Extracto
Antecedentes
Una búsqueda exhaustiva de ADN metilado genes identificados genes supresores de tumores candidato que se han demostrado estar involucrados en el proceso de apoptosis de la
p53 vía
. En este estudio, se investigó
p53
mutación en relación con dicha alteración epigenética en el cáncer gástrico primario
Métodos
Los perfiles de metilación de los genes 3:.
PGP9
.
5
,
NMDAR2B
, y
CCNA1
, que están involucrados en la vía supresora de tumores p53 en combinación con
p53 mutación eran
examinado en 163 cánceres gástricos primarios. El efecto de la reversión epigenética en combinación con fármacos quimioterapéuticos sobre la apoptosis también se evaluó de acuerdo con el tumor
estado de p53
mutación.
Resultados
p53 gen
se encontraron mutaciones en 44 tumores gástricos primarios (27%), y super-alta metilación de cualquiera de los 3 genes sólo se encontró en los casos de tipo salvaje
p53
. Superior
aberración p53
vía se encontró en los casos con el sexo masculino (p = 0,003), tipo intestinal (p = 0,005), y el tipo no-infiltrante (p = 0,001). El
p53
grupo de la vía aberración exhibieron menos recurrencia en los ganglios linfáticos, órganos distantes, y el peritoneo que el
p53
grupo no aberración. En la línea celular de cáncer gástrico NUGC4 (
p53 de tipo salvaje
), epigenética tratamiento aumentada la apoptosis de los fármacos quimioterapéuticos, parcialmente a través de
p53
actividad de transcripción. Por otra parte, en la línea de KATO III de células de cáncer (
p53 mutante
), el tratamiento epigenético solo indujo apoptosis robusto, sin trans-activación de
p53
.
conclusión
En el cáncer gástrico,
p53
existen vías pertinentes y no pertinentes, y los tumores con cualquiera de los tipos vía exhibieron características clínicas únicas. tratamientos epigenéticos pueden inducir la apoptosis parcialmente a través de
p53
activación, sin embargo, sus efectos apoptóticos puede explicarse en gran medida por un mecanismo que no sea a través de
p53
vías
Visto:. Waraya M, Yamashita K, Ema a, Katada N, Kikuchi S, M Watanabe (2015) asociación exclusiva de
p53
mutación con super alta metilación de genes supresores de tumores en el
p53
Camino en un único gástrico Fenotipo cáncer. PLoS ONE 10 (10): e0139902. doi: 10.1371 /journal.pone.0139902
Editor: Qian Tao, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: Marzo 31, 2015; Aceptado: 18 Septiembre 2015; Publicado: 8 Octubre 2015
Derechos de Autor © 2015 Waraya et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la subvención-en Ayudas a la Investigación del cáncer del Ministerio de Salud, trabajo y Bienestar de Japón y por la Fundación japonesa para la Tratamiento multidisciplinar del cáncer. Los organismos de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida de datos, o el análisis; en la interpretación de los resultados; en la preparación del manuscrito; o en la decisión de enviar el manuscrito para su publicación
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
metilación del ADN desempeña un papel central en. el silenciamiento de genes de los genes supresores de tumores en el cáncer humano. Un gen metilación específica del cáncer es una entidad poco frecuente, y la aberración frecuente de metilación en los tejidos tumorales primarias es aún más raro [1, 2]. Hemos identificado los genes metilados específicos del cáncer en cada órgano utilizando un microarray farmacológica desenmascaramiento (PUM) [1, 2] y un PUM modificado [3-5]. Hemos identificado muchos genes supresores de tumores candidato (ETG), como
PGP9
.
5 Hoteles en la cabeza y el carcinoma de células escamosas del cuello (CECC) [2], de esófago SCC (CECA) [6] , cáncer gástrico [4], y otros tipos de cáncer [7],
NMDAR2B
en CECA [3] y el cáncer gástrico [8], y
CCNA1 Hoteles en HNSCC [2]. Los perfiles de metilación de estos genes han sido validados por otros grupos y /o incluso en otros tipos de cáncer [9-14]. Genes que mostraron más del 60% de metilación en los tejidos tumorales fueron designados como genes altamente relevantes metilados (HRMGs) [15]. Por otra parte, se comparó además la frecuencia de tales metilación aberrante de HRMGs candidatos con otros informes de cáncer gástrico [16], y los genes candidatos se redujeron a genes específicos.
Lo más importante, estos genes supresores de tumores candidato había sido informado de que en el
p53
vía supresora tumoral (figura 1). Por ejemplo,
PGP9
.
5 de
interactúa directamente con
p53
y estabiliza
p53 fotos: por inhibición de su degradación a través de la ruta de ubiquitinación en hepatocelular [17] , de mama [18], y el cáncer nasofaríngeo [19].
NMDAR2B
induce apoptosis a través de su interacción directa con
DAPK
[20], que, a su vez, se ha demostrado para contrarrestar transformación oncogén inducida por la activación de un
p19ARF
/
p53 dependiente de
puesto de control de la apoptosis [21].
CCNA1
es un
p53 inducida por
gen que media la apoptosis, G2 /M detención, y la catástrofe mitótica en renal humana, ovario y cáncer de pulmón de células [22]. Por lo tanto, el
p53
vía es destruida en los tejidos tumorales de cáncer primario de manera epigenética, junto con el tipo salvaje
p53
, sin embargo, no ha habido ningún informe con respecto a la asociación de
p53
mutación y epigenéticos alteraciones en los tejidos tumorales primarios.
en este estudio, se investigó el estado de metilación del ADN de los genes en el
p53
vía que son anormalmente regulada de manera epigenética en el cáncer gástrico primario, y se comparó su patrón de metilación con el
p53
estado de la mutación con el fin de determinar la importancia clínica de
p53
aberración fenotipos.
Métodos
líneas celulares y muestras de tejidos
las líneas celulares de cáncer gástrico, KATOIII, NUGC4, AZ521, y SH10 se adquirieron en el Centro RIKEN de bio (Ibaraki, Japón). Y la línea celular de carcinoma hepatocelular HepG2 se adquirió de American Type Culture Collection (Manassas, VA). Estas líneas celulares, excepto AZ521 y HepG2 se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA) suplementado con suero bovino fetal 10%. AZ521 y HepG2 se cultivaron en medio DMEM (GIBCO), suplementado con 10% FBS.
pares (n = 163) de, (FFPE) tejido tumoral fijado en formalina incluido en parafina y las correspondientes muestras de la mucosa normal obtenida en por lo menos 5 cm del borde del tumor fueron obtenidas de pacientes sometidos a cirugía entre el 1 de enero de 2000 y el 31 de diciembre de 2010. Todos los pacientes con estadio II /III GC se había sometido a una resección potencialmente curativa para la GC primaria, y se sometió a adyuvante S -1 quimioterapia después de la cirugía (S-1 tratamiento estándar). La terapia neoadyuvante no se realizó en esta cohorte de pacientes. Los tumores fueron clasificados de la clasificación TNM de acuerdo con el 7
ª edición de la Unión Internacional contra el Cáncer (UICC) y la 14
ª edición de la Clasificación japonesa de carcinoma gástrico (JCGC). características de los pacientes se muestran en la Tabla 1. Se recogieron todas las muestras de tejido en el Hospital de la Universidad de Kitasato, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes y donantes sanos antes de la recogida de muestras. El presente estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Kitasato.
Análisis de mutantes de p53
genes utilizando un solo polimorfismo de conformación de cadena sencilla (SSCP)
Las mutaciones en exones 5, 6, 7 y 8 de la
p53
gen se seleccionaron mediante análisis no radiactivo polimorfismo de conformación de cadena sencilla (SSCP), que se realizó a través de nuestros métodos previamente establecidos [23]. muestras de productos de PCR de 10 l se diluyeron tres veces con tampón de carga de gel (95% de formamida desionizada, 20 mmol /l de EDTA, 0,01% de azul de bromofenol, y 0,01% xileno cianol) y se calentó a 95 ° C durante 10 min, seguido por enfriamiento rápido sobre hielo. Partes alícuotas de 3 l se aplicaron a geles de poliacrilamida modificados (PAFG: 18% de poliacrilamida-bis (49: 1), TBE 0,5x, 10% de glicerol, 10% de formamida, persulfato de amonio al 0,05%, y 30 ml TEMED) de dimensiones 120 mm x 150 mm x 0,35 mm. La electroforesis se realizó con TBE 1,5x tampón de corrida a 500 V y 30 mA durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas se detectaron mediante tinción de geles usando una tinción de plata plus kit (Bio-Rad, Hercules, CA), seguido de la fijación, enjuague, el desarrollo, y la parada de la reacción. bandas mutadas detectados con PCR-SSCP fueron evidentes a 1:64 dilución de alelos mutados.
tratamiento con bisulfito del ADN extraído
ADN genómico a partir de tejidos FFPE y líneas celulares fue extraído utilizando el QIAamp DNA FFPE kit Tissue (QIAGEN Sciences, Maryland, MD) y el kit QIAamp DNA Mini (QIAGEN) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Para la desnaturalización del ADN, 2 g de ADN genómico se incubó con 5 g de ADN de esperma de salmón en /l de NaOH 0,3 mol durante 20 minutos a 50 ° C. A continuación, la muestra de ADN se diluyó con 500 l de una solución que contiene 2,5 mol /l de metabisulfito de sodio (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO) /125 mmol /l de hidroquinona (Sigma) /solución de hidróxido de sodio /l 0,4 mol, y se incubó a 70 ° C durante 1,5 horas. La muestra se aplicó a una columna (Asistente de ADN de limpieza del sistema, Promega Inc., Madison, WI), se incubaron con /l de NaOH 0,3 mol durante 10 minutos, y posteriormente se trató con acetato de amonio /l 3 moles por 5 minutos. La muestra se precipitó en etanol al 100%, y el ADN se resuspendió en 50 l de LoTE que contiene 10 mM Tris-HCl, pH 8 y 2,5 M de etileno diamina tetra acético (EDTA), pH 8, y se amplificó posteriormente por una cadena de la polimerasa reacción (PCR). resultados tratamiento con bisulfito en la modificación química de no metiladas, pero no metilados, citosinas a uracilos, lo que permite la distinción entre el ADN genómico metilado y no metilado.
-Quantitative PCR específica de metilación (MSP-Q)
Para el análisis de la metilación cuantitativa, TaqMan PCR específica de metilación (MSP-Q) se llevó a cabo usando el iQ ™ Multiplex Powermix (Bio-Rad) por triplicado en el iCycler iQ ™ sistema de detección de PCR en tiempo real (Bio-Rad). Las condiciones de PCR y las secuencias se proporcionan en la Tabla S1. Diluciones seriadas de bisulfito modificados CpGenome ADN metilado universal (Chemicon International, Temecula, CA) se usaron para construir la curva de calibración en cada placa como controles positivos de metilación y el ADN no metilado universal de CpGenome (Chemicon International) se utilizó como control negativo. El valor de metilación (valor TaqMeth) se define como la relación entre metilado
PGP9
.
5
,
NMDAR2B
,
CCNA1
, o
DAPK
normalizado a metilado
β-actina
, que luego se multiplica por 100.
tinción inmunohistoquímica de PGP9.5, NMDAR2B y CCNA1
para la inmunotinción, desenmascaramiento de antígeno se realizó con remojo autoclave, la actividad de peroxidasa endógena fue bloqueada por incubación en 3% H
2O
2 /metanol durante 5 minutos, y la unión de anticuerpos no específica fue bloqueada por incubación con 1% diluido suero de caballo normal para 30 minutos. Las secciones se incubaron a continuación a 4 ° C durante la noche con los siguientes anticuerpos: anticuerpo policlonal de conejo PGP9.5 (dilución de 1:. 200, Nonus Biogénesis), anticuerpo de conejo policlonal NMDAR2B (dilución de 1: 100, Millipore), o el ratón ciclina A anticuerpo monoclonal (6E6, dilución de 1:50, Leica Biosystems Newcastle. Ltd). Los complejos inmunes se detectaron con el kit Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA) según las instrucciones del fabricante. Estos complejos inmunes se detectaron usando el sustrato 3,3'-diaminobenzidina (Vector) como cromógeno (PGP9.5 1,5 minutos, NMDAR2B 6 minutos, CCNA1 10 minutos). Las secciones fueron contrastadas con hematoxilina.
Epigenético tratamiento con 5-Aza-dC y TSA, y el tratamiento quimioterapéutico con CDDP
Las células se dividieron y se sembraron a una densidad baja (1x10
6 /matraz T-75) 24 horas antes del tratamiento. Las células fueron entonces tratadas cada 24 horas durante 4 días, ya sea con 1 o 5 M 5-aza-2 'desoxicitidina (5-Aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) disuelto en ácido acético al 50% o fueron tratados mock con PBS incluyendo la misma cantidad de ácido acético. Como se ha indicado, 100 nM de trichostatinA (TSA; Sigma-Aldrich). Y /o 12,5 M de cis-diaminodicloroplatino (CDDP) (Nichi-Iko Pharmaceutical Co., Ltd., Japón) se añadió a las 24 horas finales
Western Blot análisis
proteína total fue extraído a partir de líneas celulares que fueron tratadas epigenetically con /sin tratamiento quimioterapéutico, y se sometió a análisis de transferencia de Western usando los siguientes anticuerpos: anticuerpo monoclonal anti-p53 de ratón (1C12, dilución de 1: 1000, Cell Signaling Technology, Inc.) o
anticuerpo monoclonal 2a de ratón anti-β-actina IgG (dilución de 1: 10.000, Sigma-Aldrich)
reportero de ensayo p53
Las células (2 x 10
4 células /placa de 96 pocillos) que fueron tratados epigenetically con /sin tratamiento quimioterapéutico se transfectaron con un
p53
vector informador (QIAGEN) utilizando kits Reporter señal ™ Pathway ( QIAGEN) y el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Después de 24 horas de incubación, se midió la actividad de reportero usando el sistema de ensayo Dual-Luciferase Reporter (Promega). Las transfecciones se realizaron por triplicado y se analizaron usando el software SoftMax Pro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Apoptosis ensayo
Las células tratadas (1x 10
5 células /muestra) se tiñeron con Anexina V y AAD 7-(reactivo Guava nexina, Guava Technologies, Hayward, CA) para la discriminación de células apoptóticas tempranas y tardías, respectivamente. El experimento se llevó a cabo utilizando el sistema PCA guayaba, realizado por triplicado y se analizó usando el software Cytosoft 2.1.5 (Guava Technologies).
El análisis estadístico
La prueba exacta de Fisher o la prueba de Mann-Whitney se utilizó la prueba para las variables categóricas, y estudiante de
t-test
se utilizó para las variables continuas. Los datos se expresan como media ± desviación estándar (SD). El método de Kaplan-Meier se utilizó para estimar las tasas de supervivencia acumulada, y las diferencias en las tasas de supervivencia se evaluó mediante la prueba de log-rank. la supervivencia libre de recaída (RFS) y la supervivencia global (SG) se midieron a partir de la fecha de la operación a la fecha de recurrencia y muerte, o el último seguimiento. Con respecto a la SSR o el sistema operativo, los pacientes que sobrevivieron durante más de 60 meses (5 años) se analizaron como sobrevivientes. P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Todos los análisis estadísticos se realizaron con los paquetes de software SAS (SAS Institute, Cary, NC).
Resultados
estado de metilación y los perfiles genéticos de p53
PGP9
.
5
,
NMDAR2B
,
CCNA1
, y
DAPK Hoteles en pStage II-III de cáncer gástrico
p53
se identificaron mutaciones en 44 de 163 pacientes con cáncer gástrico primario (27%) por análisis de SSPC.
mutación p53
gen no tenían relevancia pronóstica (figura 2A). A continuación, analizó los perfiles de metilación de
PGP9
.
5
,
NMDAR2B
,
CCNA1
, y
DAPK
en estos tejidos utilizando Q-MSP. El valor TaqMeth de todos los genes fue mayor en los tumores primarios de cáncer gástrico de tipo salvaje con
p53
que en aquellos con
p53
(orden de la metilación del gen mutante:.
PGP9
5 Hotel & gt;
NMDAR2B Hotel & gt;
CCNA1 Hotel & gt;
DAPK
) (figura 3A y S1 y S2 figuras). La metilación del promotor de ADN fue significativamente mayor para
CCNA1 gratis (p & lt; 0,0001) y
PGP9
5 gratis (p = 0,03), y marginalmente significativamente mayor para los
NMDAR2B gratis (p = 0,10) y
DAPK gratis (p = 0,05) en el cáncer gástrico primario en comparación con la mucosa normal correspondiente. Es importante destacar que un nivel de super-alta metilación de
PGP9
.
5
,
NMDAR2B
, y
CCNA1
se encuentra exclusivamente en tumores primarios sin
p53
de mutación, los valores TaqMeth de corte fueron de 50, 163, y 133, respectivamente (figura 3A). Tal súper alta metilación de
PGP9
.
5
,
NMDAR2B
y
CCNA1
se encontró en el 14, 19 y 8 muestras, respectivamente, y algunas de estas muestras se solapaban (Fig 3B).
DAPK
no mostraron esta tendencia, ya que el
DAPK
nivel de metilación fue bastante alta en los correspondientes tejidos normales de la mucosa de una porción considerable de los casos (S2) Fig.
(a) de acuerdo con
p53
estado de mutación del gen y (B) de acuerdo con el
p53
grupo aberración.
(a) la metilación de los genes indicados se analizó utilizando valores de Q-MSP y TAqMeth en los tumores con
p53 de tipo salvaje
fueron comparados con aquellos con
p53
mutación. El valor umbral para la determinación de que un gen se metilado se determinó como el valor máximo de TaqMeth
p53 de tipo salvaje
. (B) Los tumores con
p53 de tipo salvaje o
p53
mutación se compararon en cuanto a la presencia de super-alta metilación de los genes indicados. Super-alta metilación se define que al menos un gen mostró un mayor valor de cada TaqMeth valores de umbral entre los tres genes.
El análisis inmunohistoquímico de PGP9.5, NMDAR2N, y la expresión de la proteína en el cáncer gástrico CCNA1 primaria
la tinción inmunohistoquímica para PGP9.5, NAMDR2B y expresión de proteínas CCNA1 se llevó a cabo a continuación, tanto en los casos de super-alta metilación y aquellos con baja metilación de estos genes. Se observó una fuerte reducción en la expresión de PGP9.5, NMDAR2B y CCNA1 en tejidos de cáncer gástrico primario cuando el promotor de la metilación de ADN era súper alta (Fig 3). Por otro lado, no se encontró reducción en la expresión de la proteína de PGP9.5, NMDAR2B, o CCNA1 cuando el promotor de la metilación de ADN fue baja (Fig 4).
La tinción inmunohistoquímica de PGP9.5, NMADR2B, y CCNA1 en el tumor primario con o sin la hipermetilación de la región promotora del gen correspondiente (aumento original, X100, barras de escala, 100 m).
análisis clínico-patológica en el cáncer gástrico primario con el estadio patológico II /III cáncer gástrico con el tratamiento estándar
características clinicopatológicas y el pronóstico (RFS 5 años y OS) a continuación se analizaron de forma univariable en el cáncer gástrico con el estadio patológico II cáncer gástrico /III con el tratamiento estándar (cirugía más S- postoperatoria administración 1) (Tabla 1). Se clasificaron los pacientes con cáncer gástrico en 3 categorías en función de la
p53 estado de mutación
, así como el estado de metilación del ADN de
PGP9
.
5
,
NMDAR2B
y
CCNA1
, que hemos designado como categorías genómicas y epigenéticos, respectivamente (GEC). Estas tres categorías fueron
p53 mutante
,
p53 de tipo salvaje
con súper alta metilación (SHM) de los 3
genes p53
vía anteriores (
p53
WT /SHM), y
p53 de tipo salvaje y sin
(w /o) SHM (
p53
WT w /o SHM).
Curiosamente, los grupos de pacientes clasificado basandose en GECS se correlacionaron significativamente con el sexo (p = 0,0003), la edad (p = 0,08), la histología de Lauren (p = 0,005) y el patrón de infiltración (p = 0,001), pero no con factores pronósticos como factores de parada. Los grupos de pacientes clasificados de acuerdo con GECS también mostró que
p53 mutante
y
p53 Barcelona Grupos WT /SHM eran similares en términos del número de pacientes para cada característica clínica, pero diferían en este sentido en comparación con el
p53
WT w /o grupo SHM. Por lo tanto, se acaba de designar los antiguos grupos (
p53 mutante
más los
p53
WT /grupos SHM) como el
p53 grupo
aberración, y el último grupo (
p53
WT w /O MAS) fue designado como el
p53
grupo no aberración.
a pesar de que el pronóstico no fue significativamente diferente entre los grupos categorizados de acuerdo con GEC (figura 2B ), se encontraron más recurrencias en el
p53
grupo aberraciones en comparación con el
p53
grupo no aberración (Tabla 1, una diferencia estadísticamente significativa). Esta tendencia se conserva en términos del patrón de repetición de cada uno de los ganglios linfáticos, el peritoneo y órganos distantes (Tabla 2), lo que sugiere que la
es probable que exhiben un fenotipo clínicamente único, incluso de un grupo p53
aberración punto de vista pronóstico. Cuando se analizaron sólo los casos con recidivas, el
p53 grupo
aberración fue nuevamente asociaron significativamente con la histología de Lauren (Tabla 2; p = 0,01), sin embargo no hubo patrones de repetición que eran únicas a
p53
aberración.
por otro lado, el tipo de cáncer gástrico difuso mostraron significativamente mejor pronóstico que el tipo intestinal de cáncer gástrico en el
p53 grupo
aberración (figura 5A). Puesto que tales pacientes tendían a ser distribuidos a una etapa más avanzada, estos datos de supervivencia sugieren que la quimioterapia adyuvante postoperatoria S1 es más eficaz para el cáncer gástrico de tipo difuso que para el cáncer gástrico de tipo intestinal en casos de
p53
vía aberración (Fig 5B).
(curvas A) de supervivencia para el tipo intestinal se compararon con los de cáncer gástrico de tipo difuso con pStage II /III. (B) distribución de los estadios del cáncer de acuerdo con los hallazgos
p53 grupo
aberración e histológicos.
Por último, como datos de referencia (Tabla 1), análisis univariable pronóstico para SSR y la SG de todos pacientes identificaron factores pronósticos potenciales clínicamente significativa que representa una baja supervivencia tales como el sexo (p = 0,03, p = 0,1), edad ≥ 67 años (p = 0,009, p = 0,001), la localización del tumor superior (P = 0,06, p = 0,1), la 14
º JGCA /7
º UICC pt (P = 0,08, p = 0,4), el 14
º JGCA pN (P = 0,001, P = 0,06), y el 14
º JGCA /7
ª etapa de la UICC (P & lt; 0,0001, p = 0,03).
expresión de la proteína p53 inducida por el tratamiento epigenético, concordante con la actividad transcripcional de p53
tratamiento epigenética de la célula de cáncer gástrico NUGC4 líneas (tipo salvaje
p53
) con 5 mM 5-aza-2 'desoxicitidina o 5 M 5-aza-2' desoxicitidina más tricostatina a apoptosis inducida robustamente en ausencia del agente quimioterapéutico CDDP. El tratamiento adicional con CDDP ve aumentada significativamente estos efectos apoptóticos (Figura 6C). Curiosamente, CDDP en combinación con tratamientos epigenéticos robustamente aumentó el nivel de la proteína p53, que parcialmente, pero no totalmente, que se refleja
p53
actividad transcripcional de un gen indicador de luciferasa (Fig 6A y 6B). Estos resultados sugirieron que
actividad de transcripción p53
puede ser reactivado por los tratamientos epigenéticos, sin embargo, también sugiere que la apoptosis inducida es sólo parcialmente a través del
p53
vía.
NUGC4 y KATOIII las células fueron tratadas con el agente de desmetilación, 5-aza-2 'desoxicitidina (5-aza-dC) en presencia o ausencia de la histona deacetilasa (HDAC) inhibidor, tricostatina a (TSA), y en presencia o ausencia de el reactivo quimioterapéutico, CDDP. 1A y 5A, 1 y 5 mM 5-aza-dC; T, la TSA. Posteriormente se analizaron las células para: (A) expresión de la proteína p53 mediante transferencia Western. (B) Un ensayo de indicador doble para confirmar
p53
actividad de transcripción. La línea discontinua indica el valor de corte óptimo (0,15) para la determinación de la actividad de p53. (C) la apoptosis celular se ensayó usando un ensayo de nexina. Se muestra una imagen representativa. Los datos se muestran como el porcentaje de células apoptóticas tempranas y tardías. * P & lt; 0,05, ** & lt; 0,001, ***. & Lt; 0,0001
Por otra parte, el tratamiento epigenético de líneas celulares de cáncer gástrico KATOIII (
p53
nulos), con 1 M 5-aza-2 'desoxicitidina o 1 M 5-aza-2' desoxicitidina más tricostatina a apoptosis inducida robustamente en ausencia de CDDP, pero el tratamiento adicional CDDP no más aumentar significativamente los efectos apoptóticos (figura 6C). CDDP en combinación con los tratamientos epigenéticos no aumentó el nivel de la proteína p53, que se refleja en la falta de
p53
la actividad de transcripción de un gen indicador de luciferasa (Figura 6A y 6B). Estos resultados sugirieron que
No se requiere la actividad de p53
la transcripción de la apoptosis mediante tratamientos epigenéticos en las células KATOIII (
p53
células nulas).
Discusión
Este presente estudio es el primer informe que SHM de genes supresores de tumores en el
p53
vía se encuentran exclusivamente en el estadio patológico II /III con cáncer gástrico de tipo salvaje
p53 gratis (figura 3). Hemos seleccionado pStage II /III de pacientes con cáncer gástrico con los tratamientos estándar para
Análisis de p53
vía, ya que los tratamientos multidisciplinares en estos pacientes tienen el mayor potencial para la consecución de la mejora de pronóstico con total posibilidad de curación [24, 25]. Esta consideración debe ser la primera prioridad al considerar un mayor desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.
Se requiere metilación casi completa del promotor islas CpG de ADN para la completa silenciamiento de genes, e incluso pequeñas proporciones de alelos metilados puede inducir robusta expresión de genes [ ,,,0],1-5]. En los tejidos de tumor primario, SHM debe representar metilación casi completa en células de cáncer, y SHM en los tejidos de tumor primario fue de hecho asociado con la expresión de proteínas reducida de tales genes (Fig 4). Este resultado sugiere que SHM de genes en el
p53
vía podría ser funcionalmente equivalente a
p53
aberración funcional que se produce como resultado de
p53
mutación, ya que estos 3 moléculas funcionan de la misma
p53
vía.
en el cáncer gástrico, el
p53
grupo aberraciones se asoció significativamente con fenotipos clinicopatológicos únicas, tales como la histología intestinal de Lauren, sexo masculino, la edad la edad, y el crecimiento infiltrativo menos (Tabla 1). Nuestras observaciones actuales pueden estar relacionados con los informes previos que demostraron que
p53
mutación se correlaciona con la etapa temprana de cáncer gástrico de tipo intestinal, o con la última etapa de cáncer gástrico difuso tipo [26, 27], o de edad avanzada [ ,,,0],28], sin embargo, nuestro análisis clínico-patológico incluye principalmente el cáncer gástrico en la etapa intermedia. Curiosamente, la aberración vía es única y se mantiene incluso en pacientes recurrentes (Tabla 2).
relevancia pronóstica positiva de
p53
mutación en el cáncer gástrico es objeto de controversia con los partidarios [29] y los disidentes [30 ] de esta posibilidad. A primera vista parecería nuestros datos para apoyar este último grupo, sin embargo, se debe tener en cuenta que es probable que han sido modificados por la quimioterapia adyuvante post-operatorio (terapia estándar en Japón) nuestros datos de supervivencia. Considerando que, en contraste con el presente estudio, el tipo difuso de cáncer gástrico mostró peor pronóstico que el tipo intestinal de cáncer gástrico en nuestras décadas hospital hace [15, 31], los datos de supervivencia últimas actualizaciones apoyan los resultados opuestos (es decir, el intestinal tipo de cáncer gástrico muestra peor pronóstico que el tipo difuso de cáncer gástrico), que es supuestamente debido a S-1 efectos adyuvantes postoperatorias [32]. Postoperatoria adyuvante S-1 de la quimioterapia se ha propuesto ser significativamente más eficaz para la enfermedad peritoneal que para la metástasis órgano distante [24], y es probable que sea más eficaz para el cáncer gástrico de tipo difuso que para el cáncer gástrico de tipo intestinal [32] . Por estas razones, la más reciente análisis de supervivencia indica que el pronóstico del tipo de cáncer gástrico difuso es mejorada sobre la del tipo intestinal del cáncer gástrico.
No hubo diferencia estadísticamente significativa en la tasa de recurrencia o en el único sitios de recurrencia entre el
p53 grupo
aberración y el
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grupo no aberración, sin embargo, más recurrencias fueron encontrados en cada uno de los sitios de recurrencia de la
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no aberración en comparación con el grupo
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grupo aberración. Estos resultados podrían sugerir que el
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grupo no aberración tiene un fenotipo más agresivo que el
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grupo aberraciones en su conjunto. En nuestro estudio, el tipo de cáncer gástrico difuso mostró significativamente mejor pronóstico que el tipo intestinal de cáncer gástrico en el
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grupo aberración. Puesto que tales pacientes tendían a ser distribuidos a una etapa más avanzada, estos datos sugieren que la supervivencia S1 quimioterapia adyuvante postoperatoria es más eficaz para el cáncer gástrico de tipo difuso que para el cáncer gástrico de tipo intestinal en casos de
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vía aberración. Estos resultados fueron consistentes con los informes anteriores de que mutante
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y /o la inmunotinción de la proteína p53 podría ser biomarcadores predictivos de los efectos positivos de altas dosis de quimioterapia neoadyuvante en el cáncer gástrico [30].
finalmente evaluaron los efectos del tratamiento epigenéticos en combinación con un agente quimioterapéutico a fin de comparar la importancia de la
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vía a la vía epigenética en células de cáncer gástrico tratados con CDDP. Inesperadamente, parecía que el
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vía era poco probable que juegue un papel muy importante en la inducción de apoptosis por CDDP (figura 6). Se demostró recientemente que la carcinogénesis epigenética es posible. En este sistema, iPS sistémica inducida mediante la reprogramación de factores da lugar a la ocurrencia de cáncer sistémico con cambios epigenéticos dinámicos, mientras que reversión sistémica de estos factores de reprogramación vuelve las células de cáncer en las células normales [33]. El cáncer gástrico es susceptibles de albergar menos mutaciones de los genes controladores [34] que el cáncer colorrectal [35], y, de manera similar, las mutaciones distintas de la
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gen son raros en el cáncer de mama [35], lo que sugiere que la carcinogénesis epigenética es una posible etiología importante a través de la infección crónica por Helicobacter Pylori [36-38]. Recientemente hemos demostrado la hiper-metilación de
Reprimo
[39], que a su vez es un gen en el
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vía, pero que no pudieron ser incluidos en este estudio, y de
HOPX
[16] y
CDO1
[40] que están ambos implicados en la apoptosis, pero supuestamente no a través del
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vía. En base a los experimentos funcionales actuales, es probable que sea mucho menor que la de otras vías de la
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vía de contribución a los efectos del tratamiento epigenéticos (Fig 5). Utilizamos otras líneas celulares (2 líneas celulares de cáncer gástrico y 1 línea celular de cáncer hepatocelular) para determinar con precisión la contribución de la
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vía a la apoptosis inducida por CDDP en combinación con los tratamientos epigenéticos. Los experimentos adicionales realizados se muestran en la Fig S3. líneas de células HepG2 son AZ521 y
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tipo salvaje, y la línea celular SH10 es
p53 mutante
.
se detectó la actividad de p53
en el
p53
células de tipo salvaje, sin embargo, su actividad era dependiente de cada línea celular. Por lo tanto,
se detectó p53
actividad en las células NUGC4 con CDDP tratamiento y en las células HepG2 AZ521 y sin tratamiento con CDDP. apoptosis fuerte como se evaluó mediante un ensayo de apoptosis (caspasa 3 o nexina Ensayo) no refleja necesariamente el grado de
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activación transcripcional. En
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mutante (SH10) o
células nulas p53
,
p53
actividad transcripcional no fue inducida en todos, se encontró sin embargo apoptosis ser similar a la de