Extracto
Antecedentes
Achaete escudo 2 similar (ascl2), un básico hélice-bucle-hélice (bHLH) factor de transcripción, controla el destino de las células madre intestinales. Sin embargo, se desconoce la función de ascl2 en las células progenitoras de cáncer de colon. La línea celular HT-29 (47,5-95% de CD133
+ población) y LS174T (0,45% de CD133
+ población) fueron elegidos para la evaluación funcional de ascl2 en las células progenitoras del cáncer de colon después de gen desmontables de interferencia por ARN .
Metodología /Principales conclusiones
La inmunohistoquímica demostraron que ascl2 fue significativamente superior en los adenocarcinomas colorrectales. Regulación a la baja de ascl2 utilizando la interferencia de ARN en HT-29 y LS174T células de adenocarcinoma de colon cultivadas reducción de la proliferación celular, la capacidad de formación de colonias, la invasión y la migración in vitro, y resultó en la detención del crecimiento de xenoinjertos de tumores in vivo. El nivel de proteína en ascl2 CD133
+ células HT-29 fue significativamente mayor que en CD133
- células HT-29. ascl2 bloqueo a través de la interferencia shRNA en células HT-29 (shRNA-ascl2 /células HT-29) resultó en 26,2% de tinción de las células CD133
+ en comparación con 54,7% en el control shRNA-Ctr /HT-29 células. Los niveles de genes asociados 'stemness', tales como CD133, Sox2, Oct4, LGR5, Bmi1, y C-myc, se redujo significativamente en shRNA-ascl2 /HT-29 y shRNA-ascl2 /LS174T células in vitro, así como en el xenoinjerto de tumor correspondiente (CD133 no se realizó en células shRNA-ascl2 /LS174T). El shRNA-ascl2 /HT-29 células tenían capacidades inhibidos para formar tumorspheres comparación con el control. Los microRNA (miRNA) microarrays, identificaron 26 miRNAs hasta reguladas y 58 miRNAs-regulado en el shRNA-ascl2 /células HT-29. Los niveles de expresión de let-7b, miRNA-124, miRNA-125 ter, miARN-17, miARN-20a y miRNA-302b, que participan en la regulación de la 'stemness', se cuantificaron con qPCR, que confirmó sus identidades. La restauración de los genes miARN-302b, a través de su mímica, llevó a la restauración de las características del shRNA-ascl2 /'stemness' HT-29, incluyendo tumorsphere formación y 'stemness' niveles de genes asociados, y la recuperación de comportamientos celulares, incluyendo la capacidad de formación de colonias , la invasión y la migración in vitro.
Conclusiones /Importancia
ascl2 puede ser un objetivo potencial para la inhibición de las células progenitoras del cáncer de colon, y funciona a través de un mecanismo relacionado con el miR-302b.
Visto: Zhu R, Yang Y, Tian Y, Bai J, Zhang X, X Li, et al. (2012) ascl2 desmontables resultados en la detención del crecimiento tumoral por miARN-302b-Relacionada La inhibición de las células del cáncer de colon progenitoras. PLoS ONE 7 (2): e32170. doi: 10.1371 /journal.pone.0032170
Editor: Ilya Ulasov, Universidad de Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Octubre, 2011; Aceptado: January 21, 2012; Publicado: 23 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Zhu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la Fundación Estatal para las Ciencias Naturales de la República Popular de China 81000154 (YY) y el Proyecto de la Fundación de Ciencias Naturales de CQ CSTC 2008BA5034 (a RW). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR), la tercera causa principal de muerte por cáncer en el mundo y una causa principal de morbilidad y mortalidad en los países desarrollados [1], representa un gran reto terapéutico para el cáncer. Recientemente, se ha propuesto el (CSC) hipótesis de las células madre de cáncer de explicar la heterogeneidad funcional y la carcinogénesis del cáncer. De acuerdo con este modelo, una subpoblación de células cancerosas, que exhiben características tallo-como, sostener la formación de tumores, metástasis y resistencia a la terapia [2] - [5]. A este respecto, se espera que las CSC de tener un fenotipo /progenitoras de células madre similares (generalmente referido como "stemness"). Además, varios estudios han investigado los genes codificantes de proteínas y sus productos que participan en el mantenimiento stemness y tumorigenicidad de células progenitoras del cáncer de colon [6] - [8]. Por lo tanto, es importante identificar los mecanismos de regulación y vías de señalización implicadas en el cáncer de colon células progenitoras para desarrollar nuevos reactivos para orientar el cáncer de colon población de células progenitoras refractaria [9].
Achaete escudo 2 similar (ascl2) , un factor de transcripción hélice-bucle-hélice básico (bHLH), es una diana aguas abajo de la señalización Wnt en las células madre intestinales. La hibridación in situ demostró expresión ascl2 en la base de las pequeñas y grandes criptas intestinales, pero la falta de expresión en otros tejidos normales, excepto placenta [10]. Los resultados combinados de estos experimentos ganancia y pérdida de función implican que ascl2 controla el destino de las células madre intestinales [11]. Varios grupos han demostrado que ascl2 se sobre-expresa en cáncer colorrectal [10], [12], [13]. Además, ascl2 sobre-expresión tiene el potencial para cambiar la jerarquía de las células madre y progenitoras dentro de metástasis hepáticas que resulta en la auto-renovación en lugar de la diferenciación, afectando potencialmente el comportamiento clínico de estos tumores [13]. Por lo tanto, ascl2 puede ser un factor regulador que controla el destino de las células progenitoras de cáncer de colon. Durante la última década, una serie de vías de desarrollo que regulan los CAC se han dilucidado [14] - [17]. Sin embargo, el papel de ascl2 en las células progenitoras de cáncer de colon sigue siendo desconocido.
La línea celular HT-29 tiene un CD133
+ población de 47,5 a 95% en la literatura [18], [19] y aislados CD133
+ células de la línea celular de cáncer de colon HT-29 exhiben un mayor potencial tumorigénico de CD133
- células en el ensayo de formación de tumor in vivo [20]. La proteína CD133 fue reconocida primero como un marcador de superficie de células madre hematopoyéticas [21], más tarde, se usa para reconocer las células madre de cáncer en muchos tumores sólidos que surgen en, por ejemplo, de mama [22], páncreas [23], el hígado [ ,,,0],24] y de colon [18], [19]. La línea celular LS174T tiene un CD133
+ población de 0,45% en la literatura [20] y 0,1% en nuestro experimento (datos no mostrados). De esta manera se eligieron las células HT-29 y LS174T para la evaluación funcional de ascl2 en las células progenitoras del cáncer de colon después de gen desmontables de interferencia por ARN
.
Los microARN (miRNA) son cruciales como reguladores post-transcripcional de la expresión génica y participa en varios funciones biológicas, incluyendo la proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis [25]. miRNAs también contribuyen a preservar stemness de células madre embrionarias y células madre cancerosas humanas [26] - [28]. La investigación de la función de ascl2 sobre las células progenitoras de cáncer de colon y los perfiles de expresión de genes miARN es crucial para dilucidar las características de las células progenitoras de cáncer de colon, lo que beneficiará el desarrollo de nuevos fármacos o métodos terapéuticos que se dirigen a las células progenitoras de cáncer de colon. Además, proporcionará nuevos conocimientos sobre los métodos para erradicar el cáncer de colon debido a la probabilidad de que la erradicación de las células progenitoras de cáncer de colon será un paso fundamental en el logro de una cura para el cáncer de colon.
En este informe, demuestran el bloqueo selectivo de ascl2 en células HT-29 y LS174T podría inhibir el crecimiento celular, la invasión y la migración in vitro, y dar lugar a la detención del crecimiento in vivo, que está parcialmente relacionado con la inhibición relacionada con los genes miARN-302b de 'stemness' de progenitor cáncer de colon células a partir de los experimentos de shRNA-ascl2 /HT-29 transfectadas con los genes miARN-302b mímica. Estos resultados indican que ascl2 podría ser un objetivo potencial en las células progenitoras de cáncer de colon para el desarrollo de nuevas terapias para la erradicación de los cánceres de colon.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
líneas de colon de células de adenocarcinoma humano se obtuvieron HT-29 y LS174T de la American Type Culture Collection (ATCC) y se mantuvieron en medio de McCoy 5A (Sigma, EE.UU.) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS; HyClone, EE.UU.) a 37 ° C y 5% de CO
2, con el medio de cambió cada dos días. Las células se pasaron a 80% de confluencia y se sembraron a 30% de confluencia para el mantenimiento de las condiciones óptimas en proliferación.
ARN de interferencia
La secuencia, CCGCGTGAAGCTGGTGAAC, la orientación ascl2 (shRNA-ascl2 /EGFP) [11 ] fue formado a partir de dúplex de ADN que consiste en 5 'CACCGCCGCGTGAAGCTGGTGAACTTCAAGACGGTTCACCAGCTTCACGCGGTTTTTTG-3', 5'-AGCTCAAAAAACCGCGTGAAGCTGGTGAACCGTCTTGAAGTTCACCAGCTTCACGCGGC-3 '.
se utilizó un pGenesil-1,1 sin inserto de control (shRNA-Ctr /EGFP). Los dúplex de ADN hibridados fueron clonados en el plásmido de pGenesil-1,1 digerido con la enzima de restricción Eco31I. células HT-29 y LS174T fueron transfectadas con shRNA-ascl2 /EGFP o vector shRNA-Ctr /EGFP, y luego seleccionaron con 0,8 mg /ml de G418 de células HT-29 transfectadas y 0,4 mg /ml de G418 para las células transfectadas LS174T, comenzando 48 horas después de la transfección. Dos semanas más tarde, las células se mantuvieron en 0,4 mg /ml G418 para células HT-29 transfectadas y 0,2 mg /ml G418 para células transfectadas LS174T hasta que se establecieron tres clones independientes estables transfectadas. La interferencia de ARN se mantuvo estable durante todo el lapso de experimentos bajo la presión de selección de 0,4 mg /ml G418 para células HT-29 transfectadas y 0,2 mg /ml G418 para células LS174T transfectadas en el medio de cultivo.
Ensayo de proliferación
la proliferación celular se examinó en los días 1, 2, 3 y 4. Las células aisladas se sembraron a 1 x 10
4 células /pocillo en placas de 96 pocillos (Corning, EE.UU.) en un volumen final de 100 l de medio de cultivo por pocillo. En cada punto de tiempo, se añadió 5 mg /ml de MTT (Sigma, EE.UU.) para el medio de cultivo (20 l /pocillo) y se incubaron durante 4 horas adicionales a 37 ° C en 5% de CO
2 atmósfera para permitir MTT a convertirse en cristales de formazán. Después de eso, los cristales de formazan se solubilizaron con 150 l de DMSO (Sigma, EE.UU.) durante 10 min. La absorbancia se midió a una longitud de onda de 490 nm con un lector de microplacas (Thermo, EE.UU.). Todos los ensayos se repitieron tres veces.
Colonia Ensayo de Formación
Las células se sembraron a una densidad de 1000 células por placa (35 mm, Corning, EE.UU.) y luego se incubaron a 37 ° C bajo 5 % de CO
2. El medio se cambió cada 3-4 días. En día 20, las células se tiñeron con Giemsa y se observaron bajo un microscopio invertido. Se contaron el número de colonias en cada placa. El experimento se repitió tres veces y se expresó como el número medio de colonias por placa.
In Vitro Ensayo de Invasión
La capacidad de invasión in vitro de las células se midió usando las cámaras transwell recubiertas con Matrigel (Corning, EE.UU.) de ensayo. Las células se sembraron en 100 l a una densidad de 1 × 10
6 células /ml con 1% de FBS en la cámara superior y la cámara inferior se llenó con 600 l de medio de cultivo con 20% de FBS como un quimioatrayente. Transwells fueron incubadas a 37 ° C bajo 5% de CO
2 para 48 h para permitir que las células invaden. Al final de la incubación, las células en el lado superior del filtro revestido con Matrigel se eliminaron frotando con un hisopo de algodón. Las células que habían invadido a través del filtro revestido con Matrigel se tiñeron con solución de cristal violeta. Las células invasoras que migraron a través del filtro recubierto con Matrigel a la superficie inferior se contaron bajo un microscopio de luz invertida (Olympus, Japón), a 200 × magnificación. Las células en cinco campos aleatorios de vista en 200 × se contaron y se expresaron como el número medio de células por campo de visión. El experimento se repitió tres veces.
Migración
HT-29, células LS174T y sus transfectantes, en el 90-100% de confluencia en placas de 6 pocillos, se cultivaron durante la noche en medio libre de suero . El medio se reemplazó con PBS, y las monocapas fueron heridos mecánicamente usando una esterilizado, hoja de afeitar de un solo filo. Después de la herida, las células se lavaron dos veces con PBS esterilizada y se incubaron en medio 5A de McCoy que contenía 10% de FBS durante 48 horas a 37 ° C, bajo 5% de CO
2. Las células que habían migrado desde el borde heridos se contaron a 200 × magnificación utilizando un microscopio de luz invertida (Olympus, Japón). Las células en 5 campos aleatorios de vista en 200 × y se expresó como el número medio de células por campo de visión. El experimento se repitió tres veces.
Ensayos
Tumorsphere de formación de
Para tumorsphere formación, una sola célula suspensiones fueron suspendidas en un Modificado Medio /F12 de Eagle de Dulbecco (DMEM /F12, Hyclone, EE.UU.) suplementado con B-27 (1 x, Gibco), 20 ng /ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF, Peprotech, EE.UU.), y 20 ng /factor de crecimiento de fibroblastos básico ml (bFGF, Peprotech, EE.UU.), y luego se sembraron en 24 así placas de fijación ultra-baja (Corning, EE.UU.) a una concentración de 1000 células por pocillo. Las placas se analizaron 7-10 días más tarde para tumorsphere formación y se cuantificaron utilizando un microscopio invertido (Olympus) a 100 × 400 × y aumentos. Para la posterior cuantificación del número de células por tumorsphere, tumorspheres fueron recogidos con un tamiz de 40 um (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) y se disociaron con tripsina al 0,25% /0,02% de EDTA para hacer una suspensión de células individuales. Las células viables se contaron usando exclusión de azul de tripano.
En vivo tumorigenicidad
El shRNA-Ctr /HT-29, shRNA-ascl2 /HT-29, shRNA-Ctr /LS174T y shRNA -Ascl2 células /LS174T se resuspendieron en 100 l (1 × 10
6 células) de 0,9% de solución salina fisiológica antes de la inyección. Seis semanas de edad BALB /c ratones machos desnudos fueron adquiridos de la Animalario del Centro de Investigación de la Tercera Universidad Médica Militar y se mantuvieron en condiciones estándar. Todos los experimentos se realizaron con la aprobación del Comité de Ética Animal Studies de la Tercera Universidad Médica Militar (número de permiso: sw 20090713). Los ratones fueron inoculados por vía subcutánea con 1 x 10
6 células aisladas en ambos flancos (la izquierda con shRNA-ascl2 /HT-29 o células /LS174T shRNA-ascl2 y la derecha con shRNA-Ctr /HT-29 o shRNA-Ctr /células LS174T, respectivamente). Los tamaños de los tumores se midieron usando calibradores. tamaños de los tumores se calcularon utilizando la fórmula: (longitud x anchura
2) /2. Los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical en el día 20 después de la inoculación. Los injertos fueron retirados, documentadas por la fotografía y los pesos de los tumores medidos. Los tumores se dividen en dos grupos, y, o bien se fijaron con formalina al 10% o conservadas en -80 ° C.
La citometría de flujo de células de clasificación y análisis de citometría de flujo
Para el aislamiento de CD133
+ y CD133
- poblaciones dentro de las células HT-29, una sola célula suspensiones fueron incubadas con ficoeritrina (PE) y conjugado anticuerpo CD133 anti-humano (clon AC133; Miltenyi Biotec, Auburn, CA, EE.UU.) y FcR reactivo de bloqueo ( Miltenyi Biotec, Auburn, CA, EE.UU.) en solución de tinción que contenía BSA al 0,5% y EDTA 2 mM durante 10 minutos a 4 ° C. G1 inmunoglobulina de ratón del mismo isotipo (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, EE.UU.) sirvió como control negativo. Las células fueron analizadas y clasificadas con un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). Para la población positiva y negativa, la parte superior 10.8% de vivos o células teñidas fueron seleccionados los 7,6% de células teñidas débilmente inferior, respectivamente.
La inmunohistoquímica
Se realizaron estudios inmunohistoquímicos de ascl2 en la mucosa del colon humano (n = 11), carcinoma de colon (n = 11) y xenoinjertos tumorales de los ratones nude (n = 6), la mucosa del colon y el cáncer de los tejidos humanos eran de los mismos pacientes y todos los pacientes dieron su consentimiento informado. La parafina fue retirado de, tejido incluido en parafina y fijado en formalina; muestras se bloquearon a continuación y se incubaron con anticuerpos específicos durante la noche a 4 ° C. El anticuerpo se detectó mediante SP9002 Histostain ™ -Plus Kits (Zymed Co., EE.UU.). Todas las secciones se counterstained con hematoxilina. anticuerpo monoclonal de ratón ascl2 primaria (Tabla S1) se utilizó a una dilución de 1:100. Todos los experimentos se realizaron con la aprobación del Comité de Ética del Hospital Estudios del Suroeste, Tercera Universidad Médica Militar (número de permiso: sw 20090713).
inmunofluorescencia tinción
HT-29 y LS174T células, cultivadas en cubreobjetos esterilizados, se tiñeron con anticuerpo primario ascl2 (Tabla S1), seguido de incubación con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-R (Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, EE.UU.), la contratinción con DAPI, y finalmente se visualizaron bajo un barrido láser confocal microscopio de fluorescencia (Carl Zeiss, Inc. Alemania).
-PCR en tiempo real análisis
el ARN total fue extraído utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. cDNA de la primera cadena se sintetizó usando enzima primeScript ™ RT de la mezcla I, oligo dT y hexámeros aleatorios (Takara, Japón). Para determinar los cambios veces en cada gen, PCR en tiempo real se realizó utilizando la primera cadena de ADNc, cebadores directo e inverso, y el SYBR premezcla Ex Taq ™ verde II (Takara, Japón). Las secuencias de los cebadores se resumen en la Tabla S2. detección de reacción y la señal se midió por el sistema de PCR en tiempo real (BioRad, EE.UU.). Los niveles de expresión se calcularon como la relación de la expresión relativa en comparación con β-actina. La PCR en tiempo real se realizaron por triplicado de forma independiente.
ensayo de transferencia Western
Los lisados celulares o de los tejidos homogeneizados de xenoinjertos de tumores disueltos en tampón de muestra SDS, se separaron mediante SDS-PAGE y transferidos a nitrocelulosa membrana. El β-actina se utilizó como control. La membrana se sondó con el anticuerpo primario específico durante la noche a 4 ° C (los anticuerpos primarios se resumen en la Tabla S1), seguido de incubación con IgG conjugada con HRP secundaria (H + L) de anticuerpos (Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, EE.UU.) . Las transferencias se procesan con Immobilon ™ HRP sustrato quimioluminiscente occidental (Millipore, EE.UU.) y se analizaron mediante el sistema de análisis de imágenes de gel (BioRad, EE.UU.).
miARN análisis de microarrays y miRNAs cuantificación mediante PCR cuantitativa
se utilizó la sexta generación de microarrays miARN humanos (Exiqon, Dinamarca) para comparar los perfiles de expresión de los genes miARN entre shRNA-Ctr células shRNA-ascl2 /HT-29 /HT-29 y. El microarray contiene más de 1891 sondas de captura, que abarca todos los miRNAs humanos, ratones y ratas anotados en el miRBase 16.0. ARN total fue extraído de 1 × 10
7 transfectadas estables shRNA-Ctr /HT-29 y células utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, EE.UU.) shRNA-ascl2 /29-HT. ARN aislamiento, control de calidad, etiquetado y la hibridación se realizaron en Shanghai biochip KANCHENG Compañía de acuerdo con los protocolos del sistema de microarrays miARN. Las matrices fueron escaneados utilizando un escáner de microarrays, y las imágenes escaneadas fueron importados en el software GenePix Pro 6.0 (Axon) para la alineación de la red y la extracción de datos. miRNAs replicados se promediaron y miRNAs con intensidades de & gt; 50 en todas las muestras fueron elegidos para el cálculo del factor de normalización. datos expresados se normalizaron usando la mediana de la normalización. Después de la normalización, miRNAs expresados diferencialmente se identificaron a través del cambio de filtrado Fold. Jerárquica agrupación se realizó utilizando el software MEV (v4.6, TIGR).
Para la validación miRNAs qPCR, las secuencias de los cebadores para miRNAs se resumen en la Tabla S3. el aislamiento de ARN, control de calidad, cDNA sintetizan y qPCR se realizaron a Shanghai KANCHENG Biochip Company de acuerdo con los protocolos. Se utilizó una prueba t para identificar miRNAs expresados diferencialmente entre shRNA-Ctr /HT-29 y comparaciones /HT-29 shRNA-ascl2.
La transfección de genes miARN imita o inhibidores de miRNA en shRNA-ascl2 /HT-29 células
/células HT-29 shRNA-ascl2 se transfectaron 24 horas después de haber sido sembradas en placas de 6 pocillos. Los imitadores miARN (100 pmol) o inhibidores de miRNA (200 pmol) (Guangzhou Ribobio Co., Ltd. Guangzhou, República Popular de China) en 250 l de medio libre de suero, antibióticos-libres se mezclaron con 5 l de reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) se disolvió en 245 l del mismo medio y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 20 min. Las soluciones de transfección 500 l resultantes se añadieron a cada pocillo que contiene 1,5 ml de medio. Seis horas más tarde, cada pocillo se sustituyó con 2 ml de medio fresco suplementado con 10% FBS. Se recogieron las células transfectadas transitoria después de 48 horas adicionales de incubación para experimentos adicionales, incluyendo la formación tumorsphere, PCR en tiempo real, análisis de transferencia Western, ensayo de formación de colonias, ensayo de invasión y el análisis de la migración. El transitorio transfectaron shRNA-ascl2 /HT-29 células por medio de miARN imitan control negativo (100 pmol) o inhibidores de miRNA control negativo (200 pmol) se utilizaron como control.
Análisis estadístico
Para las variables continuas, los datos se expresaron como la media ± desviación estándar. Las diferencias entre grupos se calcularon mediante la prueba t y de medidas repetidas análisis de ANOVA de Student. Todas las diferencias se consideraron significativas a nivel de p & lt; 0,05, muy significativo en el nivel de p & lt; 0,01. Los análisis estadísticos se realizaron mediante el programa SPSS 13.0 para el paquete de software de Windows.
Resultados
ascl2 se sobreexpresa en el cáncer de colon y líneas celulares de cáncer de colon, y la interferencia ascl2 en células HT-29 y LS174T notablemente reducidos su expresión
la tinción inmunohistoquímica se utilizó para determinar si la proteína ascl2 se expresó en la mucosa del colon humano y el cáncer de colon. Se observó un aumento en la expresión de proteínas ascl2 en el núcleo de las células de cáncer de colon de los cánceres de colon humanos (Figura 1B) en comparación con la tinción específica de la proteína ascl2 en el núcleo de las células de base de las criptas de la mucosa de colon normal (Figura 1A). Las células con tinción positiva ascl2 en el núcleo de células se separaron por tinción negativa exactamente en la base de la cripta normal (Figura 1A). La tinción de inmunofluorescencia demostró que ascl2 se expresó principalmente en el núcleo de las células HT-29, y débilmente expresado en el citoplasma, mientras que, ascl2 se expresó principalmente en el citoplasma de las células LS174T, y débilmente expresado en el núcleo. Su patrón de expresión de ascl2 en células HT-29 y LS174T fue discordante, con la mayoría de HT-29 y células LS174T siendo relativamente débil para la expresión (Figura 1C). El análisis de transferencia Western demostró que ascl2 estaba presente en ambas líneas celulares de cáncer de colon HT-29 y células LS174T (20 kDa en ambos), pero ausente en MHCC-97L, una línea celular de cáncer de hígado (Figura 1D).
expresión ascl2 se localiza específicamente en el núcleo de las células de base de las criptas de mucosa normal de colon humano (punta de flecha) (a), B demuestra que ascl2 se expresa específicamente en el núcleo de las células de cáncer de colon humano en tejidos de cáncer de colon humano (aumento original de panel superior de A y B: 200 ×; Aumento original de baja del panel de A y B: × 400). La tinción de inmunofluorescencia indica ascl2 situado principalmente en el núcleo de las células HT-29 y el citoplasma de las células LS174T (C) (Aumento original: x 200). El análisis de transferencia Western muestra ascl2 está presente en las células LS174T HT-29 y, pero ausente en las células MHCC-97L (D). interferencia ascl2 en células HT-29 y LS174T resultados en la reducción significativa de ambos ARNm ascl2 analizado por PCR en tiempo real y los niveles de proteína analizados por análisis de transferencia Western con relación al control (β-actina) (**: p & lt; 0,01) (E y F).
Para tumbar expresión ascl2 en células HT-29 y LS174T, las células fueron transfectadas con shRNA-ascl2 /EGFP y vectores /EGFP shRNA-CTR, cuatro líneas celulares estables transfectadas ( shRNA-ascl2 células /LS174T shRNA-CTR /HT-29, shRNA-ascl2 /LS174T, shRNA-Ctr /HT-29 y) se establecieron. mRNA ascl2 cuantificados con PCR en tiempo real se redujo en las células /LS174T shRNA-ascl2 shRNA-ascl2 /HT-29 y en comparación con sus controles (Figura 1E). Se observó una reducción correspondiente en la proteína ascl2 en células /LS174T shRNA-ascl2 shRNA-ascl2 /HT-29 y en comparación con sus controles (Figura 1f). No hubo diferencia significativa entre shRNA-Ctr /HT-29 y las células no transfectadas HT-29, y entre shRNA-Ctr /LS174T y células LS174T no transfectadas, tanto en mRNA ascl2 y expresión de la proteína (Figura 1E y 1F).
El silencio de ascl2 en células HT-29 y LS174T conducido a alteraciones en los comportamientos celulares
ensayo de formación de colonias: shRNA-ascl2 /HT-29 y células /LS174T shRNA-ascl2 desarrollaron un menor número de colonias después de 20 días en comparación con sus controles (p & lt; 0,05) (Figura 2A). Ensayo de proliferación: Las tasas de proliferación de shRNA-ascl2 /HT-29, shRNA-ascl2 /LS174T y sus controles fueron examinadas usando un método MTT, de acuerdo con el protocolo del fabricante, a partir de los días 1 a 4 después de la siembra. Como se muestra en la Figura 2B, hubo diferencias significativas en las tasas de crecimiento entre /HT-29 y las células shRNA-ascl2 HT-29, y entre shRNA-ascl2 /HT-29 y shRNA-Ctr /HT-29 células en los días 3 y 4, también entre las células shRNA-ascl2 /LS174T y LS174T, y entre shRNA-ascl2 /LS174T y células shRNA-Ctr /LS174T en los días 3 y 4 (p & lt; 0,05). En ensayo de invasión in vitro: Invasión ensayos se realizaron con cámaras de cultivo transwell recubiertas con Matrigel. Después de 48 horas de incubación, se contaron el número de células invasoras. Con shRNA-ascl2 /células HT-29, de 7 ± 3 células por campo (menos de 200 × magnificación utilizando el microscopio invertido) invadido a través de la membrana. Este número fue significativamente menor que la de las células no transfectadas HT-29 (37 ± 5) y /o células HT-29 shRNA-Ctr (31 ± 6) (P & lt; 0,01). Del mismo modo, con células LS174T shRNA-ascl2 /, 84 ± 14 células por campo (menos de 200 × magnificación utilizando el microscopio invertido) invadido a través de la membrana. Este número fue significativamente menor que la de las células no transfectadas LS174T (292 ± 32) o shRNA-Ctr /células LS174T (296 ± 30) (P & lt; 0,01) (Figura 2C). Migración: Por último, las células por campo (menos de 200 aumentos) 75 ± 10 shRNA-ascl2 /29 HT-movió a través del borde de raspado después de 48 horas. Este número fue significativamente menor que la de las células no transfectadas HT-29 (185 ± 15) o shRNA-Ctr células (195 ± 25) (p & lt; 0,05) /29 HT-. células de 82 ± 9 shRNA-ascl2 /LS174T por campo (menos de 200 × ampliación) se movieron a través del borde raspada después de 48 horas. Este número fue significativamente menor que la de las células no transfectadas LS174T (177 ± 21) o células /LS174T shRNA-Ctr (173 ± 25) (p & lt; 0,05). (Figura 2D)
shRNA-ascl2 /HT- 29 y shRNA-ascl2 /células LS174T tienen un menor número de colonias (*: p & lt; 0,05) (A), las tasas más bajas de crecimiento (*: p & lt; 0,05) (B), menos células invadidas a través de la membrana recubierta con Matrigel (**: p & lt ; 0,01) (C) y menos células que migran a través del borde raspado (*:. p & lt; 0,05) (D), en comparación con sus controles (Aumento original: × 200) guía empresas
interferencias ascl2 llevó a la detención del crecimiento in vivo de tumores
para comparar las tasas de crecimiento del shRNA-Ctr /HT-29 y /células shRNA-ascl2 HT-29, shRNA-Ctr /LS174T y células /LS174T shRNA-ascl2, en atímicos ratones desnudos, el shRNA-ascl2 /HT-29 o shRNA-ascl2 /células LS174T se inyectaron en el flanco izquierdo mientras que las células /LS174T shRNA-Ctr /HT-29 o shRNA-Ctr se inyectaron en el flanco derecho, respectivamente. Veinte días después de la inoculación con cada uno de las células pareadas (shRNA-ascl2 /HT-29 y shRNA-Ctr /células HT-29 en la figura 3A, o shRNA-ascl2 /LS174T y células /LS174T shRNA-CTR (resultados no mostrados)) en cada de ratón, respectivamente, todos los ratones (12/12, respectivamente) desarrolló tumores. volúmenes de los tumores se midieron usando calibradores a diversos puntos de tiempo antes de la muerte, mientras que los pesos se determinaron después de la muerte. El volumen y la masa en los tumores /HT-29 o shRNA-ascl2 /LS174T shRNA-ascl2 fueron significativamente más bajos que el de los tumores shRNA-Ctr /HT-29 o shRNA-Ctr /LS174T (p & lt; 0,05) (Figura 3B y 3C). Además, la expresión ascl2 en el tejido tumoral a partir de células /LS174T shRNA-ascl2 /HT-29 o shRNA-ascl2 fue significativamente menor que la de las células /HT-29 o shRNA-Ctr /LS174T shRNA-Ctr, como se determina por el tiempo real PCR y análisis de transferencia Western (Figura 3D y 3E). expresión ascl2 en el tejido tumoral de shRNA-ascl2 /HT-29 o células /LS174T shRNA-ascl2 fue significativamente más bajo que el de las células /LS174T shRNA-Ctr /HT-29 o shRNA-Ctr, como se muestra por tinción inmunohistoquímica (Figura 3F) .
Todos los ratones (6/6, respectivamente) desarrollan tumores de 20 días más tarde después de 1 × 10
6 shRNA-Ctr células /HT-29 (lado derecho y marcado como flecha) y shRNA-ascl2 /células HT-29 (lado izquierdo y marcado como cabeza de flecha) se inocularon en ratones desnudos (A), no se demostró que las células LS174T. El volumen del tumor (B) y el peso de la masa (C) en el grupo de células /LS174T shRNA-ascl2 /HT-29 y shRNA-ascl2 es significativamente menor que el grupo de shRNA-Ctr /HT-29 y shRNA-Ctr /LS174T células (*: p & lt; 0,05). El ARNm (D) y la proteína (E) niveles de ascl2 en los tejidos tumorales desarrollan a partir de shRNA-ascl2 /HT-29 y shRNA-ascl2 /células LS174T son más bajos que en los tejidos tumorales desarrolladas a partir de shRNA-Ctr /HT-29 y shRNA-Ctr /células LS174T (**: p & lt; 0,01). inmunotinción ascl2 en el núcleo de las células cancerosas en xenoinjertos de tumor de células /LS174T shRNA-Ctr /HT-29 y shRNA-Ctr es más fuerte que en el núcleo de las células cancerosas en xenoinjertos de tumor de shRNA-ascl2 /HT-29 y shRNA -Ascl2 células /LS174T (F) guía empresas
ascl2 expresión de CD133
+ y CD133
-. células HT-29
citometría de flujo El análisis indicó CD133 se expresa en 58,1% de las células HT-29, con las células de 0,1% HT-29 se detectó en el control negativo. 98,6% de las células se confirmó que CD133 positivas en la parte superior un 10,8% de las células CD133 positivas HT-29 por postsorting selección, el 98,1% de las células se confirmó que CD133 negativo en el tenuemente 7,6% de las células HT-29 negativos CD133 (figura 4A).
CD133 se expresa en el 58,1% de las células HT-29. 98,6% de las células se confirmó que CD133 positivas por selección posterior a la clasificación en la parte superior un 10,8% de CD133
+ células HT-29, el 98,1% de las células se confirmó que CD133 negativo por la selección posterior a la clasificación en la tenuemente 7.6 % de CD133
- células HT-29 (A). proteína ascl2 nivel relativo de control (β-actina) en CD133
+ células HT-29 es significativamente mayor que la de CD133
- células HT-29 (*: p & lt; 0,05) (B). Hay una tinción nuclear evidente de ascl2 en CD133 29 HT-células
+, pero ascl2 es casi negativa en CD133
- células HT-29 (C) (Aumento original: x 200).
el CD133
+ y CD133
- se analizaron las células HT-29 para la expresión de ascl2 utilizando ensayos de Western blot. El nivel de proteína ascl2 relación al control (β-actina) en CD133
+ células HT-29 fue significativamente superior a la de CD133
- células HT-29 (P & lt; 0,05) (Figura 4B). El CD133
+ y CD133
- células HT-29 se immunostained con un anticuerpo anti-ascl2, lo que demuestra un patrón de tinción nuclear de ascl2 en CD133
+ células HT-29 (el panel superior de la Figura 4C), y una tinción insignificante para ascl2 en CD133
- HT-29 células (la baja del panel de la figura 4C) guía
el porcentaje de CD133
+ HT-29 células y marcadores '' stemness fueron notablemente. reducida tras ascl2 desmontables
la observación de que la expresión fue mayor en ascl2 CD133
+ células HT-29 que en CD133
- células HT-29, llevaron a la hipótesis de que la proteína es importante para ascl2