Extracto
Cáncer de testículo (CT) antígenos se expresan predominantemente en los testículos o en la placenta , pero ausente en la mayoría de los tejidos adultos. Durante la transformación maligna genes CT a menudo se activan. antígenos CT 16 (CT16, página 5) se expresa con frecuencia en el melanoma avanzado, pero su función biológica ha sido desconocido. Para examinar el papel de CT16 en la supervivencia celular nos llamó hacia abajo en las células de melanoma A2058 utilizando siRNAs específicos y se expusieron las células a cisplatino medicamento contra el cáncer se sabe que induce la apoptosis. Como resultado, la supervivencia celular se redujo notablemente. Para estudiar los efectos de CT16 sobre la supervivencia celular en más detalle, los perfiles de expresión génica celular se investigaron después de CT16 silenciamiento en células de melanoma A2058 positivo CT16, así como después de CT16 sobreexpresión en células de melanoma CT16 negativos WM-266-4. Entre los 11 genes upregulated por tanto CT16 silenciamiento y la regulación a la baja por CT16 sobreexpresión o viceversa, 4 genes eran potencialmente los genes apoptóticos o anti-apoptóticas. CT16 fue reconocido como un regulador positivo de la antiapoptótico 2A metalotioneína y la interleucina 8 genes, mientras que inhibe la expresión del gen inductor de la apoptosis 1 Dickkopf (DKK1). Además CT16 aumentó la expresión de ácido graso de proteína 7, un promotor conocido de la progresión del melanoma de unión. El efecto de CT16 en la expresión de p53 DKK1 era independiente. Por otra parte, CT16 no regulaba genes de apoptosis a través de la metilación del ADN. En veinte muestras de tejido melanoma metástasis nivel medio mRNA DKK1 se demostró que era significativamente (p & lt; 0,05) tumores más baja en alta CT16 que expresan (n = 3) en comparación con los tumores con expresión CT16 baja (n = 17). Por lo tanto, nuestros resultados indican que CT16 promueve la supervivencia de las células del melanoma y por lo tanto es un objetivo potencial para el desarrollo futuro de medicamentos
Visto:. Nylund C, Rappu P, E Pakula, Heino A, Laato L, LL Elo, et al. (2012) asociado al melanoma cáncer de testículo antígeno 16 (CT16) regula la expresión de genes apoptóticos y antiapoptóticos y promueve la supervivencia celular. PLoS ONE 7 (9): e45382. doi: 10.1371 /journal.pone.0045382
Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: May 4, 2012; Aceptado: August 17, 2012; Publicado: 21 Septiembre 2012
Copyright: © Nylund et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de la Universidad de Turku hospital de subvención EVO (proyectos 13040 y 13041, http://www.tyks.fi), Southwest Fondos de la Fundación para la Investigación de cáncer de Finlandia (http://www.cancer.fi), Academia de Finlandia (http : //www.aka.fi), la Fundación Sigrid Jusélius (http://www.sigridjuselius.fi), y la Sociedad del cáncer de Finlandia (http://www.cancer.fi). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
antígenos del cáncer de testículo (CTA) forman un grupo heteróloga de proteínas que se expresan en gametos y trofoblastos [1]. CTdatabase del Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer (http://www.cta.lncc.br/index.php) [2] enumera más de 140 llamadas a la acción. La CTA se puede dividir al cromosoma X-codificado (X-CTA) y codificada-no-CTA cromosoma X (X-no-CTA). El mecanismo más común de la activación de genes CTA es promotor desmetilación [1]. La gametogénesis y la tumorigénesis tienen muchos eventos correspondientes y compartidos, incluyendo la hipometilación global y expresión CTA [3]. Sin embargo, no está claro, si la expresión de CTA es simplemente una consecuencia de los acontecimientos de desmetilación comunes en la tumorigénesis o si las CTA tiene un papel activo en la promoción de la progresión del cáncer.
De acuerdo con la CTdatabase, muchos no-X- CTAs parecen tener un papel en la función espermatogénesis y espermatozoides en los testículos normal. En contraste, el papel biológico de X-CTA es en su mayoría desconocidos. La función de los productos génicos codificados por dos familias X-CTA, MAGE y SSX, ha sido estudiado previamente. antígenos MAGE-A se ha informado de interactuar directamente con p53 y reprimir su función [4], [5]. Además, las proteínas MAGE se han demostrado para formar un complejo con un andamio de proteínas, la proteína KRAB-asociado 1 (KAP1) y para suprimir la apoptosis dependiente de p53 [6]. MAGE también se ha demostrado que interactúan con ubiquitina ligasas E3 ANILLO y para potenciar la actividad de ubiquitinación de proteínas dominio RING hacia sus objetivos, tales como p53 [7]. Los miembros de la familia SSX que pueden fusionarse con SS18, como resultado de una translocación cromosómica específica en el sarcoma sinovial humano [8], se han sugerido para actuar como reguladores transcripcionales [9]. Levadura de dos híbridos de selección y pull-down ensayos glutatión-S-transferasa han demostrado que la proteína se une a SSX2 RAB3IP y proteínas SSX2IP [10]. Por otra parte, se ha informado de proteínas SSX colocalize con los miembros del complejo del grupo Polycomb [11], y en estudios posteriores pruebas de la función de las proteínas SSX en la modificación de histonas y la metilación del ADN se han encontrado [12], [13] .
CT16 (también conocida como página 5, GAGEE1, CT16.1) es un X-CTA y sus parientes más cercanos pertenecen a la familia de próstata-antígeno asociado (genes PAGE), que a su vez está relacionado con XAGE y familias de genes GAGE [14]. CT16 fue reportado por primera vez en un estudio en el que la base de datos Unigene se buscó grupos de genes que contienen etiquetas de secuencias expresadas originaron únicamente a partir de las dos bibliotecas de ADNc de testículo y de tumores humanos normales. La expresión de CT16 en melanomas, así como en pulmonares y renales cánceres se mostró en el nivel de ARNm [15]. Más recientemente se informó de la expresión de ARNm CT16 en 11 de 22 metástasis cutánea de melanoma. Por otra parte, hemos demostrado que a pesar de la homología con los antígenos de próstata asociada conocido CT16 no se expresa en cáncer de próstata primario [16]. También hemos desarrollado un ensayo sensible para medir CT16 directamente de sueros de pacientes y mostró que 14 de 23 (61%) de los pacientes con melanoma metastásico tenían niveles detectables CT16 [16].
El papel biológico de CT16 ha sido desconocida , pero hay algunos informes acerca de las funciones putativas de los homólogos CT16. Un miembro de la familia GAGE que tiene 30% de identidad con CT16 se ha informado que inhiben la apoptosis y de interactuar con la nucleofosmina /B23 y el interferón factor regulador 1 [17]. Del mismo modo, recientemente se ha demostrado que el cáncer de próstata antígeno asociado 4 (PAGE4), que tiene 43% de identidad con CT16, es una proteína anti-apoptótica [18]. En el mismo estudio, los autores también informaron que PAGE4 es una proteína intrínsecamente desordenados (IDP) que se une a secuencias ricas en GC en el ADN de doble cadena [18]. El análisis de RMN de CT16 también ha indicado que es un desplazado interno [19]. De hecho, el análisis de la secuencia con el algoritmo IUPred (http://iupred.enzim.hu) [20] predice que todas las proteínas relacionadas con la CT16 son intrínsecamente desordenados. PDI son proteínas que no forman una estructura rígida 3-D en condiciones fisiológicas [21]. Por otra parte, un reciente
in silico
análisis sugiere que la mayoría de las CTA son desplazados internos [22]. Aproximadamente el 25% de las proteínas de mamíferos se prevé que ser desplazados internos, y alrededor del 75% de las proteínas de señalización de mamíferos se predice que tienen largos desordenada regiones [23]. Se ha sugerido que los desplazados a menudo tienen múltiples funciones, una propiedad denomina como moonlighting [24]. Por lo tanto, también CT16 y CT16 relacionados con las CTA pueden tener diferentes funciones dependiendo del contexto biológico y localización celular.
En el presente trabajo se han estudiado el papel de CT16 en el melanoma. Se demuestra que el silenciamiento de CT16 con siRNAs aumenta la muerte celular inducida por cisplatino. El análisis del transcriptoma utilizando CT16 sobreexpresión y la caída CT16 reveló que regula negativamente, probablemente, indirectamente, la expresión de una proteína antiapoptótica DKK1. Se demuestra que esta regulación es independiente de p53 y CT16 no tiene ningún efecto sobre la metilación de los genes de supervivencia regulación. También sugieren que las muestras de metástasis cutáneas de melanoma humano con un alto nivel de ARNm CT16 pueden tener menos ARNm DKK1 que aquellos con bajo nivel de ARNm CT16.
Resultados
CT16 se expresa en metástasis de melanoma y las líneas celulares de melanoma a nivel de la proteína
Hemos informado anteriormente de la producción de anticuerpo policlonal específico contra CT16 recombinante humana [16]. A continuación, el anticuerpo se utilizó para verificar la expresión CT16 en el nivel de proteína en la metástasis del melanoma de la piel. Las muestras de tejido congelado se estudiaron mediante inmunohistoquímica. CT16 expresión sólo fue visible en los tejidos de melanoma metástasis CT16 que expresaban ARNm (Figura 1A, B). Además, la cantidad de tinción CT16-específica correlaciona bien con los niveles de mRNA (Figura S1). Las principales muestras de cáncer de próstata utilizados como controles negativos no mostraron ninguna tinción para CT16 (Figura 1C). Una muestra de testículo se utilizó como control positivo y CT16 se encuentra en el compartimiento basal del epitelio de la espermatogénesis, principalmente en espermatogonias (Figura 1D). En las muestras de melanoma de metástasis CT16 parecía ser principalmente citoplasmática, aunque en algunas células núcleos también se tiñeron positivamente (Figura 1A).
CT16 se detectó en las muestras de tejido con anticuerpo CT16-específica visualizados por kit Vectastain ABC y diaminobencidina y las secciones se contratiñeron con hematoxilina. (A, B) del melanoma muestras de metástasis cutánea de dos pacientes. (C) Primary cáncer de próstata (control negativo). muestra (D) Testis (control positivo). Tanto la tinción citoplasmática y nuclear-CT16 específica es visible en el área ampliada (recuadro) de la muestra de melanoma de piel metástasis. En la muestra de testículo la magnificación muestra la tinción CT16-específica de espermatogonias. La barra de escala en la imagen testículo representa la magnificación de 150 micras para todas las imágenes.
La localización intracelular de CT16 fue estudiada adicionalmente en SK-MEL-2 células de melanoma, así como en WM-266- 4 células de melanoma transfectadas de forma estable con cDNA CT16 que contiene o intacto (control de cDNA) que contiene el vector de expresión. La expresión de las células CT16 CT16 transfectadas había sido verificada tanto a nivel de mRNA y de la proteína (Figura S2). ensayo de inmunofluorescencia utilizando el anticuerpo CT16 (Figura 2A), se confirmó la especificidad del anticuerpo, ya que las células CT16 negativos WM-266-4 transfectadas con el plásmido de control mostraron cierta fluorescencia de fondo solamente (Figura 2A). En las células CT16 CT16 positivas aparece para localizar tanto en el núcleo (con exclusión de nucleolos) y el citoplasma. Para confirmar la localización en el núcleo, SK-MEL-2 extracto nuclear se preparó y se analizó por transferencia Western. CT16 se encuentra tanto en la fracción nuclear y citosólico, mientras que una proteína de control citosólica MEK1 /2 sólo estaba presente en la fracción citosólica (Figura 2B).
Imágenes (A) de líneas celulares de melanoma humano que se indican etiquetado con conejo anticuerpo policlonal contra la proteína antígeno de cáncer de testículo humano CT16 seguido de anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 de IgG de cabra anti-conejo (H & amp; L). Las imágenes fueron capturadas, en tiempos de exposición iguales a comparar cualitativamente la expresión del antígeno CT16 en las líneas celulares. La intensidad de fluorescencia en las células WM-266-4 transfectadas con CT16 cDNA que contiene el plásmido es similar a la de las células CT16-positivos SK-MEL-2. WM-266-4 células transfectadas con el vector vacío solo muestra la fluorescencia de fondo. La barra de escala representa 20 micras para todas las imágenes. (B) Western blot de fracciones citosólicas y nucleares de SK-MEL-2 células. Para la detección de CT16, las muestras se corrieron en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 12%, donde CT16 generalmente migra como dos o tres bandas distintas. MEK1 /2 se detectó en las muestras en un gel de poliacrilamida desnaturalizante del 12%.
CT16 no afecta a la proliferación celular
El efecto de CT16 en la proliferación se estudió con la forma estable CT16 transfectadas células WM-266-4. Además, dos siRNAs contra CT16 mRNA fueron diseñados y verificados para causar la inhibición de más de 80% de expresión CT16, que duró al menos 96 horas (Figura S3A-C). Los siRNAs se consideraron específico para CT16, ya que no regulan la expresión de otros antígenos CT-, por ejemplo MAGE-1 o GAGE-1 (Figura S3D). Es importante destacar que las líneas celulares de melanoma usadas en este estudio no expresaron PAGE2B, el homólogo más cercano de CT16 (Figura S3E). Ni la sobreexpresión de CT16 en las células WM-266-4 ni el tratamiento de células A2058 con siRNAs específicos CT16 tuvo un efecto significativo sobre la proliferación celular (Figura 3A, B).
Las células A2058 (A) tratados con CT16 siRNA específicos o de control se sometieron a Cell ensayo de proliferación de titulación de 96. El producto colorante de formazano solubilizado se cuantificó espectrofotométricamente a 570 nm. (B) La proliferación de WM-266-4 transfectadas de forma estable con cDNA CT16 o control. células A2058 transfectadas (C) CT16 siRNA se trataron con 50 M de cisplatino durante 17 horas para inducir la apoptosis de células y lisados se transfirieron para la caspasa-3 escindido. Se dejó que las células (D) A2058 pretratadas con siRNA indicada durante 48 h para fijar a la placa de xCELLigence para 10 h. Las células fueron expuestas a concentraciones indicadas de cisplatino en el momento cero, y el Índice de Células se midió posteriormente a intervalos de 10 min durante 30 h. Las barras de error representan las desviaciones estándar de tres experimentos. El índice de células de todas las muestras se normalizó a 1 en el momento cero. (E) Las secciones transversales en tres momentos del experimento xCELLigence. Los asteriscos indican diferencias significativas entre el tratamiento control de siRNA,
P
. & Lt; 0,001 (HSD ANOVA, Tukey) guía empresas
CT16 promueve la supervivencia de células de melanoma
A fin de probar la papel biológico de CT16 hemos expuesto células de melanoma a un cisplatino inductor de apoptosis medicamento contra el cáncer,. células A2058 fueron tratados primero ya sea con siRNAs específicos CT16 o ARNsi de control durante 48 horas, y después de la adición de cisplatino los cultivos celulares fueron controlados durante 30 h en 10 min intervalos utilizando la tecnología xCELLigence. En esta tecnología, las células se cultivan en una superficie que contiene micro-electrodos integrados, y la impedancia eléctrica entre los electrodos causadas por las células se mide. El cambio relativo de la impedancia eléctrica medida se expresa como Índice de Células (CI). Tanto el número de células y la morfología afectan a la CI, y la separación celular y la muerte son vistos como una disminución de la CI.
cisplatino disminuyó CI de CT16 siRNA células tratadas notablemente más que el de las células tratadas con ARNsi de control (Figura 3D, E ). La diferencia fue más evidente cuando se utilizó la concentración de 50 mM cisplatino. Por el contrario, CT16 no tuvo ningún efecto sobre la supervivencia en presencia de estaurosporina (0 a 600 nM) (no mostrado). Por lo tanto, parece que inhibe CT16 cisplatino induce pero no indujo estaurosporina muerte de las células A2058 de melanoma.
En presencia de cisplatino CT16 siRNAs podría aumentar la activación de la caspasa-3, como se muestra mediante transferencia Western con anticuerpos que reconocen específicamente exfoliados caspasa-3 (Figura 3C). Por lo tanto, CT16 podría proteger a las células del melanoma de la apoptosis.
CT16 regula los genes supervivencia asociada a
Para examinar más a fondo el papel de CT16 en la supervivencia celular, se realizaron dos experimentos de transcriptómica de perfiles. En el primer experimento, las células de melanoma A2058 positivo CT16 fueron tratados con CT16 siRNA específico y luego comparación con las células A2058 tratados con el control de siRNA. En el segundo experimento, de manera estable el control de cDNA transfectadas se compararon WM-266-4 células de melanoma de manera estable CT16 cDNA células transfectadas. Los datos de microarrays se han depositado, según las directrices MIAME, en el NCBI Gene Expression Omnibus [25], el número de acceso GSE31352 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE31352 ). El algoritmo rango de productos se utilizó para seleccionar los genes expresados diferencialmente [26]. El algoritmo detecta los genes que se encuentran constantemente entre los genes más hasta downregulated-o a través de las repeticiones. El uso de filas en lugar de los valores de expresión aumenta la robustez frente al ruido. Los genes con rango de productos tasa de falso descubrimiento (FDR) & lt; 0,05 fueron sometidos a análisis de genes ontología por la herramienta GoTermMapper que mapea los genes a los componentes celulares y génicas seleccionadas proceso ontología categorías biológicas (adelgaza GO). Se encontró que la distribución global por componente celular o proceso biológico de los genes expresados diferencialmente a ser similar en ambos sobreexpresión CT16 y desmontables experimentos (Figura 4). Para identificar los procesos biológicos de los genes expresados diferencialmente pueden participar en un análisis funcional anotación se llevó a cabo usando la herramienta de DAVID. Sólo los términos con Benjamini-Hochberg FDR & lt; 0,05 se incluyen en los resultados. Los genes que se upregulated por CT16 sobreexpresión fueron significativamente enriquecido en los procesos biológicos que promueven la supervivencia o están relacionados con la inflamación, la homeostasis química así como la respuesta a los estímulos y heridas (Tabla 1). Los genes que fueron regulados a la baja por la sobreexpresión CT16 fueron excesivamente significativamente únicamente en el procesamiento y presentación de antígenos de péptido o antígeno polisacárido a través de MHC de clase II proceso (Tabla 1). El análisis de los genes expresados diferencialmente en el experimento caída CT16 no reveló ningún procesos biológicos con Benjamini-Hochberg FDR & lt; 0,05 (no se muestra)
Los genes expresados diferencialmente de CT16 desmontables y sobreexpresión experimentos se analizaron por separado.. El número de genes anotados a la categoría particular está en paréntesis. El mapeo de IR delgada ontología se hizo con GoTermMapper (http://go.princeton.edu/cgi-bin/GOTermMapper).
Para limitar el número de genes a estudiar, se seleccionaron sólo los genes que son regulados a la baja por el siRNA CT16 y CT16 regulados al alza debido a la sobreexpresión o
viceversa gratis (rango de productos FDR & lt; 0,1 en ambos experimentos). Del total de 11 genes que cumplen estos criterios, 5 han sido previamente informado a participar en la progresión del cáncer (Tabla 2). Sobre la base de estos experimentos CT16 fue reconocido como un regulador positivo de la 2A antiapoptótico de la metalotioneína (MT2A) y la interleucina 8 (IL8 genes), mientras que inhibe la expresión del gen inductor de la apoptosis Dickkopf 1 (DKK1). Además, CT16 aumentó la expresión de la proteína de unión a ácido graso 7 (FABP7), un promotor conocido de la progresión del melanoma. La regulación diferencial de genes, FABP7 MT2A y DKK1 fue confirmada por tiempo real QRT-PCR análisis de CT16 sobreexpresan WM-266-4 células (Figura 5A, figura S4).
(A) Verificación de DKK1 diferencial la expresión de ARNm en las células (WM-266-4 transfectadas con cDNA de control o CT16 cDNA. de QRT-PCR. (B) expresión diferencial DKK1 mRNA también era repetible en las células A2058 tratados con siRNAs indicado para 48 h. (C) de transferencia de Western para DKK1 en medio de cultivo de células A2058 tratados con siRNAs indicado para 48 h. (D) DKK1 es downregulated en muestras de melanoma con la expresión de alto CT16. niveles CT16 y de ARNm de DKK1 de muestras de tejido de melanoma de piel de metástasis se detectaron mediante qRT-PCR. La
p
valor se obtuvo mediante pruebas de la diferencia de nivel DKK1 mRNA entre las muestras de melanoma de alto nivel CT16 ARNm (& gt; 22% de los ARNm de β-actina) y aquellos con bajo nivel CT16 ARNm (& lt; 7% de β ARNm actina) mediante la prueba de Tukey-Kramer.
para probar los criterios de selección de los genes en la Tabla 2, se utilizó en tiempo real QRT-PCR para analizar tres genes, CTSL, DDAH1 y BIRC5 que fueron downregulated de siRNA CT16 y CT16 regula positivamente debido a la sobreexpresión o
viceversa
pero tenía el rango de productos FDR & gt; 0,1. En estas mediciones el efecto de CT16 en la expresión no se pudo confirmar (Figura S4). Por lo tanto, el producto FDR valor umbral rango seleccionado filtra de manera eficiente los falsos positivos, al tiempo que conserva los verdaderos.
CT16 es un regulador negativo de DKK1 en el melanoma
El extracelular Wnt antagonista DKK1 fue elegido para más estudios, ya que previamente se ha demostrado que activan la apoptosis y que se downregulated en el melanoma y otros tipos de cáncer [27], [28]. Dos siRNAs CT16 independientes aumentaron los niveles de mRNA en células DKK1 A2058 (Figura 5B). El efecto de CT16 en la expresión DKK1 también se confirmó en el nivel de proteína en medio de cultivo celular de las células A2058 por transferencias de Western. Desmontables por CT16 siRNA resultó en un aumento en la acumulación de la proteína DKK1 en el medio (Figura 5C).
Para encontrar pruebas de que CT16 también regula DKK1 niveles de expresión en los tumores, muestras de metástasis de melanoma de la piel 20 se analizaron por en tiempo real QRT-PCR. El nivel de ARNm CT16 en relación con ß-actina fue por debajo de 7% en 17 muestras que fueron agrupadas como muestras de melanoma bajas CT16. CT16 nivel de ARNm fue superior al 22% de β-actina en las tres muestras que se agruparon tan altas muestras de melanoma CT16. Curiosamente, los altos muestras CT16 tuvieron significativamente (p & lt; 0,05, prueba de Tukey-Kramer) Nivel de DKK1 mRNA promedio más bajo en comparación con la de bajos muestras CT16 (Figura 5D), lo que sugiere que el nivel de alta CT16 puede ser una razón para descrito previamente regulación a la baja de DKK1 expresión en el melanoma.
CT16 regula sus genes diana en una p53 y la metilación del ADN independiente de manera
Las interacciones moleculares de X-CTA sólo se conocen en algunos casos. Como se sabe que las proteínas MAGE para afectar a funciones de p53 (Yang et al., 2007), hemos querido estudiar los efectos en diferentes líneas de células CT16 positivo. No hay cambio en la expresión de proteína p53 se detectó mediante inmunotransferencia en CT16 siRNA desmontables células SK-MEL-2 en comparación con las células tratadas ARNsi de control (Figura S5a). resultado similar también fue recibido entre el CT16 y el control de cDNA transfectadas WM-266-4 células (Figura S5B). También hemos probado los efectos de CT16 en células de osteosarcoma humano Saos-2 que se sabe que no tienen expresión de p53. La expresión negativa de p53 en células Saos-2 se confirmó con QRT-PCR (no se muestra). El resultado mostró, de manera similar como en las células A2058, una regulación positiva clara, de DKK1 después CT16 caída, lo que indica que p53 no está involucrado en el proceso (Figura S5C). Ninguno tenía CT16 ningún efecto sobre el cambio conformacional de p53 en el extracto crudo de WM-266-4 células (Figura S5D). Además, no hubo diferencia en la estabilidad de p53 entre las células A2058 tratado CT16 siRNA y las células de control después de la inhibición de la síntesis de proteína con CHX Figura S5E). De acuerdo con eso, no se encontró un enriquecimiento importante de genes diana de p53 entre los genes expresados diferencialmente (no mostrado). En conjunto, estos resultados apoyan la idea de que p53 no mediar los efectos de CT16 o participar en la apoptosis.
Algunos X-CTA también afecta a la metilación de genes y modificaciones post-traduccionales en las histonas. Para estudiar esto, un análisis de inmunoprecipitación de la cromatina-promotor específico de todo el genoma para WM-266-4 células transfectadas de manera estable con cDNA CT16 o de control se llevó a cabo utilizando la metilación del ADN de la histona H3 acetilada específica y anticuerpos específicos y un microarray que cubre 30.000 promotores humanos. Los genes específicos de la muestra, que se definen como los que tienen picos (detectado y evaluado por software NimbleScan) que tiene FDR & lt; 0,05 en la muestra y FDR≥0.2 en el control o viceversa, se analizaron mediante el uso de DAVID. No hubo genes enriquecido significativamente en ninguna de las categorías de ontología de genes entre los genes específicos de la muestra (no mostrados). También comparamos las listas de genes regulados diferencialmente en las líneas de células WM-266-4 derivados con los genes específicos de la muestra de las listas tanto de acetilación de histonas metilación específica y análisis de inmunoprecipitación específica (Tabla S1). Los resultados sugieren que existe una relación entre la acetilación de las histonas H3 y la expresión génica de los genes regulados CT16. Sin embargo, no está claro si CT16 está involucrado en los eventos de la acetilación de histonas o el resultado refleja simplemente la conexión conocida entre la acetilación de la histona H3 y la expresión génica. En contraste con la acetilación de histonas H3, la metilación del ADN no mostró correlación con CT16 genes regulados que sugieren que los cambios en el perfil de expresión génica por CT16 no están mediados por la metilación del ADN.
Recientemente, se ha demostrado que las proteínas de clase I MAGE regular KAP1 y la transcripción de dedo de zinc de dominio KRAB mediada por el factor represión de genes a través de la interacción con KAP1 [34]. Sin embargo, no es muy probable que también CT16 interactuaría con KAP1, ya que los objetivos KAP1 identificaron en un análisis de inmunoprecipitación de la cromatina en todo el genoma de la unión KAP1 [35] no fueron enriquecidos entre los genes expresados diferencialmente o bien de la caída CT16 o experimentos de sobreexpresión ( no se muestra).
Hemos excluido previamente la posibilidad de que CT16 podría unirse directamente a las secuencias ricas en GC en ADN de doble cadena [19] de una manera similar como su paralog PAGE4 [18]. En este caso, no es posible mostrar la localización de CT16 para los promotores inmediatos de sus genes diana (Figura S6). Por lo tanto, el mecanismo de acción CT16, como la función de la mayoría de los otros X-CTA, sigue siendo desconocido.
Discusión
El tratamiento eficaz de melanoma metastásico es un problema importante sin resolver. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de obtener nueva información sobre los mecanismos moleculares que regulan la supervivencia y la resistencia a los medicamentos en el melanoma. Los recientes resultados de los ensayos clínicos han generado optimismo de que en el futuro los nuevos fármacos específicos, tales como cerca de ipilimumab [36] y los inhibidores de BRAF [37], podría ser utilizado para detener la progresión de una enfermedad avanzada. Sin embargo, muchos melanomas también parecen desarrollar resistencia contra las nuevas moléculas de fármaco rápidamente, a veces en meses [38].
Recientemente hemos informado de que la expresión de CT16 se induce frecuentemente en melanoma humano. Además, CT16 suero se puede medir y usar para seguir la progresión de la enfermedad [16]. Aquí mostramos que CT16 protege a las células de melanoma contra cisplatino (50 M) inducida por la muerte celular. complejos de platino se unen a ADN y de reticulación, lo que conduce a la apoptosis. Curiosamente, CT16 no pudo prevenir la muerte celular inducida por estaurosporina. La estaurosporina es un alcaloide que inhibe un amplio espectro de proteínas quinasas [39], y por lo tanto pueden activar la apoptosis por varios mecanismos diferentes [40]. Las funciones celulares de la mayoría de los CTAs son desconocidos, pero además de CT16 también algunos otros X-CTA se han relacionado con la supervivencia celular. La transfección de células de cáncer de ovario por MAGE-A2 y MAGE-A6 puede inducir paclitaxel y doxorrubicina resistencia por un mecanismo desconocido [41]. Además, GAGE-7 se ha descrito para actuar como una proteína anti-apoptótica en células HeLa [17], [42]. Más recientemente, un antígeno de cáncer de próstata asociado, PAGE4, se informó de inhibir la muerte celular inducida por el estrés [18].
Sobre la base de nuestro análisis del genoma amplia expresión génica, CT16 puede regular negativamente los procesos biológicos específicos, tales como la apoptosis y la presentación de antígenos para aumentar la supervivencia de células de cáncer. El mecanismo de acción CT16 parece ser, al menos parcialmente relacionado con el hecho de que puede regular la expresión de genes apoptóticos y antiapoptóticos, tales como 2A metalotioneína, IL-8 y DKK1. Estos tres genes estaban entre los once genes que se han encontrado para ser regulada por CT16 tanto en el silenciamiento y la sobreexpresión experimentos CT16. Metallothionein 2A es conocido para proteger las células HeLa contra la muerte inducida por ROS [30], mientras que IL-8 inhibe TRAIL y apoptosis inducida por fármacos de las células de cáncer de próstata [33] y aumenta la tumorigenicidad y el potencial metastásico de células de melanoma [32]. Lo más interesante, CT16 se encontró que era un regulador negativo de DKK1, un gen descrito a ser significativamente downregulated en el melanoma maligno [43]. DKK1 es un inhibidor extracelular de anti-apoptótica vía Wnt-señalización [44] que puede inducir apoptosis en células de melanoma [27]. Por lo tanto, disminución de la expresión DKK1 se considera que es un importante mecanismo de supervivencia en células de melanoma. Cuando analizamos 20 metástasis cutáneas de melanoma en su expresión de ARNm DKK1 y CT16, tres muestras mostraron niveles excepcionalmente altos CT16 y concomitantemente expresión muy baja DKK1. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que la sobreexpresión CT16 es una, pero probablemente no es el único mecanismo que conduce a la supresión DKK1 en el melanoma. CT16 también aumenta la expresión de la proteína de unión de ácidos grasos 7 (FABP7), un promotor conocido de la progresión del melanoma [29].
queda por estudiar el mecanismo exacto de cómo CT16 regula la expresión de estos genes. PAGE4, un paralog de CT16, se demostró recientemente para unirse directamente al ADN [18]. Por otra parte, tanto CT16 y PAGE4 son intrínsecamente desordenada proteínas [18], [19], [45]. Sin embargo, no se ha observado la unión a ADN CT16 [19]. Por lo tanto, a pesar de la homología entre PAGE4 y CT16 el mecanismo de acción puede diferir notablemente entre estas dos proteínas. Por otra parte, hemos excluido los otros dos mecanismos de acción conocidos CTA-X. Nuestros datos indican que p53 no mediar los efectos de CT16 a pesar del hecho de que las proteínas MAGE actúa de esta manera. Tampoco pudimos detectar ninguna conexión entre la metilación del ADN y los genes regulados CT16.
Para concluir, los recientes avances en el desarrollo de la terapia con medicamentos contra el melanoma avanzado ha llevado a la necesidad urgente de desarrollar nuevos biomarcadores de la progresión de la enfermedad. Recientemente hemos sugerido que los niveles séricos CT16 se podrían utilizar para monitorizar la eficacia del tratamiento y las recaídas putativos. En este caso, nos informan de que CT16 también contribuye a la patogénesis de la enfermedad mediante la regulación tanto de apoptosis y los genes antiapoptóticos y promover la supervivencia de las células del melanoma. Por lo tanto, CT16 es una molécula diana putativo para el desarrollo de medicamentos destinados a potenciar el efecto de los fármacos que inducen la apoptosis.
Materiales y Métodos
Ética declaración
Los estudios clínicos fueron aprobados por la junta de revisión institucional del hospital de la Universidad de Turku, y cada paciente proporcionado consentimiento informado por escrito para participar en los ensayos y /o para permitir su /sus muestras de tejido para ser utilizados con fines de investigación.
líneas celulares y transfecciones
Las líneas celulares de melanoma A2058, SK-MEL-2, y WM-266-4 originalmente obtenido de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) fueron autenticados por la Agencia de Protección de la Salud Colecciones de Cultivos (Porton Down, Reino Unido), utilizando STR método de análisis. Las líneas celulares de melanoma se mantuvieron en 5% de CO
2 y 37 ° C en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con suero bovino fetal 10%. El cDNA CT16 incluyendo el codón de parada se clonó mediante PCR a partir del vector de expresión para CT16 [16] y se inserta en
Xba I y
Eco RI
sitios de pEXPR-IBA103 plásmido (IBA GmbH, Göttingen, Alemania). Una cantidad de 1 g de la CT16 cDNA que contiene o intacto (control cDNA) pEXPR-IBA103 vector se transfectó en células WM-266-4 utilizando Fugene 6 reactivo de transfección (Roche, Basilea, Suiza) según las instrucciones del fabricante. Después de incubar durante 48 h se seleccionaron las células resistentes a G418 por 0,8 mg de G418 /ml (Invitrogen). Las células transfectadas de forma estable se mantuvieron en medio que contiene 0,2 mg /ml G418.