Extracto
La metástasis y la resistencia a los medicamentos son los principales obstáculos para el tratamiento de la no cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Para explorar nuevas opciones terapéuticas, que encapsulados con éxito microARN-34a (miR-34a), un supresor de tumores endógena potente en NSCLC en S6 dendrímero aptámero conjugado para formar nanopartículas de suministro de genes de cáncer-específica del pulmón (PAM-AP /PN PMIR-34a) . NPs PAM-Ap /PMIR-34a tenían un diámetro de 100 a 200 nm y el potencial Zeta de ~ 30 mV en relación a /p N aplicado. La conjugación de aptámeros mejoró significativamente la captación celular, así como la eficacia de transfección génica de PAM-AP PN /PMIR-34a en células cultivadas de NSCLC. Hemos demostrado que la PAM-Ap /PMIR-34a PN mejorado la regulación de determinados genes, Bcl-2 y p53
in vitro
. Además, revelamos PAM-AP NPs /PMIR-34a inhibió significativamente el crecimiento celular, la migración, la invasión y la apoptosis inducida de las células de cáncer de pulmón en comparación con NPs no dirigidos. El método proporciona una nueva estrategia terapéutica para el tratamiento experimental de NSCLC
Visto:. Wang H, Zhao X, Guo C, D Ren, Zhao Y, Xiao W, et al. (2015) aptámeros bioconjugados-dendrímero para administración dirigida de miR-34a plásmido que expresa y efectos antitumorales de células no pequeñas células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 10 (9): e0139136. doi: 10.1371 /journal.pone.0139136
Editor: Valentín Ceña, Universidad de Castilla-La Mancha, ESPAÑA
Recibido: 5 de Mayo, 2015; Aceptado: September 8, 2015; Publicado: 25 Septiembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Esta investigación fue apoyada por la Ciencia y Tecnología de Proyectos plan de Desarrollo de la provincia de Shandong (2013WS0273). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. Aproximadamente el 85% de todos los casos de cáncer de pulmón clínicos son el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) [2, 3]. A pesar de numerosos avances en el tratamiento quirúrgico, quimioterapia y agentes moleculares dirigidas para CPNM, la metástasis y la resistencia a múltiples fármacos siguen siendo las principales causas de los fracasos en el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón [4, 5]. Por lo tanto, es altamente deseable desarrollar nuevos enfoques terapéuticos más allá de tratamiento convencional para el NSCLC. Los microARN (miARN) han demostrado jugar un papel importante en el progreso de cánceres humanos y puede ser dianas eficaces para la terapia del cáncer [6]. MiRNAs son pequeños RNAs de ~ 22 nucleótidos de longitud que son reguladores críticos de la expresión de genes [7]. ARNm diana miRNAs madura en sitios complementarios, lo que conduce a la degradación del ARNm y la supresión de traducción [8, 9]. Entre los más de 700 miRNAs humanos identificados, miR-34a es una diana transcripcional de p53 supresor de tumores [10], y regulado por la expresión de miR-34a se correlaciona con una alta probabilidad de recaída en pacientes con NSCLC [11]. Por otra parte, la sobreexpresión de miR-34a inhibe el crecimiento y la metástasis de NSCLC mediante la regulación de varios supresores de tumores u oncogenes, tales como p53, BCL-2, c-Met y CDK4 [12]. En informes anteriores revelaron que la sobreexpresión de miR-34a podría prevenir la progresión y la metástasis del NSCLC, así como aumentar la sensibilidad a la quimioterapia.
El desarrollo de productos terapéuticos basados en miARN ha convertido en una estrategia prometedora alternativa al tratamiento convencional, incluyendo la quimioterapia y la radioterapia para el tratamiento de NSCLC. Sin embargo, la aplicación clínica de miRNAs encuentra muchos desafíos biológicos, tales como aclaramiento de la sangre rápida, mala estabilidad en el suero e inadecuada absorción celular [13]. sistemas de entrega de nano-tumorales de orientación se han desarrollado para superar estos problemas [14, 15]. nanocomplexes Gene-cargado se considera que son un mejor ajuste para la terapia del cáncer debido a su acumulación pasiva en los tumores sólidos por sus propiedades de retención (EPR) permeabilidad mejorada y en los tumores de crecimiento rápido [16]. La funcionalización de los polímeros con ligandos de metas de células específicas puede mejorar su acumulación tumoral más de efecto EPR [17], lo que mejora la eficacia de transfección y la biocompatibilidad de estos genes nanocomplexes-cargado.
poliamidoamina (PAMAM) son catiónicos con dendrítica estructura. A través de interacciones electrostáticas, PAMAM y cargados negativamente de forma pDNA nanocomplexes que son ampliamente utilizados como vectores de genes no virales para transfectar ADN o ARN exógeno en las células [18]. Es importante destacar que, el peso molécula y la densidad de carga de PAMAM pueden ser manipulados fácilmente para tener la seguridad superior. Hasta la fecha, se han identificado una amplia variedad de marcadores biológicos potenciales para el cáncer de pulmón, tales como EGFR, TP53, CA-125 y CEA, pero la ausencia de especificidad y sensibilidad sigue siendo un problema en la práctica de la administración dirigida de fármacos [19].
Los aptámeros son cortos, simples oligonucleótidos de cadena (ADN o ARN) seleccionado del proceso SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial). En comparación con los anticuerpos, las ventajas de los aptámeros son distintos, tales como la síntesis conveniente y modificación, de alta afinidad y especificidad para las moléculas diana, baja inmunogenicidad, menos toxicidad, una mayor estabilidad y una rápida penetración del tejido [20, 21]. Por lo tanto, nanocomplexes aptámero conjugado pueden entregar oligonucleótidos de una manera específica del tipo de célula con la eficacia de transfección mejorada y /o efectos secundarios reducidos para las células normales [22]. Varios aptámeros específicos de células se han utilizado para la entrega de genes, pero un Nanocomplejo aptámero conjugado usado en el tratamiento de NSCLC es limitado. En nuestro trabajo, hemos desarrollado conexión PAMAM-PEG-aptámero (PAM-AP) utilizando S6, un aptámero seleccionado contra las células cancerosas de pulmón A549 por células-SELEX [23] y adoptado para funcionalizar G5.0 PAMAM, a continuación, mezclamos el PAM ap con PMIR-34a para la construcción de (PN PAM-ap /PMIR-34a) nanopartículas PAM-ap /PMIR-34a para entregar de pDNA a las células de cáncer de pulmón. A continuación se evaluó la eficacia y el efecto antitumoral de transfección génica de PAM-AP PN /PMIR-34a en las células A549. Nuestros datos muestran que el sistema bioconjugados en dendrímeros aptámero es una forma eficiente para entregar el miR-34a expresando plásmido a las células de cáncer de pulmón de células no pequeñas.
Materiales y Métodos
Materiales
poliamidoamina (PAMAM, núcleo de etileno diamina, G5.0) y 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). succinimidil éster de polietilenglicol maleimida (Mal-PEG-NHS, Mw 2.000) se adquirió de Bio-matriz Inc. (Jiaxing, China). GelRed
TM ADN de manchas de gel fue adquirido de Biotium (CA, EE.UU.). suero bovino fetal (FBS), medio de cultivo RPMI-1640, solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS), tripsina, penicilina-estreptomicina y YOYO-1 yoduro se adquirieron de Invitrogen /Life Technologies (Carlsbad, CA). Anexina V-FITC y el kit de tinción de yoduro de propidio (PI) fueron de BD Biosciences (San Jose, CA). Kit Recuento celular 8 (CCK-8), tampón de lisis RIPA proteína y el kit de ensayo de proteínas BCA se adquirieron de Beyotime (Nanjing, China). de células A549 aptámero de unión (S6, secuencia: GTGGCCAGTCACTCAATTGGGTGTAGGGGTGGGGATTGTGGGTTG) con el grupo sulfhidrilo en el extremo 5 'se sintetizó por RiboBio Co. Ltd. (Guangzhou, China). El miR-34a y aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) co-expresión de plásmido (PMIR-34a, sentido: 5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3 ', antisentido: 5'-AACCAGCUAAGACACUGCCAUU-3') y el plásmido de control negativo (PMIR-NC, sentido: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ', antisentido: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3') se obtuvieron de SunBio Co.Ltd (Shanghai, china). línea celular de NSCLC humano A549 se obtuvo del Instituto de Bioquímica y Biología Celular, SIBS, CAS (República Popular China). Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% FBS, penicilina (100 UI /ml) y estreptomicina (100 mg /ml) a 37 ° C incubadora con 5% de CO
2.
Síntesis de aptámero dendrímero conjugado (PAM-Ap)
Para sintetizar el aptámero conjugado de dendrímero, PAMAM 100 mg (solución en metanol) se secó en atmósfera de nitrógeno y se disolvió en 5 ml de PBS (pH 7,2). A continuación, se añadió 20mg Mal-PEG-NHS (Mw 2000) a la solución PAMAM y se agitó durante 6 h, y después la mezcla se dializó en agua destilada usando membrana de diálisis (MWCO 3500 Da) durante 24 h para eliminar sin reaccionar Mal-PEG NHS, seguido por liofilización para obtener PAMAM pegilado (PAM-PEG-Mal). Para la conjugación del aptámero S6, 25 mg PAM-PEG-Mal se disolvió en 2 ml de PBS (pH 7,2). A continuación, 50 nM S6 aptámero se mezclaron con la solución de 6 h, el producto después se dializó frente a agua destilada utilizando la membrana de diálisis (MWCO 7500 Da) durante 12 h y se liofilizó para obtener PAMAM-PEG-Ap (PAM-Ap).
Formulación y caracterización de pDNA-cargado nanopartículas
Para la unión evaluación capacidad pDNA, 1 g de pDNA se mezcló con PAM-Ap en relación N /P de 0,5 a 16 en PBS (pH 7,2 ). Cada muestra se agitó con vórtex durante 20 s, se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente para formar PAM-AP /pDNA NPs. A continuación, las muestras se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1,5% que contenía GelRed
TM durante 20 min (100 V), y las bandas de pADN se visualizaron bajo luz UV. Para el tamaño de las partículas y la medición del potencial Zeta, PAM-AP /pDNA NPs se prepararon a diferente relación a /p N en agua destilada y se determinó por un Zetasizer Nano ZS (Malvern Inc., Westborough, MA). Para la prueba de estabilidad en suero, los desnudos PMIR-34a, PAM /PMIR-34a y complejos /PMIR-34a PAM-AP (N /P = 40) se incubaron en 50% de FBS a 30 mg /ml. Las mezclas se incubaron a 37 ° C durante diferentes intervalos de tiempo. Después de eso, 20μL de las mezclas se trataron con 10 l solución de heparina (1.000 U /ml) para liberar el pDNA cargado después de la electroforesis en un gel de agarosa al 1,0% w /v que contiene GelRed
TM para 15 min. El pADN no degradado se visualizaron bajo luz UV.
La citometría de flujo para celular
ensayo de captación
Las células A549 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 3 x 10
5 células por pocillo y se cultivaron durante 24 h. PAM-Ap /pDNA o PAM /pDNA NPs se prepararon con pDNA YOYO-1 marcado (1 molécula de YOYO-1 yoduro a 20 pares de bases de nucleótidos) a una relación N /P de 40. Antes de la transfección, se retiró el medio de cultivo. A continuación, 2 ml de medio RPMI 1640 libre de suero que contiene PAM-AP /pDNA o PAM /pDNA NPs se añadieron a la cada pocillo (pDNA 4 mg /pocillo). Después de 4 h de incubación, se retiró el medio de transfección. Se lavaron las células, se trataron con tripsina y se resuspendieron en DPBS y las muestras se determinaron inmediatamente por citometría de flujo (BD, San José, CA). Para el estudio de la competencia de S6 aptamer mediada captación celular de PAM-Ap, las células A549 se sembraron en placas de 6 pocillos, 30 min antes del tratamiento PAM-Ap /pDNA NPs, se añadió un exceso de 50 veces de S6 aptámero al medio de cultivo y se incubaron durante 4 h antes analizaron las células como anteriormente.
microscopía confocal de barrido láser (CLSM) estudio
células A549 se sembraron en cubreobjetos de vidrio en placas de 24 pocillos a una densidad de 5 × 10
4 por pocillo y se cultivaron durante 24 h. El YOYO-1 marcado con PAM-Ap /pDNA o PAM /pDNA NPs se prepararon con el mismo método que se ha descrito anteriormente. Las células fueron transfectadas con PAM-AP /pDNA o PAM /pDNA NPs a una concentración de 1 mg pDNA /pocillo. Después de 4 h de incubación, las células se lavaron y se fijaron con formaldehído al 4%, se tiñeron con DAPI. Los polímeros extracelulares /nanopartículas pDNA se lavaron con DPBS que contenía heparina. Las imágenes fueron tomadas con láser confocal de barrido microscopio (Olympus, Japón).
La eficacia de transfección de evaluación
Para evaluar la eficiencia de la transfección, 1,5 × 10
5 de las células A549 se sembraron en 12 placas -bien y se cultivaron durante 24 h. Las células A549 se transfectaron con PAM-AP /PMIR-34a o PAM /NPs PMIR-34a (2 g PMIR-34a por pocillo) a una relación N /P de 10, 20 y 40 de 4 h. Después de la transfección, el medio se reemplazó y las células se cultivaron durante otras 48 h. El EGFP células que expresan fueron imágenes por microscopio de fluorescencia (Leica, Alemania) y se cuantificó por citometría de flujo.
aislamiento de ARN y el análisis de qPCR
Los niveles de ARNm de Bcl-2 y p53 fueron determinados por cuantitativa PCR en tiempo real (QRT-PCR). Las células A549 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 3 x 10
5 por pocillo y se cultivaron durante 24 h. Se llevó a cabo la transfección de PAM-AP /PMIR-34a o PAM /PN PMIR-34a como se ha descrito anteriormente. Después de 48 h de incubación, el medio de cultivo se retiró y las células se lavaron con PBS. El ARN total fue aislado utilizando RNeasy mini-kits (Qiagen, Germantown, MD) según el protocolo del fabricante. los niveles de mRNA p53 BCL-2 y se cuantificaron utilizando iScript
TM de un solo paso kit de RT-PCR con SYBR verde (Bio-Rad, CA) usando iQ
TM5 RT-PCR sistema de detección. los niveles de expresión génica relativa se calcularon siguiendo un método comparativo Ct contra el nivel de expresión de control de β-actina endógena. Los datos se normalizaron a BCL-2 o la expresión de p53 nivel de las células no tratadas. Las secuencias de los cebadores específicos de genes para qPCR son los siguientes: β-actina (sentido) 5 'GGATCCGACTTCGAGCAAGAGATGGCCAC-3' (antisentido) 5'-CAATGCCAGGGTACATGGTGGTG-3 '; BCL-2 (sentido) 5 'TTGGATCAGGGAGTTGGAAG-3' (antisentido) 5 'TGTCCCTACCAACCAGAAGG-3'; p53 (sentido) 5 'ACCAGGGCAGCTACGGTTTC-3' (antisentido) 5 'CCTGGGCATCCTTGAGTTCC-3'.
Western blot análisis
células A549 fueron cultivadas y tratadas como descrito anteriormente. La proteína total se extrajo mediante tampón de lisis RIPA y se cuantificó mediante el kit de ensayo de proteína BCA. Se cargaron 40 mg de proteína y se separaron en 10% Ready Gel Tris-HCl Gel (Bio-Rad, CA) y después se transfirieron a un fluoruro de polivinilideno (PVDF) membrana (Millipore, Bedford, MA). La membrana de PVDF se bloqueó con leche desnatada al 5% durante 1 h, y se sondeó con anticuerpos primarios a temperatura ambiente durante 1 h. Posteriormente, la membrana se tiñó con un anticuerpo secundario conjugado con HRP y se detectaron las bandas con el kit ECL Plus (Beyotime, Nanjing, China).
Ensayo de citotoxicidad
citotoxicidad in vitro se evaluó CCK-8 ensayo. Las células A549 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 6.000 células por pocillo y se cultivaron durante la noche. Las células fueron transfectadas con PAM-Ap /PMIR-NC, PAM /PMIR-34a o PAM-Ap /NPs PMIR-34a durante 4 h (2 mg /ml PMIR-34a), a continuación, se sustituyó el medio y las células se incubaron adicionalmente durante 24 h, 48 h, 72 h o 96 h. Después de retirar los medios de comunicación, 100 l de medio de cultivo que contiene 10 l CCK-8 se añadió en cada pocillo y se incubó durante otra 1 h, la absorbancia de cada pocillo se midió usando un lector de microplacas (Thermo Scientific, MUTISKAN MK3) a 450 nm longitud de onda . La viabilidad celular de las células A549 se expresó en relación a células no tratadas.
análisis apoptosis de la célula
La apoptosis de las células A549 se determinaron por citometría de flujo como se informó anteriormente [24]. Brevemente, las células A549 se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de 1 × 10
5 células por pocillo y se incubaron durante la noche. Las células fueron transfectadas con PAM-Ap /PMIR-NC, PAM /PMIR-34a o PAM-AP /NPs PMIR-34a durante 4 h (2 mg /ml pDNA), entonces el medio de transfección se sustituyó y las células se incubaron adicionalmente durante 48 h. A continuación, se lavaron las células, se tripsinizaron y recogieron por centrifugación. La apoptosis de las células se evaluó por citometría de flujo después de la tinción con Anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) tinción kit de acuerdo con el protocolo del fabricante.
vitro
migración y la invasión de ensayo En
la capacidad de migración y la invasión de las células A549 se evaluó usando la cámara transwell 6,5 mm modificado con membranas de policarbonato (8,0 mm de tamaño de poro) (Costar, Cambridge, Mass). células A549 (1 × 10
5 células) se transfectaron durante 24 h y se trataron con tripsina y se suspendieron en 200 l de medio RPMI 1640 sin suero. A continuación, las células se sembraron en las cámaras superiores con el no recubierto o recubierto previamente con 20 mg de Matrigel (para el ensayo de migración y la invasión, respectivamente). El medio de cultivo que contiene 10% de FBS en la cámara inferior se utilizó como quimioatrayente. Después de 24 h de incubación, las células no migradas o no invasores fueron borradas con bastoncillos de algodón de la cámara superior. Las células en la parte inferior de la cámara se fijaron con paraformaldehído al 4%, después se tiñeron con una solución de cristal violeta 0,5% para 1 h y se contaron bajo un microscopio en cinco campos predeterminados.
El análisis estadístico
Datos se muestran como la media ± desviación estándar. análisis de una vía de la varianza (ANOVA) se llevaron a cabo. Valor de p & lt; 0.05 se definió como estadísticamente significativo.
Resultados y Discusión
Síntesis y caracterización de los materiales
éster de polietilenglicol bifuncional succinimidil maleimida (Mal-PEG-NHS) fue adoptada para conectar el grupo amino de PAMAM y 5 'tiolado-aptámero S6. La diálisis se usa para purificar el producto. La reacción de PAMAM y Mal-PEG-NHS se controló por 1H-RMN (300 MHz), con picos específicos para PAMAM (2.3, 2.4, 2.7, 3.1ppm) (Fig 1A), PEG (3,6 ppm), MAL (5,8 , 6,3 ppm) (Fig 1B). Las
Datos 1H-RMN confirmaron la formación de PAMAM-PEG-MAL. Utilizamos las áreas integradas de H-RMN picos de cuantificar la relación entre las cadenas de PEG y PAMAM. Con la asunción de 164 protones de metileno por PEG y 2032 por PAMAM, hemos identificado que el PAMAM-PEG-MAL tenía una proporción de protones PAMAM /PEG de 0,32, lo que indica que cada PAMAM tuvo un promedio de 3.9 PEG conexión de cadenas.
Caracterización de nanopartículas PAM-AP /pDNA
los conjugados PAM-AP recién preparados se disolvieron en condiciones acuosas y se mezcla con pDNA para formar las partículas de nano-escala. Los tamaños medios de PAM-AP /NP pDNA van de 100 a 200 nm cuando la relación N /P excede 5 (Fig 2A). A medida que aumentaba la relación N /P, el tamaño de PAM-Ap /pDNA NPs cayó por debajo de 200 nm (Fig 2A), y ningún cambio en el tamaño después de eso. Estos resultados indican la formación de densas nanopartículas entre PAM-Ap y pDNA. Como se muestra en la figura 2B y 2C, el tamaño y el potencial zeta se cambiaron ligeramente después de la conjugación de PEG y aptámero. El tamaño de PAM-Ap /pDNA aumentó aún más a alrededor de 150 nm mientras que el potencial zeta se negó a alrededor de 31mV, indicando que el PEG y aptámero rodearon la superficie de la nanopartícula. Por otra parte, PAM-AP /pDNA NP tenían distribución de tamaños más estrecha en comparación con el PAM /pADN PN. La capacidad de condensación del pDNA sintetizado PAM-Ap se midió mediante retardo en gel de agarosa. Los experimentos de electroforesis en gel mostraron un aumento de la relación N /P de los PN PAM-Ap /pDNA (figura 2D). Y en la relación de N /P de 4, retraso completa de PAM-Ap /pDNA fue identificado.
(A) El tamaño y el potencial zeta de las NPs PAM-AP se midieron por DLS. (B) La distribución del tamaño de PAM /pADN y PAM-AP PN en N /P = 40. (C) El potencial Zeta distribución de PAM /pADN y PAM-AP PN en N /P = 40. (D) de retardo en gel electroforesis de PAM-AP /NP pDNA. Banda 1: pDNA desnudo, bandas 2-7: PAM-Ap /NP pDNA se prepararon a una relación N /P de 0,5, 1, 2, 4, 8 y 16, respectivamente. (E) Ensayo de estabilidad en suero de pDNA, PAM /pADN y complejos /pDNA PAM-AP en condiciones FBS 50% a 37 ° C. Los datos se muestran asmean ± SD (n = 3).
El pDNA estabilidad de los complejos es importante para el suministro de genes eficiente. Se introdujo un ensayo de gel de agarosa para determinar la estabilidad del pDNA en el 50% de suero de imitar
in vivo
condiciones. El efecto de protección de los complejos contra la degradación del ADN por suero se muestra en la figura 2E. El pDNA desnudo se degradó completamente en un 50% de SFB después de las 8 h, mientras PAM /pADN y PAM-Ap /pADN exhiben efectos protectores contra el suero durante 48 h (Figura 2E). Estos resultados sugieren que la PAM-Ap no sólo podría obligar pDNA, sino también protegerlo de la degradación en el suero, lo que podría contribuir a la aplicación potencial del sistema de administración de genes.
La captación celular de nanopartículas
El rendimiento de vectores de suministro de genes no virales está estrechamente relacionado con los niveles de captación celular [25]. La fluorescencia verde emitida a partir de pDNA /YOYO-1 se analizó para evaluar la captación celular de PAM-AP /NP pDNA. las células A549 se incubaron con pDNA desnudo, PAM /pDNA o PAM-AP /pDNA NPs, respectivamente, y entonces las células positivas YOYO-1 se cuantificaron por citometría de flujo que representa el grado de captación celular [26]. La proporción de 1 YOYO-células positivas aumentó con relación N /P, que indica la captación celular de NPs se sometió a la relación N /P en gran medida (Fig 3A y 3B). PAM-Ap /pADN PN exhibió mayor captación celular de PAM nontargeted /pDNA PN. Cuando se trata con PAM-AP /pDNA PN en relación N /P 40, las células A549 exhiben señales de fluorescencia notablemente más altos (94,2% 1 YOYO-células positivas) en comparación con las células PAM /pDNA PN tratados (48,5%-1 YOYO células positivas). Estos resultados sugieren que los PAM-AP /pDNA NPs se unen preferentemente a las células A549. Para demostrar además que la captación mediada por receptor S6 de PAM-AP /NP pDNA en las células, llevamos a cabo experimento de competición por el pretratamiento de las células A549 con un exceso de cantidad de S6 aptámero y reveló una absorción significativamente inferior que indica el aptámero libre bloqueado los sitios de unión de S6 en la superficie cytolemma de las células A549, que suprimió la capacidad de orientación de PAM-AP /pDNA NPs
.
se utilizaron las células sin tratar como control. Los datos se muestran como media ± SD (n = 3). * P & lt; 0,05, diferencias significativas entre estos grupos.
Los experimentos se llevaron a cabo CLSM siguiente para confirmar aún más la internalización celular de la entrega mediada por el receptor específico de PAM-AP /NP pDNA y distribución de pDNA en las células A549 porque la pista CLSM YOYO-1 etiquetada pDNA (fluorescencia verde) formulada en nanocomplexes. En comparación con PAM no específica /pDNA PN, las células A549 tratadas con PAM-AP /pDNA PN exhibieron señales de fluorescencia verde más fuertes después de la incubación 4h, que indica una mayor captación celular de los PN específicas (figura 4). Notebaly, señal de fluorescencia se redujo significativamente en el aptámero pretratado células A549 en condiciones similares, lo que sugiere que el receptor de endocitosis mediada S6 era una vía principal para PAM-Ap /pDNA NPs internalización. Además, se observaron señales de la mayoría de YOYO-1 en el citoplasma, lo que implica los efectos esponja de protones de PAMAM jugaron un papel crítico en el proceso de endosomal /lisosomal de escape [27]. En conclusión, nuestros datos sugieren que la PAM-AP /pDNA NP muestran tanto buenas propiedades de células focalización y endosomal /lisosomal de escape.
células A549 tratadas con YOYO-1 pDNA etiquetados complejos con PAM y PAM-Ap (N /relación P: 40) con o sin S6 aptámero pretratada. Las células se incubaron a 37 ° C. Todas las barras de escala son de 20 micras.
La eficacia de transfección de nanopartículas
Después de demostrar la captación celular eficiente de PAM-AP /pDNA PN, A continuación mide la eficacia de transfección de PAM-AP /PN PMIR-34a en las células A549 con un reportero EGFP. Debido a que el vector de expresión PMIR-34a contiene mejorada gen verde fluorescente (EGFP), cuya expresión es impulsada por el mismo promotor, la expresión EGFP puede reflejar directamente los niveles de expresión PMIR-34a y se puede utilizar para evaluar la eficiencia de la transfección. Como se muestra en la figura 5A y 5B, la eficiencia de transfección génica de PAM-AP NPs /PMIR-34a era mucho mayor que la de PAM /NPs PMIR-34a en diferentes proporciones N /P. La expresión del gen EGFP exógeno aumentó con la relación de N /P para ambos nanopartículas. La eficacia de transfección fue baja en relación N /P de 10, pero aumentó en relación N /P de 20 y 40. La expresión de EGFP de PAM-AP PN /PMIR-34a en las células A549 se observó claramente en la relación N /P de 40 , lo que indica que las nanopartículas lograron efectiva eficacia de la expresión génica. Del mismo modo, las mediciones cuantitativas de células EGFP positivas confirmaron que 37,9% de las células fueron transfectadas con éxito con PAM-AP NPs /PMIR-34a cuando la relación N /P fue de 40, mientras que fue de sólo el 9,5% para los NPs PAM /PMIR-34a grupo. Además, hubo diferencias significativas del porcentaje de células transfectadas entre los dos grupos en todas las relaciones de N /P. Estos resultados sugieren que la conjugación aptámero mejorar significativamente la eficiencia de la transfección de PAM-AP /NP pDNA. Dado que la toxicidad también aumenta con la cantidad de polímeros catiónicos [28, 29], hemos elegido nanopartículas en relación N /P 40 para los siguientes experimentos.
Los datos se muestran como media ± SD (n = 3). Todas las barras de escala son 200 micras. * P & lt; 0,05, diferencias significativas entre estos grupos.
Influencia de la expresión génica
La sobreexpresión de los genes anti-apoptóticos en las células de cáncer se considera como uno de los mecanismos de progresión del tumor. Como potente regulador de la apoptosis, Bcl-2 se ha identificado en varios tipos de cáncer [30]. BCL-2 se ha encontrado que se sobreexpresa frecuentemente en cáncer de pulmón y su función anti-apoptótica está estrechamente asociada con sus niveles de expresión [31, 32]. La sobre-expresión de BCL-2 resultado en la resistencia a las células cancerosas a la quimioterapia inducida por fármacos apoptosis [33]. BCL-2 ha sido identificado previamente como un objetivo prometedor aguas abajo de miR-34a [34]. Como un supresor de tumor, la inactivación de p53 en respuesta a algunas señales de estrés asociados con el cáncer es una alteración genética común en la mayoría de tipos de cáncer [35]. p53 activada provoca numerosos resultados biológicos, tales como la reparación de daños menores, la regulación del ciclo celular, la inducción de la senescencia replicativa y apoptosis. La interacción entre p53 y miR-34a se ha aclarado en muchos tipos de cáncer, incluyendo NSCLC [36]. Para evaluar la actividad de activación de BCL-2 supresión génica y el gen p53 de PMIR-34a transferido células A549, se trataron células A549 con PAM-Ap /PMIR-34a, PAM /PMIR-34a o PAM-AP /NPs PMIR-NC y medido los niveles de BCL-2 y p53 mRNAs. Los resultados de qPCR mostraron que el nivel de BCL-2 mRNA fue significativamente regulada hacia abajo y ARNm de p53 significativamente hasta reguladas en las células A549 (Fig 6A). Después de 48 h de incubación, se observó 60,8% de disminución de Bcl-2 la expresión de ARNm para PAM-Ap /PMIR-34a, pero sólo 26,5% de disminución para PAM /PMIR-34a. Mientras tanto, transfectadas /PMIR-34a células A549 la PAM-Ap resultaron en un aumento de pliegue 7.93 de mRNA p53, significativamente mayor que la de PAM /PMIR-34a (2,1 veces). Del mismo modo, el nivel de expresión de p53 y Bcl-2 de proteínas en las células A549 se midieron mediante transferencia Western (Fig 6B). Como era de esperar, las proteínas mostraron la misma tendencia que el nivel de expresión del ARNm ya que la expresión de proteína p53 no estaba regulada y de la proteína BCL-2 se redujo en las células A549 PAM-Ap /PMIR-34a transfectadas. Tomados en conjunto, estos resultados indican que los NP-PAM Ap /PMIR-34a son capaces de influir en los genes y las proteínas relacionadas con la expresión en células A549.
Las células fueron cultivadas durante 48 h después de la transfección con PAM-Ap /PMIR-NC PN PN, PAM /PMIR-34A y PAM-AP PN /PMIR-34a durante 4 h. Se adoptó el análisis de PCR cuantitativa en tiempo real para cuantificar la expresión de ARNm, y se utilizó la transferencia Western para determinar la expresión de la proteína. Se utilizaron las células sin tratar como control. Los datos se muestran como media ± SD (n = 3). * P & lt; 0,05, una diferencia significativa en comparación con PAM /PMIR-34a.
Inhibición
crecimiento de las células del cáncer de
A continuación, se evaluó el
in vitro
efecto antiproliferativo en del PAM PN ap /PMIR-34a en las células A549 utilizando CCK-8 ensayo. Después de 24 h, 48 h, 72 h o 96 h de la transfección, se midieron las tasas de inhibición del crecimiento celular. Se encontró que PAM-AP NPs /PMIR-34a exhiben los efectos antiproliferativos más fuertes en las células A549 (Figura 7A). La viabilidad celular de PAM-AP NPs /PMIR-34a tratada células A549 mostraron 29,8%, 49,7%, 57,5% y 62,4% menor que la del grupo de control después de 24h, 48h, 72h y 96h de la transfección, respectivamente. Con el paso del tiempo de incubación, la brecha de la viabilidad celular entre PAM-Ap /PMIR-34a y otros grupos aumentó, y esto puede ser debido a la histéresis del gen exógeno expresado por PMIR-34a. Es digno de notar que PAM-Ap /PMIR-NC PN crecimiento de las células A549 ligeramente inhibido. Por lo tanto, el aptámero también contribuyó al efecto antiproliferativo de PAM-Ap /PMIR-34a. Estos resultados experimentales indican que el aumento de la transfección de genes en células A549 afectado el crecimiento celular. Por lo tanto, NPs PAM-Ap /PMIR-34a tiene un potencial de ser un sistema de administración dirigida de genes en el tratamiento de cáncer de pulmón
.
(A) de citotoxicidad in vitro de PAM-Ap /PMIR-NC, PAM /pMiR- 34a y PAM-AP PN /PMIR-34a en las células A549 en diferentes puntos de tiempo después de la transfección. (B) La apoptosis celular de las células A549 después del tratamiento con NP-PMIR 34a durante 48 h PAM-Ap /PMIR-NC, PAM /PMIR-34a y PAM-Ap /. CCK-8 ensayo se utilizó para evaluar la viabilidad celular y citometría de flujo se utilizó para determinar la apoptosis de células con tinción de anexina /PI. Los datos se muestran como media ± SD (n = 3). * P & lt; 0,05, diferencia significativa entre estos grupos.
La apoptosis ha sido generalmente considerado como uno de los mecanismos predominantes para la muerte celular [37, 38]. Como se muestra en la figura 7B, las células apoptóticas y necróticas en el grupo de control no eran evidentes (& lt; 10%). El tratamiento de PAM /PMIR-34a y PAM-AP NPs /PMIR-34a aumentó significativamente el porcentaje de células apoptóticas tempranas y tardías. Además, las células tratadas con PAM-AP NPs /PMIR-34a mostró el mayor porcentaje de células totales dañadas, que fue significativamente mayor que la de los otros grupos (P & lt; 0,05). Los resultados demostraron que los NP-PAM Ap /PMIR-34a fueron más eficaces en la inducción de la apoptosis de las células A549 que no son objetivo de PAM /PMIR-34a.
in vitro
migración y la invasión
Hay varios cambios en las células de cáncer y microambiente del tejido, y los cambios hacen que las células migren o invaden los tejidos sanos, lo que resulta en la metástasis del cáncer [39]. Por lo tanto, la migración y
in vitro
ensayos de invasión son esenciales para evaluar la tendencia del proceso de metástasis. Después transfectadas con PAM-AP PN /PMIR-34a, se investigó la capacidad migratoria e invasiva de las células A549. Como se muestra en la figura 8A y 8B, se encontró que PAM-AP NPs /PMIR-34a inhibieron significativamente la migración y la invasión de las células A549. Sorprendentemente, las tasas migratorias e invasivas de las células tratadas /PMIR-34a PAM-AP fueron 17,7% y 23,8% en comparación con las células no tratadas, respectivamente. Sin embargo, hubo un impacto muy mínimo en la migración y la invasión de las células tratadas con PAM-Ap /PMIR-NC en comparación con los del grupo de control, lo que podría deducirse que la expresión de miR-34a influenciado principalmente la migración celular y la invasión en lugar de S6 aptámero.
Las células fueron tratadas previamente con PAM-Ap /PMIR-NC, PAM /PMIR-34a y 34a-PN PMIR PAM-Ap /. Se utilizaron las células sin tratar como control. (A) Imágenes de microscopía representativos de la migración y el análisis cuantitativo de las células migratorias. (B) Imágenes de microscopía representativos de la invasión y el análisis cuantitativo de células invasoras. Los datos se muestran como media ± SD (n = 3). * P & lt; 0,05, diferencias significativas entre estos grupos.
Conclusión
Aunque la toxicidad de los dendrímeros es uno de los factores que limitan sus aplicaciones clínicas, los dendrímeros han sido considerados como portadores de "inteligentes" para su capacidad como vehículo de liberación génica intracelular.