Extracto
El ADN-proteína de unión rica en AT Interactivo de dominio 3B (arid3b) es elevado en el cáncer de ovario y aumenta el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de cáncer de ovario . Sin embargo, se sabe relativamente poco acerca de la función de arid3b. En este estudio realizamos el primer genoma de pantalla ancha para arid3b objetivo directo los genes y las vías arid3b regulada. Se identificaron y confirmaron numerosos genes diana arid3b por inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP), seguido de microarrays y RT-PCR cuantitativa. Usando algoritmos motivo de la búsqueda, que caracteriza un sitio de unión para arid3b, que es similar al sitio previamente conocido por la arid3a arid3b paralogue. Funcionalidad de este sitio predicho se demostró por análisis de chip. A continuación demostramos que arid3b induce la expresión de sus objetivos en líneas celulares de cáncer de ovario. Hemos validado que arid3b se une a un receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) potenciador y aumenta la expresión de mRNA. Arid3b también se une al promotor de Wnt5A y su receptor FZD5. FZD5 es altamente expresado en líneas celulares de cáncer de ovario, y está regulada positivamente por arid3b exógeno. Tanto arid3b y expresión FZD5 aumentar la adhesión a componentes de la matriz extracelular (ECM), incluyendo el colágeno IV, fibronectina y vitronectina. Arid3b-incrementa la adherencia al colágeno II y IV requiere FZD5. Este estudio demuestra directamente que arid3b une genes diana de una manera específica de la secuencia, lo que resulta en un aumento de la expresión génica. Además, nuestros datos indican que la regulación de los genes diana arid3b directos en la vía Wnt promueve la adhesión de células de cáncer de ovario
Visto:. Bobbs A, K Gellerman, Hallas WM, Joseph S, C Yang, Kurkewich J, et Alabama. (2015) arid3b directamente regula cáncer de ovario genes promotores. PLoS ONE 10 (6): e0131961. doi: 10.1371 /journal.pone.0131961
Editor: Zhang Jinsong, Escuela de Medicina de la Universidad de Saint Louis, Estados Unidos |
Recibido: 6 Febrero, 2015; Aceptado: June 8, 2015; Publicado: 29 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Bobbs et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de /Instituto Nacional del cáncer de la Salud R00CA133190, http://www.cancer.gov/(KDCD), cáncer ovárico de Investigación Fondo, Liz Premio Tilberis Académico, http://www.ocrf.org/(KDCD), Instituto Eck por la Salud Global, Universidad de Notre Dame, subvención piloto para la Genómica, https://globalhealth.nd.edu/(KDCD ). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
en los Estados Unidos, el cáncer de ovario es el 5
º cáncer más común en las mujeres y el cáncer ginecológico más letal. En 2014, se espera que ha habido 21.980 nuevos casos de cáncer de ovario, y 14.270 muertes [1]. Hemos demostrado que la proteína de unión a ADN arid3b-se sobreexpresa en el cáncer de ovario seroso; La expresión de arid3b en el núcleo se correlaciona con la recaída de la enfermedad [2, 3]. El objetivo de este estudio fue identificar los genes diana de manera mecánica directos de arid3b que puede contribuir a la progresión del cáncer de ovario.
arid3b pertenece a una familia de Dominio Interactivo rica en AT (áridos) proteínas que están implicadas en la remodelación de la cromatina y regulación de la expresión génica. Estas proteínas se caracterizan por el dominio de unión a ADN ÁRIDO, una secuencia altamente conservada de ~ 100 aminoácidos [4]. Arid3b tiene un dominio ÁRIDO que comparte una identidad de aminoácidos del 89,9% con su arid3a paralogue (un activador de células B originalmente llamado "brillante") que tiene un sitio de unión de consenso "AATTAA" [5-7]. Ensayos de movilidad han demostrado que se puede unir arid3b Regiones unión a la matriz, que también están vinculados por arid3a de IgH [8]. Recientemente se informó que arid3b se une al promotor Oct4 y regula su expresión, sin embargo, un enfoque imparcial para identificar los genes diana arid3b directos no ha sido reportado [9].
ARIDAS proteínas están involucradas en el desarrollo y tejido- expresión de genes específicos, y la expresión aberrante ha sido asociada con la tumorigénesis [10].
arid3b
es un gen esencial; null embriones mueren mitad de la gestación, que presenta graves defectos en el desarrollo del corazón, tejido neural, estructuras craneofaciales, yemas de las extremidades, y la formación de la cresta apical endodérmico [11-13]. Arid3b se sobreexpresa en el neuroblastoma, en particular tumores en etapa IV, y coopera con MYCN para aumentar el potencial y la proliferación [14, 15] oncogénico. En el cáncer de ovario seroso, arid3b es elevado [2]. La expresión nuclear arid3b se correlaciona con la recurrencia de la enfermedad [3]. Además, la sobreexpresión de arid3b en células de cáncer de ovario se acelera el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de cáncer [3] de ovario. No se conocen los genes diana que son regulados por arid3b y los mecanismos moleculares por los cuales los impactos arid3b tumorigénesis en el cáncer de ovario.
En este estudio se identificaron genes blancos directos de arid3b en las células de cáncer de ovario a través Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) seguido de la tecnología de microarrays (chip-chip). Las regiones de unión de arid3b se caracterizaron por análisis bioinformático computacional y produjeron un sitio de unión altamente conservado. Entre los genes diana de arid3b son miembros de las vías EGFR, Notch, señalización del TNF, y Wnt. Estamos particularmente interesados en el efecto de arid3b en la vía de señalización de Wnt, ya ha arid3b regiones de unión en cuatro genes de la vía Wnt: WNT5A, FZD5, APC, y MYC. WNT5A y FZD5 se sobreexpresa en el cáncer de ovario y se correlacionan con un mal pronóstico, y la actividad de Wnt se sabe que regulan la proliferación y muerte celular [16-19]. Upregulation de FZD5 y el aumento WNT7A ligando el crecimiento del tumor y la adhesión celular [20]. Hemos encontrado que aumenta la expresión de arid3b FZD5, APC, y MYC. La sobreexpresión de FZD5 o arid3b en células de cáncer de ovario aumenta la adhesión a varias proteínas de ECM, incluyendo la fibronectina y vitronectina, mientras que desmontables de FZD5 o edición de arid3b causa una pérdida de adhesión a ciertos componentes de la MEC. Además cables, desmontables de FZD5 en las células, donde se sobreexpresa arid3b a la disminución de la adherencia y la disminución de la adherencia inducida arid3b al colágeno II, colágeno IV, y tenascina. Estos resultados sugieren que la regulación directa de la señalización de Wnt por arid3b puede contribuir a la progresión del cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
Las líneas celulares se cultivaron a 37 ° C con 5% de CO
2. OVCA429 células (proporcionados por el Dr. Bast, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX y que se describen en [21]) se cultivaron en medio esencial mínimo (MEM). Se obtuvieron células Skov3IP del Dr. Mills, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX. La derivación de células Skov3IP se describe en Yu et al [22]. las células se cultivaron en Skov3IP McCoys 5A Medios. El medio se suplementó con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Atlas, Ft. Collins, CO), 0,1 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 50 U /ml de penicilina, y 50 mg /ml de estreptomicina. células OVCA429 y Skov3IP expresan arid3b, FZD5 (plenti-C-mGFP, Origene, Rockville, MD), o controlar proteína roja fluorescente (RFP) se crearon como se ha descrito anteriormente y los niveles de arid3b sobreexpresión fueron similares a los obtenidos en nuestros estudios anteriores ( Fig 1) [23]. Edición del gen arid3b en OVCA429 células transfectadas se realizó utilizando sgRNA /Cas9 vector de expresión de todo-en-uno la orientación arid3b (p-CRISPR-CG01, Geneocopeia, Rockville, MD). Como control de líneas de células de CRISPR-editado, OVCA429 células fueron transducidas con un clon Cas9 nucleasa expresión (CP-LvC9NU-01, Geneocopeia, Rockville, MD) y un revueltos sgRNA control de vector (p-CRISPR-LvSG02, Geneocopeia, Rockville, MARYLAND). Para FZD5 transducción, las células SKOV3 (ATCC, Manassas, VA, USA,#HTB-77) [24] se utilizaron en lugar de las células Skov3IP ya que nuestras células SKOV3IP expresan GFP y el vector de expresión FZD5 expresa GFP (PLENTI-C-mGFP) . FZD5 knock-down se logró utilizando un vector de ARNhc transducidas (pGFP-C-shLenti, Origene, Rockville, MD). células OVCAR3 (ATCC,#HTB-161) [25] se cultivaron en medios RPMI con 20% de FBS y 10 mg /ml de insulina. Caov3 (ATCC,#HTB-75) [26] y 293FT (Life Technologies, Carlsbad, CA,#R700-07) [27] las células se cultivaron en Dulbecco del medio Eagle modificado (DMEM) con 10% de FBS. IOSE398 células (del Dr. Pila, Harper Instituto de Investigación del Cáncer, Notre Dame, IN se describe en [28]) se cultivaron en una mezcla 1: 1 de los medios de comunicación 199 y MCDB105, con un 5% de FBS y 50 mg /ml de gentamicina. Todos los reactivos de cultivo de células con excepción de las FBS eran de Invitrogen (Carlsbad, CA). Las líneas celulares se autentican el 1 de octubre de 2013, en la ATCC por un perfil de STR.
arid3b expresión se evaluó en los padres, que expresan RFP, y 6XHis-arid3b OVCA429 (A) y (B) Skov3IP líneas celulares, utilizando tanto QRT-PCR. (C) Un western blot de líneas celulares de sus padres y arid3b que expresan confirma este resultado.
modelos de xenoinjerto de ratón de cáncer de ovario
Todos los estudios fueron aprobados por la Universidad de Notre Dame CICUAL comité (Protocolo 14-060) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la política de Servicio de Salud Pública de Estados Unidos para el cuidado humano y uso de Animales de laboratorio. los ratones de seis semanas de edad, hembras desnudos nu /nu (Charles River, Wilmington, MA) se mantuvieron en el Centro de Ciencias de la Vida Freimann (Universidad de Notre Dame). En el estudio piloto (4 ratones por grupo), 1x10
6 células SKOV3IP-RFP o SKOV3IP-arid3b en 200 l de tampón fosfato salino (PBS; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, y 11,9 mM de tampón de fosfato, pH 7,4 ) fueron inyectados por vía intraperitoneal (IP) en ratones desnudos. Los ratones se controlaron semanalmente para el crecimiento tumoral (una imagen ventral y dorsal cada semana con). El crecimiento de los tumores y de formación de imágenes se informa en Roy, L., et al [3]. Dado que los resultados de propiedad intelectual de crecimiento tumoral en la diseminación tumoral amplia difusión, es difícil de cuantificar con precisión el volumen del tumor para tumores múltiples
in vivo
. Los ratones fueron sacrificados cuando por
in vivo
imagen detectaron múltiples tumores grandes o si los ratones mostraron ningún signo de enfermedad, incluyendo un abdomen distendido.
Análisis de microarrays y la bioinformática
Tres muestras de ARN se prepararon cada uno de SKOV3IP-RFP y ascitis SKOV3IP-arid3b lavados peritoneales de fluidos /[3]. Los microarrays se realizó en el Centro Notre Dame Genómica en una Affymetrix Human Genome U133 Plus 2 GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA). Las sondas de establecer los niveles de expresión se normalizaron y se resume utilizando el robusto promedio de múltiples matrices (GCRMA) algoritmo [29] GC. Control de la sonda fija y conjuntos de sondas que eran "no detectable" se separaron por filtración para su posterior análisis. "No detectable" se definió como conjuntos de sonda que, o bien están siendo llamados "ausente" por Algoritmo de detección de Affymetrix llamadas (Manual titulado "GeneChip Expresión Análisis de Datos de análisis fundamental", Affymetrix; www.affymetrix.com) en todas las seis matrices o que tiene toda su expresión reportada por GCRMA menos de 2,5. El análisis de la importancia microarrays (SAM, [30]) se utilizó para la detección de los genes expresados diferencialmente entre la arid3b y controles RFP. Se han encontrado uno mil doce conjuntos de sonda a ser significativa, con una tasa de falso descubrimiento (FDR) inferior al 10%. De estos conjuntos de sonda, 199 se redujeron reguladas por arid3b. Un segundo análisis, más estricta normaliza los datos de microarrays primas por RMA, y requiere un FDR de menos del 5%. Pathway análisis se llevó a cabo mediante referencias cruzadas de los genes regulados con sus términos (GO) ontología de genes asociados que figuran en la base de datos Ensembl.
inmunoprecipitación de la cromatina seguido de microarrays (chip-Chip)
El CHIP- procedimiento de la viruta se realizó de acuerdo con el protocolo de Tamimi et. Alabama. [31]. En pocas palabras, Ni
2 + NTA se utilizaron perlas magnéticas para aislar la cromatina complejos que contienen el cizallado (Su) -6-arid3b proteína de fusión a partir de lisados. Un control positivo (entrada 100%, sin Ni
2 + NTA) y el control negativo (H2O además Ni
2 + NTA añadió a la muestra) también fueron incluidos. Microarray hibridación se realizó a través de una matriz de NimbleGen 2.1M humano Deluxe Promotor siguiendo las instrucciones del fabricante, tal como se describe a continuación. integridad de la muestra para las muestras de entrada de chip y de control experimental se verificó con un Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). Una g de las muestras experimentales y de control se marcaron con nonamers azar Cy3 y Cy5-etiquetados, respectivamente (Roche NimbleGen, Inc., Madison, WI). Una parte alícuota de 34 g de cada uno producto etiquetado CY-colorante se reunió y se hibrida con una micromatriz a 42 ° C durante 16-20 horas. Microarrays se lavaron, se secaron, y luego escanearon en un escáner NimbleGen MS200 a 2 micras resolución. Microarray imágenes se visualizaron y se analizaron con el software v2.5 NimbleScan (Roche NimbleGen, Inc.).
Cálculo del sitio de unión arid3b se llevó a cabo utilizando tanto MEME (Universidad de Queensland, Brisbane, Australia [32, 33] y ALLEGRO (Universidad de Tel Aviv, Tel Aviv, Israel) [34, 35]. Los datos de secuencia de arid3b regiones de unión según lo determinado por nuestros experimentos chip-chip se extrajeron usando un perlscript hecha a la medida. la parte superior 50 arid3b secuencias de sitios de unión fueron escaneados por motivos comunes usando MEME. En un análisis paralelo, todas las secuencias de sitios de unión significativa arid3b se compararon con un genoma de fondo utilizando ALLEGRO.
inmunoprecipitación de cromatina (cHIP)
cromatina Sheared se preparó a partir del 90% confluentes células de cáncer de ovario utilizando el Kit Pierce agarosa chIP (Rockford, IL) y un protocolo publicado de Cold Spring Harbor [36]. cizallamiento del ADN se realizó utilizando un EpiShear sonda Sonicator (Active Motif, Carlsbad, CA), con una serie de 10 20-segundos pulsos a 25% de la amplitud. Cincuenta mg de la cromatina esquilada se utilizó para cada inmunoprecipitación (IP). IP se realizó usando un anticuerpo anti-arid3b (Bethyl Laboratories, A302-564A, Montgomery, TX) o IgG (Pierce, Rockford, IL) y perlas magnéticas proteína-agarosa. Una muestra de "ADN de entrada" se recogió antes de IP para la normalización. muestras de chip se inversa reticulado por calentamiento a 65 ° C durante 4 horas en presencia de 20 mg de proteinasa K y NaCl 250 mM, y limpiado utilizando una extracción con fenol /cloroformo estándar seguido de precipitación con etanol.
ChIP Las muestras de ADN se analizaron con la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), utilizando SSO Fast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA). Cada muestra de ADN ChIP se comparó con la muestra de ADN de entrada adecuado. Los cebadores se compraron a Integrated DNA Technologies (Coralville, IA), y diseñados para flanquear propuesta sitios de unión arid3b:
EGFR F: CTCAAGTGTCTCATACTACC /R: GTCATTGGGCAAACCACTG
BTC F: GTCTCAGCCTCCCAAGTAGC /R: CTAACAGGTATAATGTCACAG
WNT5A F: AGTGATTCTCCTGCCTCAGC /R: TGGAAGGGATGAATTTGGTC
MYC F: GGAGGCCAGATGCATGAG /R: TAC CTA TGG CTG TTA GAA TC
FZD5 F: GCACAATGGCTCATGCTTG /R: CGCAATCTTGGCTCACTGC
APC F: CTCCTGACCTCAAGTGATCC /R: CAGTCACTGCTTATAGAATC
RIPK1 F: GTCTTGAACTCCTGACCTCG /
R: ACAGAAACTCCATGCAAACC
NOTCH2 F: GTCAGGAGTTTGAGACC /R: ACTGCAATCTCTGCCTCC
NUSAP1 F: TTCACATGCCTCATTAAGAG /R: TCCCGAGTAGCTGGGATTCC
CASP1 F: ACTCAAGCAATTCACTCACG /R: CATTCTGAGTCCAGAGCCTG
LPAR1F: TGAAGAGTTGCGTATTAAC /R: AGTTTCATGGGTGCTATACC
CENPN F: ATCTACTGTATGTCAGACAC /R: CAGGCACCCGATACCACG
CEP55: F: GCAGGAGTTCGTGATCAGAG /R: CCAGCTAATTCTGGGATCG
Expresión génica
se aisló el ARN de las células OVCA429 y Skov3IP utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN complementario (ADNc) a partir de 500 ng de ARN mediante el uso de alta capacidad de cDNA transcripción reversa kit (Life Technologies, Waltham, MA) según las indicaciones. Las reacciones se realizaron ya sea usando iTaq Universal Sondas Supermix (Bio-Rad) o SSO EvaGreen Fast Supermix (Bio-Rad). Todos los conjuntos de cebadores de expresión de genes se obtuvieron de las tecnologías de ADN integrado (Coralville, IA), con la excepción de arid3b (de Life Technologies, Carlsbad, CA). reacción en cadena de polimerasa transcrita inversa (QRT-PCR) reacciones cuantitativas se realizaron por triplicado y se normalizó a la expresión de GAPDH. Los ensayos de cebadores son las siguientes: APC: Hs.PT.56a.3539689, arid3b: HS01084949_g1, BTC: Hs.PT.56a.3511718, CASP1: Hs.PT.56a.39699622, cenpk: Hs.PT.56a.40187080. g, CENPN: Hs.PT.56a.22431568.g, CEP55: Hs.PT.56a.279272.g, EGFR: Hs.PT56a.20590781, FZD5: Hs.PT.56a.3585264, GAPDH: Hs.PT. 39a.22214836, MYC: Hs.PT.49a.3659201.g, NOTCH2: Hs.PT.512811432, NUSAP: Hs. PT.51.21077614, WNT5A:. Hs.PT.56a.22221435
Western Blot
proteínas de células enteras lisados se obtuvieron mediante la lisis de las células cancerosas y OVCA429 ovario Skov3IP en tampón RIPA (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, 1% NP-40, 0,5% de EDTA, 0,1% SDS, y 1X Halt proteasa & amp; fosfatasa cóctel inhibidor (Pierce, Rockford, IL)). La concentración de proteínas se midió utilizando un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) según el protocolo estándar (Pierce, Rockford, IL). Las proteínas se detectaron utilizando los siguientes anticuerpos: arid3b (# A302-564A, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, policlonal de conejo, sintética de péptidos antigénicos), FZD5 (# MC-4273, MBL, Woburn, MA, policlonal de conejo, sintética de péptidos antigénicos) , β-actina (# AM1829b, Abgent, San Diego, CA, ratón monoclonal, proteína de antígeno recombinante), GAPDH (# ab128915, Abcam, Cambridge, Inglaterra, conejo monoclonal, sintética de péptidos antigénicos), COXIV (# 4850, Cell Signaling Technology , policlonales de conejo, péptido sintético correspondiente a los residuos que rodean Lys29 de COXIV humana), y arid3a anticuerpo policlonal de conejo (una especie de regalo de H. Tucker UT Austin) seguido de un anticuerpo anti-conejo conjugado con HRP secundaria (GE Health Care, Knox , IN). Imaging y cuantificación se llevaron a cabo utilizando un Sistema de Bio-Rad ChemiDoc XRS +, corriendo Imager Software Lab (Hercules, CA).
Ensayo de adherencia de ECM
unión celular a componentes de ECM se determinó usando un colorimétrico ECM Adherencia de la célula de matriz Kit (Millipore, Billerica, MA). Los ensayos de fijación de ECM se realizaron en células que expresan OVCA429 y SKOV3 arid3b, FZD5, FZD5 shRNA, o que contienen arid3b CRISPR-editado. Después de 1 hora de incubación, las células no adherentes se lavaron de distancia, con las células adherentes restantes teñidas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células teñidas se lavaron con agua, y la mancha se solubilizaron con el tampón de extracción kit. absorción de luz a 540 nm se midió en un Spectramax Plus (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Para el cálculo de las diferencias en la adhesión celular, se informaron las medidas de absorción como un factor de cambio más OVCA429-RFP o adhesión SKOV3-RFP para cada componente de ECM.
TCF /LEF reportero de ensayo
Estamos transfectadas 293FT células crecido a 80% de confluencia en una placa de 12 pocillos, utilizando Lipfectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), con 500 ng de ADN. Todas las células se transfectaron con TOPflash o FOPFLASH plásmidos indicadores junto con un vector que expresa la fuerza arid3b (PLENTI-suCMV-RSV, Gentarget, San Diego, CA), FZD5 (PLENTI-C-mGFP, Origene, Rockville, MD) Wnt5a (pLenti- C-mGFP), o un vector de plenti-C-mGFP vacío. Todas las muestras también se cotransfectaron con un control de luciferasa de Renilla para normalizar el número de células y la eficiencia de la transfección. La actividad de luciferasa se midió usando un kit de Promega Dual Luciferase Assay (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante y se mide en un luminómetro TD 20/20 (Turner Designs, Sunnyvale, CA). Un experimento similar se realizó con células 3T3 "Leading Light" (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY). A medida que estas células expresan un informador de luciferasa Wnt, que sólo se transfectaron con los vectores de arid3b, FZD5, y Wnt5a antes mencionados, y se normalizaron por la concentración de proteína. Todas las condiciones se realizaron por triplicado y se normalizó para el control interno de Renilla.
Estadísticas
qPCR datos y de adhesión celular t-estadísticas se calcularon utilizando el procedimiento de Smith-Satterthwaite con la población desigual varianzas. La significación estadística se asigna a las comparaciones con un valor de p de 0,05 o inferior. El exceso de representación de la ontología de genes (GO) se calculó utilizando una prueba de ji cuadrado.
Resultados
arid3b une las regiones reguladoras de ADN
Para conocer mejor cómo arid3b regula el crecimiento del tumor de ovario hemos tratado de identificar los genes regulados arid3b. Nuestro primer paso fue identificar regiones reguladoras (tales como promotores y potenciadores), vinculado por arid3b a través de análisis de chip-chip en células de cáncer de ovario que sobreexpresan arid3b (6XHis-arid3b). OVCA429 células fueron transducidas con arid3b como se describe anteriormente [23]. Dado que los niveles de expresión de arid3b en las células usadas para el chip-Chip eran muy altas (alrededor de un aumento de 300 veces) que elegimos para validar los genes a niveles más moderados de expresión arid3b que son más susceptibles de ser alcanzadas
in vivo
(Fig 1). cromatina complejos cortados unidos a Su-etiquetados arid3b se aislaron utilizando Ni
2 + NTA perlas magnéticas, a continuación, hibridado con una matriz de NimbleGen humano 2.1M Deluxe Promotor. El análisis estadístico de la matriz de chip-chip de 2.367 reveló regiones genómicas vinculados por arid3b (S1 Tabla). Las regiones genómicas identificadas por chip-chip de variaron de 397 pares de bases a 3.198 pares de bases (mediana: 1.131 pares de bases).
A continuación se evaluó si los genes vinculados arid3b se agrupan en distintas vías o funciones biológicas. Las regiones genómicas que rodean a cada sitio de unión arid3b fueron escaneadas para la transcripción sitios de inicio (SST) en las proximidades, por lo tanto la asignación de cada sitio de unión a una región reguladora probable. Aproximadamente el 11% de los sitios de unión arid3b situados de esta manera se encuentran en la región promotora de un gen inmediata (definida como 0-2Kb de la SAT), el 18% se encuentra en una región potenciadora en las inmediaciones (2-5Kb de la SAT), 52 % se encuentran en las regiones más distantes del reforzador, y el 19% se encuentra en intrones (figura 2).
(a) Distribución de arid3b sitios relativos al sitio de inicio de transcripción del gen cercano vinculante. (B) Representación gráfica del sitio arid3b consenso computacionalmente derivados, generada por MEME.
Los genes con las inmediaciones de unión se agruparon por Gene Ontología (GO) términos de función biológica (Tabla 1) arid3b. Muchos de los objetivos arid3b putativos tienen GO términos asociados con la muerte celular y la apoptosis (88 genes), el desarrollo del corazón (21 genes), el desarrollo de las neuronas (47), y el vástago de marcadores de células (6 genes). Un número menor de genes se encontraron con los términos de GO para primordio de la extremidad (2 genes) y la formación facial-craneal (1 gen). También hemos observado que arid3b se une a una serie de genes implicados en el centrómero o metafase (44 genes). Estas categorías representan un subconjunto de las funciones biológicas que arid3b puede regular e implicar objetivos arid3b en muchos procesos.
arid3b regula la expresión génica
A continuación quiso identificar arid3b genes regulados que son involucrada en el crecimiento del tumor se aislaron células de un modelo de ratón de cáncer de ovario. Se inyectaron células Skov3IP que expresan la proteína roja fluorescente (RFP) o 6XHis-arid3b y RFP en ratones desnudos. Los tumores se dejaron crecer. Hemos recogido el líquido ascítico o lavados peritoneales de Skov3IP-6XHis-arid3b o Skov3IP-RFP xenoinjertos ascitis como se describe [3]. ARN se recogió de las ascitis maligna forman los ratones portadores de tumores Skov3IP-arid3b o lavados peritoneales de ratones con tumores Skov3IP-RFP. el análisis de microarrays se llevó a cabo utilizando un Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2. En este experimento hubo 813 genes con una mayor expresión en respuesta a arid3b, y 201 genes con una menor expresión (S2 tabla). Un cálculo más estricta de genes "altamente modificados" (basado en la normalización RMA con Tasa de Falso Descubrimiento de menos de 5%) produjo 132 genes con una mayor expresión, y 39 con disminución de la expresión. Al igual que en nuestros datos chip-chip, estos resultados fueron filtradas por los términos de GO. Entre los genes que son inducidos son arid3b 44 genes de muerte celular, 13 genes de desarrollo del corazón, 17 genes de desarrollo neural, 37 genes de división celular, y 9 genes de células madre (Tabla 2). De acuerdo con nuestros datos de chip-chip, varios genes que hemos identificado como objetivo arid3b directos fueron inducidos por la expresión arid3b incluyendo NOTCH2, CASP1, CENPN, y cenpk. Un análisis estadístico de la distribución GO plazo encontró que en metafase y centrómero asociado términos fueron significativamente sobrerrepresentados entre los genes regulados positivamente por arid3b, mientras que los términos de desarrollo de las neuronas eran excesivamente representados entre los genes regulados por arid3b (S3 Tabla).
la caracterización del sitio de unión arid3b
el sitio de unión consenso de arid3a paralogue de arid3b se había demostrado que ser "AATTAA" [5]. Como se describió anteriormente, las secuencias genómicas vinculados por arid3b se obtuvieron por ChIP-Chip. Estas secuencias se analizaron mediante dos algoritmos motivo de la búsqueda separadas (MEME [32] y ALLEGRO [34]) para encontrar un motivo común rica en AT. Ambos métodos produjeron un motivo de unión de consenso "TGGGATTACAG." (Figura 2) Para demostrar la funcionalidad de este motivo computacionalmente derivados, se realizó un chip para detectar la unión de las regiones reguladores de los genes identificados a través de chip-chip de arid3b. La unión a las regiones reguladoras de estos genes se determinó usando cebadores qPCR diseñados para amplificar una región 200-300bp que contiene uno o más sitios de unión putativos arid3b que hemos identificado bioinformatically. muestras de chip se prepararon a partir Skov3IP y OVCA429 células de cáncer de ovario, utilizando ambas líneas parentales y las líneas celulares que expresan 6XHis-arid3b (Fig 1). Se seleccionaron los genes diana para la validación basada en los datos de chip-chip, y la importancia biológica del gen. Los genes diana seleccionados fueron divididos en 4 categorías de ontología de genes: la señalización de Wnt (Wnt5A, FZD5, MYC, APC) (Figura 3A), la célula asociada a la muerte (NOTCH2, CASP1, LPAR1, y RIPK) (figura 3B), la división de la célula (CENPN, cenpk, NUSAP, y CEP55) (figura 3C), y la señalización de EGFR (EGFR y BTC) (Fig 3D). Para cada región, los resultados qPCR de arid3b ChIP se normalizaron a una muestra de ADN de entrada, y se compararon con un control negativo (IgG). Como se muestra en la figura 3, las regiones de destino casi todos seleccionados mostraron arid3b unión sustancialmente por encima del control negativo en al menos una línea celular. La unión relativa en arid3b ChIP respecto al control negativo equivalente era generalmente mucho mayor en las células que sobreexpresan arid3b, en comparación con las líneas celulares parentales (Fig 3). Se encontraron resultados similares cuando se realizan chip en células de alto grado seroso de ovario cáncer (OVCAR3), con una unión significativa arid3b encontrado que Wnt5a, RIPK, BTC, y APC (Figura 3E).
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP), seguido por qPCR se realizó en células parentales y 6XHis-arid3b Skov3IP y OVCA429 para detectar la unión de arid3b para apuntar genes en las vías de clave. Todos los números se presentan como unión relativa en comparación con la muestra de ADN de entrada correspondiente. Los corchetes indican que la unión en muestras arid3b-chip es significativamente más alta que la muestra correspondiente fondo (IgG) (* p-valor & lt; 0,05, ** - valor de p & lt; 0,005). N = 3. Se validó arid3b unión a los genes con los términos de ontología de genes (GO) en relación con (A) de señalización Wnt, (B) de la muerte celular y la apoptosis, o la división celular (C) o (D) la señalización del EGFR. (E) resultados similares en el chip línea celular de cáncer de ovario seroso de alto grado OVCAR3.
arid3b altera la expresión de los genes en las vías celulares clave
A continuación hemos comprobado si la expresión arid3b altera la expresión de los genes diana putativos. la expresión exógena de arid3b aumento de genes en el Wnt y vías de señalización EGF mediante qRT-PCR. En OVCA429 células, APC, FZD5, MYC, y EGFR son inducidos por arid3b. En las células Skov3IP, arid3b aumenta FZD5, MYC, BTC, y EGFR (Figura 4A). La inducción consistente de FZD5 y MYC es especialmente interesante, teniendo en cuenta que ambos se expresan con frecuencia en niveles elevados en células de cáncer de ovario en comparación con las células epiteliales de la superficie del ovario inmortalizadas (IOSE398) (Fig 4B y 4C). Además, se confirmó que arid3b induce la expresión de muchos objetivos previsto: arid3b NOTCH2 upregulated, SORBS1, y CASP1 en líneas celulares Skov3IP (Figura 4D). Estos genes se consideraron de interés debido a sus términos de ontología de genes. Arid3b también se une varios metafase y genes centrómero-asociado (Tabla 1). Se confirmó la unión de arid3b a las regiones reguladoras en CEP55, CENPN, y cenpk utilizando chip (figura 3C). En OVCA429 células, CEP55 y CENPN son upregulated significativamente por arid3b (Fig 4E).
(A) QRT-PCR se realizó para los genes diana en las células parentales OVCA429 y Skov3IP y células OVCA429 y Skov3IP expresan 6xHis-arid3b. N = 5 (B y C) QRT-PCR se llevó a cabo en el ARN total preparado a partir IOSE398 y un panel de líneas celulares de cáncer de ovario para medir la expresión de genes diana putativo arid3b FZD5 y MYC. N = 3 (D) QRT-PCR análisis de las células parentales Skov3IP, Skov3IP-6XHis-arid3b, y las células Skov3IP-RFP. N = 3 Análisis (E) QRT-PCR sobre OVCA429 células parentales, 6XHis-arid3b, y RFP que expresan OVCA429 células. N = 4. * = p & lt; 0,05, ** = p & lt; 0.005 (F) de Western Blot utilizando lisados OVCA429, Ovča-6xHis-arid3b, SKOV3 y células Skov3-6xHis-arid3b para FZD5. N = 2.
Dado que la señalización Wnt está implicada en muchos tipos de tumores como el cáncer de ovario que investigarse más a la regulación de FZD5 por arid3b. Upregulation de FZD5 se confirmó por Western blot (Fig 4F) en el que la expresión de proteínas de FZD5 aumentó 9 veces en OVCA429 células y 2,8 veces en las células SKOV3 en respuesta a la expresión de 6xHis-arid3b. Esto demuestra que regula arid3b FZD5
in vitro
.
Para apoyar aún más el papel de arid3b en la regulación de la expresión génica, OVCA429 células fueron transfectadas con vectores que expresan Cas9 nucleasa y guía RNAs CRISPR dirigidos arid3b. pérdida significativa de la expresión arid3b se confirmó por Western blot (Fig 5A) y mutaciones de desplazamiento del marco se verificaron por secuenciación (datos no mostrados). La expresión de genes diana arid3b se midió utilizando qPCR como antes, la comparación de células con OVCA429 arid3b CRISPR-editado contra OVCA429 células que contienen un control Cas9 y revueltos sgRNA vector. Hemos encontrado un descenso significativamente la expresión de EGFR en las células CRISPR-editado (figura 5B), y lo mismo para los objetivos pro-apoptóticos TRADD y el receptor TNFR2 TNF, que nuestro laboratorio ha verificado previamente que se upregulated por arid3b [23].
(a) Western blot usando lisado de células enteras a partir de células OVCA429 y OVCA429 arid3b CRISPR, con detección de arid3b. N = 2. (B) QRT-PCR se realizó para EGFR, TRADD, y TNFR2 en el ARN total de las células transducidas con OVCA429 Cas9 nucleasa y un control mezclado CRISPR ARN guía, y OVCA429 células con arid3b editado por vectores de CRISPR dirigidos. (C) QRT-PCR se realizó para arid3b en OVCA429-GFP y OVCA429 células clasificadas por medio arid3b-GFP o alta expresión arid3b-GFP. (D) QRT-PCR se realizó para EGFR, TRADD, TNFR2, TNF, y TRAIL en OVCA429-GFP, OVCA429 medio arid3b-GFP, y OVCA429 pilas de gran arid3b-GFP. N = 3. * = p & lt; 0,05.