desarrollo molécula como un inhibidor de cáncer de próstata (Fig. 2D). El efecto inhibidor sobre el crecimiento celular se puede correlacionar con la muerte celular. Para confirmar la idea, que mide la actividad de la LDH a partir de medios de cultivo de células tratadas con diferentes dosis de SN09-2. Como se muestra en la Fig. 1E, la actividad se incrementó en todas las células tratadas con SN09-2. Este resultado sugiere que SN09-2 es capaz de estimular las células de cáncer de próstata a la muerte incluso en pequeñas cantidades. A pesar de que una alta dosis de SN09-2 aumentó ligeramente la actividad de LDH, la actividad no se correlacionó con la dosis del agonista, lo que implica que este ensayo parece ser demasiado sensible para distinguir la actividad dependiente de la dosis sobre la muerte celular.
acumulación mitocondrial de SN09-2
En informes anteriores, nosotros y otros grupos observó que las células cancerosas radiomarcados GnRH-II unido a la próstata a través de la interacción con una proteína de aproximadamente 80 kDa cuya identidad fue designado como proteína regulada por glucosa 75 (GRP75) basado en la cromatografía de ionización por electrospray-espectrometría de masas de líquido [11], [28], [29]. Curiosamente, nuestra desplegable ensayo también mostró que SN09-2 interactuaba directamente con GRP75 (Fig. 3A). Desde GRP75 se encuentra predominantemente en la mitocondria, el destino final de SN09-2 no puede ser la superficie de la célula. Para explorar la localización subcelular del antagonista, etiquetamos SN09-2 con FITC y añadió a las células PC3 a una concentración 1 M durante 10 min. La señal de FITC-SN09-2 no fue visto en la membrana plasmática, pero alrededor del núcleo. Cuando se trata con colorante MitoTracker, la señal de FITC se superpone a la del colorante, lo que indica que FITC-SN09-2 puede acumular en las mitocondrias (Fig. 3B). FITC-SN09-2 era apenas detectable en otras líneas celulares tales como HeLa, MCF7, y DLD1 (datos no mostrados). acumulación mitocondrial de este conjugado es bastante similar a la de conjugado con FITC GnRH-II y Trp-1, que se atenúa por no marcado GnRH-II. Este resultado implica que una vía de endocitosis desconocido para GnRH-II y sus antagonistas pueden existir en células de cáncer de próstata.
Las células se incubaron con FITC-conjugado SN09-2 y MitoTracker. Después del lavado, las células se marcaron brevemente con Hoechst33342 (para la tinción de núcleo). Las imágenes fueron tomadas con un microscopio confocal. Rojo: MitoTracker, Verde: FITC SN09-2, Azul: Hoechst33342
daño mitocondrial y la inducción de ROS en células
La disfunción mitocondrial tratado con SN09-2 se piensa que es directamente relacionada a la muerte celular [30]. la orientación mitocondrial de SN09-2 puede estar relacionado con el efecto de la muerte en las células de cáncer de próstata a través de la disfunción del orgánulo. Se investigó el cambio de potencial eléctrico en la membrana mitocondrial, lo que indica la función mitocondrial. Como se muestra en la Fig. 4A, el tratamiento de 3 días de células PC3 con SN09-2 disminuyó la intensidad de fluorescencia de color rojo alrededor del núcleo, pero aumentó la fluorescencia amarilla y verde en más de un 80% en el citoplasma, lo que indica una disminución en el potencial de membrana mitocondrial (Fig. 4B). En muchos casos, la disfunción mitocondrial es un requisito previo para la generación de ROS citoplasmática. Cuando las células PC3 se trataron con 5 mM SN09-2, los niveles citoplasmáticos de ROS, medida por la fluorescencia de la FluoroProbe DCF-DA, se aumentaron (Fig. 4C). Aunque la media geométrica de la fluorescencia era mucho menor que la observada en H
2O células tratadas con 2
, el valor puede ser suficiente para indicar la alteración de la función mitocondrial (Fig. 4D). Además, SN09-2 aumento de los niveles citoplásmicos de ROS en una manera dependiente de la dosis (Fig. 4E).
(A) Después del tratamiento con 10 mM SN09-2 durante 3 días, las células PC3 en cubreobjetos se incubaron con JC-1, se fijaron con 4% de paraformaldehído, se tiñe brevemente con Hoechst33342, y se observó bajo el microscopio confocal. células PC3 tratadas con SN09-2 (B) se separaron de la placa y se aplicaron a análisis FACS para examinar el cambio de color de la fluorescencia. las células (C) PC3 tratadas con SN09-2 durante 3 h se incubaron con DCF-DA, y se aplicaron a análisis FACS (D) Control positivo de ROS intracelulares. células PC3 se trataron con H
2O
2 de 5 min, marcado con DCF-DA, y luego se aplica a análisis de FACS. (E) medias geométricas de las señales de fluorescencia en células PC3 tratadas con diferentes concentraciones de SN09-2 se muestran en forma de gráficos. Los datos son medias ± S. E. **,
p & lt;.
0,01, frente al control
SN09-2 induce la muerte celular a través de la activación de vías de señalización apoptótica
La disfunción mitocondrial y la consiguiente ROS generación puede preceder a la apoptosis, un tipo de muerte celular. Para determinar los mecanismos de muerte celular subyacente estimulada por SN09-2, teñidas células PC3 con Cy3 conjugado con Anexina V, que se une específicamente a la membrana fosfatidilserina. células PC3 tratadas con 10 mM SN09-2 durante 24 h fueron ampliamente teñidas con Cy3-Anexina V, lo que sugiere que las células se someten a cambio de apoptosis (Fig. 5A). Cuando se aplicaron las células para análisis FACS después de la tinción con FITC conjugado con Anexina V y yoduro de propidio, la mayoría de las células fueron FITC-positivo, pero PI-negativo, lo que implica que SN09-2 estimula la muerte apoptótica, pero no la muerte necrótica. Anexina V tinción se mejoró dramáticamente por 9 h después del tratamiento 10 M SN09-2 y sostenida hasta 24 h (Fig. 5B). En concentraciones bajas de SN09-2, pocas células fueron FITC-positivo, mientras que la mayoría de las células tratadas con altas concentraciones (más de 5 micras) eran FITC-positivos, lo que sugiere que SN09-2 es un inductor de apoptosis eficiente para las células de cáncer de próstata (Fig. 5C). Junto con el resultado de la proliferación, la tinción rara de las células tratadas con menos de 0,5 M SN09-2 demuestra que una dosis baja de antagonista inhibe el crecimiento celular en lugar de estimular la muerte celular.
células PC3 (A) tratados con 10 mM SN09-2 sobre cubreobjetos fueron incubadas con Cy3 conjugado con anexina V, y se tiñeron brevemente con Hoechst33342. Las imágenes de fluorescencia se tomaron con un microscopio de fluorescencia. BF: morfología de las células bajo microscopio de luz (B, C) las células anexina V-positivas se incrementó en la dosis y de tiempo que dependen de las células PC3 Manner (B) tratados con SN09-2 se recogieron a diferentes puntos de tiempo, se incubaron con FITC-conjugado anexina V, y se aplica a análisis FACS las células PC3 (C) se trataron con diferentes concentraciones de SN09-2 durante 12 h antes de la tinción con anexina V. Los datos son medias ± S. E. *,
p & lt; 0,05
; **,
p & lt;.
0,01, frente al control
La liberación de citocromo c de la mitocondria es un evento temprano en la muerte celular dependiente de caspasas. Tras la liberación de citocromo c en el citoplasma, se une la proteasa apoptótica factor activador-1 y procaspasa-9 para formar el apoptosoma, que posteriormente activa la caspasa-3 y -7 responsable de la destrucción de las células [31]. El análisis de transferencia Western reveló que SN09-2 estimula la liberación de citocromo c en el citoplasma de una manera tiempo y dependiente de la dosis. El más citocromo c fue liberado de las mitocondrias en células tratadas con más de 5 M SN09-2 (Fig. 6A, C), y la saturación citosólica de la proteína se realizó por 24 h después del tratamiento (Fig. 6B, D).
(a-D) transferencia de Western de citocromo c en el citosólica y mitocondrial fracciones (a, C) las células PC3 se trataron con diferentes concentraciones de SN09-2 durante 24 h y se fracciona en citosol y mitocondrias. 20 g de lisados de cada fracción se utilizaron para SDS-PAGE y transferencia Western con anticuerpos anti-citocromo c. (B, D) Las células tratadas con 10 mM SN09-2 fueron cosechadas en diferentes puntos de tiempo, y después se fraccionó. (C, D) La intensidad de la señal de cada mancha se midió y se muestra en forma de gráficos células PC3 (E) tratados con 10 mM SN09-2 se recogieron a diferentes puntos de tiempo, y se utiliza para transferencia de western con anti-caspasa-3 o un escindió