Extracto
El carcinoma hepatocelular (CHC) es una de las neoplasias humanas más comunes. Por lo tanto, el desarrollo de los primeros biomarcadores de diagnóstico, de alta sensibilidad para evitar HCC se necesita con urgencia. Serum a-fetoproteína (AFP), el biomarcador clínica en el uso actual, se eleva sólo en ~ 60% de los pacientes con HCC; por lo tanto, se espera que la identificación de biomarcadores adicionales para tener un impacto significativo en la salud pública. En este estudio, hemos utilizado el análisis de microarrays de glicanos para explorar el valor diagnóstico potencial de varios antígenos de hidratos de carbono asociados con el cáncer (cacas) como biomarcadores para el CHC. Se utilizó el análisis de microarrays de glicanos con 58 análogos diferentes de glicanos para la comparación cuantitativa de 593 muestras de suero humano (293 muestras de HCC; 133 virus de la hepatitis B crónica (HBV) muestras de infección, 134 virus de la hepatitis C crónica (VHC) muestras de infección, y 33 muestras de donantes sanos ) para explorar la posibilidad de diagnóstico de los cambios de anticuerpos en suero como biomarcadores para el CHC. Las concentraciones séricas de anti-galactosil disialosyl globosido (DSGG), anti-fucosiltransferasa GM1 y anti-Gb2 fueron significativamente mayores en los pacientes con HCC que en los individuos crónicas de infección por VHB no en pacientes con infecciones de hepatitis C crónica. En general, en la población estudiada, los biomarcadores candidatos DSGG, fucosiltransferasa GM1 y GB2 de cacas logran una mejor sensibilidad predictiva que la AFP. Se identificaron biomarcadores potenciales adecuados para la detección precoz de HCC. el análisis de microarrays de glicanos proporciona una poderosa herramienta para la alta sensibilidad y detección de alto rendimiento de anticuerpos séricos contra cacas, que pueden ser biomarcadores séricos valiosos para la detección precoz de personas con alto riesgo de HCC
Visto:. Wu CS , Yen CJ, Chou RH, Li ST, Huang WC, Ren CT, et al. (2012) asociada al cáncer de carbohidratos Antígenos como biomarcadores potenciales para el carcinoma hepatocelular. PLoS ONE 7 (7): e39466. doi: 10.1371 /journal.pone.0039466
Editor: Erica Villa, Universidad de Módena & amp; Reggio Emilia, Italia |
Recibido: 16 de febrero de 2012; Aceptado: 21 de mayo de 2012; Publicado: 13 Julio 2012
Copyright: © 2012 Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán otorga NSC99-2320-B-039-030-MY3, NSC99-2632-B-039-001-MY3, NSC100-2321-B-039-004, y la Universidad de Texas MD Anderson Universidad de Medicina y el hospital Sor -china Institución Fondo DMR-101-115. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma hepatocelular (CHC) es el quinto cáncer más común en todo el mundo, con china y América del Norte que muestra un aumento continuo de la tasa de incidencia y mortalidad [1]. HCC casi siempre se desarrolla en el contexto de la infección por virus de la hepatitis crónica o cirrosis hepática [2] - [4]. El pronóstico para los pacientes con CHC sigue siendo pobre, y la tasa de supervivencia a 5 años después del diagnóstico o para la mayoría de los pacientes es inferior al 5%, principalmente debido a que la enfermedad se diagnostica a menudo en una etapa avanzada [5]. Para los pacientes con un diagnóstico de HCC en una etapa temprana, la tasa de supervivencia puede ser mejorada significativamente por la resección quirúrgica, trasplante de hígado, y otras terapias curativas tales como tratamientos ablativos [6], [7]. Por otra parte, la vigilancia de los pacientes en situación de riesgo mejora la detección y potencialmente el efecto curativo de los tratamientos para tumores pequeños. Por lo tanto, los marcadores pronósticos tempranos son cruciales para el tratamiento y la prevención de HCC eficaz.
El biomarcador HCC más común utilizado para evaluar a los pacientes con cirrosis hepática es un suero-fetoproteína (AFP), que se mide a intervalos de 6 meses [8]. Sin embargo, los niveles de AFP a menudo son elevados en algunos pacientes con enfermedad hepática crónica que no tienen cáncer, y los niveles de AFP no están elevados en el 30-40% de los pacientes con cáncer de hígado [9]. La prueba de AFP en suero tiene una baja sensibilidad, y alrededor de un tercio de los pacientes con CHC en estadio temprano y tumores pequeños (& lt; 3 cm) tienen el mismo nivel de AFP que en los individuos normales, lo que hace que la prueba de AFP insuficiente para la pronta detección de CHC en poblaciones de riesgo [10]. Además, la prueba de AFP tiene una alta tasa de falsos positivos del ~ 20% entre los pacientes con hepatitis crónica y 20-50% entre aquellos con cirrosis hepática [5], [11]. En este sentido, existe una necesidad urgente de identificar biomarcadores séricos más sensibles y fiables para la detección de HCC [12], [13].
Oncogénesis se asocia a menudo con los cambios en la expresión de los carbohidratos de la superficie celular. En algunos casos, el patrón de hidratos de carbono puede ser específica para el tipo de la enfermedad [14]. En otros casos, los niveles de anticuerpos anti-carbohidrato pueden ser notablemente mejorado con la aparición de la enfermedad [15]. Estudios anteriores han demostrado que los perfiles de glicosilación celulares cambian significativamente durante la carcinogénesis [14]. Los hidratos de carbono juegan un papel crucial en diversos eventos biológicos tales como reconocimiento de células [16], la señalización inter e intracelular, el desarrollo embrionario, la adhesión celular [17], y las interacciones célula-célula [18]. Actualmente, el descubrimiento marcador glicanos con el análisis de microarrays de glicanos presenta un gran potencial para la identificación de biomarcadores relevantes para el diagnóstico de cáncer de mama [19].
microarrays de glicano permiten la caracterización directa de las interacciones carbohidratos y proteínas [20]. técnicas Microarray son métodos eficaces y sensibles para el análisis rápido de la especificidad de las interacciones proteína-carbohidrato y la caracterización de los procesos de diferenciación que pertenecen a la aparición de cáncer a nivel molecular [21]. Además, la unión de azúcares a las superficies puede imitar eficazmente la presentación de estos compuestos en la membrana de las células y por lo tanto se puede utilizar para unirse a anticuerpos [20]. En este informe, nos centramos en los glicanos que son conocidos por ser los antígenos de hidratos de carbono asociados con el cáncer (cacas) en muchos tipos de cáncer, pero que no han sido estudiados en el CHC. Se utilizó el análisis de microarrays de glicanos para explorar la posibilidad de diagnóstico de los cambios de anticuerpos en suero como biomarcadores para el CHC. Además, se comparó la precisión de los biomarcadores que hemos identificado con el biomarcador AFP convencional para el CHC.
Resultados
Características de los pacientes
Un total de 593 participantes incluyendo 293 pacientes con HCC , 133 virus de la hepatitis B crónica (HBV) pacientes de infección, 134 virus de la hepatitis C crónica (VHC) pacientes de infección, y 33 sujetos normales fueron reclutados en este estudio (Tabla 1). No hubo diferencias significativas en edad y sexo entre los casos y controles. Además, el grupo HCC y el grupo de controles sanos tuvieron resultados estadísticamente diferentes de laboratorio para la albúmina, la aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT) y bilirrubina total (BIL-T) (p & lt; 0,05). La puesta en escena patológica (AJCC) de HCC fue de grado I en 96 casos (41,3%), grado II en 80 casos (34,5%), grado III en 48 casos (20,7%), y grado IV en 8 casos (3,4%).
La detección de anticuerpos séricos contra antígenos de hidratos de carbono con glicanos Microarray Análisis
Hemos probado el suero de pacientes con HCC para los anticuerpos que se unen a fragmentos de glicanos. Los portaobjetos de vidrio impreso en formato de microarray con compuestos de glicano 1-58 (Figura S1) se incubaron con muestras de suero, y los anticuerpos unidos se detectaron usando cabra marcado con Cy3 anti-humano IgG anticuerpo secundario (Figura 1). Las exploraciones fluorescentes fueron procesados para cuantificar la intensidad de cada mancha. Los datos resultantes se representan como la intensidad de fluorescencia relativa media de entre las repeticiones de cada muestra. Hemos observado que la intensidad de fondo del antígeno carbohidrato de unión de individuos sanos podría ser el resultado de la unión no específica; por lo tanto, la media de intensidades de fluorescencia de & lt; 35 000 fueron retirados del análisis. Este enfoque proporciona un fundamento para el desarrollo de un microarray glicano para detectar la presencia de 47 anticuerpos de glicanos diferentes en el suero de pacientes (después de la eliminación de los números de muestra 2, 3, 5, 7, 16, 20, 23, 24, 30, 31, y 47).
una imagen de diapositivas representativa resultante de un análisis de fluorescencia después de la detección de IgG en muestras de suero (a). Cada rejilla se imprimió con los números 1-20 de glicanos en la fila superior, 21-40 en la fila del medio, y 41-58 en la fila inferior. (B) Media ± desviación estándar especificidad de los anticuerpos de unión a los números de glicano 1-58 en muestras de suero de pacientes con HCC. intensidad de fluorescencia relativa se calcularon para cada punto (que contiene 100 mM de glicanos) en el microarray de glicanos.
Se examinaron muestras de suero de 155 pacientes con HCC y 33 individuos sanos de anticuerpos que se unen a los carbohidratos antígenos en el microarrays de glicanos. Los datos de fluorescencia que refleja la reactividad del anticuerpo a cada glicano se normalizaron a GB5 para cada muestra, y las intensidades de fluorescencia relativas para anticuerpos IgG de pacientes con HCC y los individuos sanos se presentan como media glicano: relaciones GB5 IgG (Figura 2). Se detectaron anticuerpos que se unen a GB5 en pacientes con HCC y donantes sanos. Hemos observado que los niveles de IgG contra los números de glicanos 4 (SLacNAc 6Entonces
3), 15 (disialosyl galactosil-globosido; DSGG), 18 (fucosiltransferasa GM1), 35 (Gb-3), 36 (Gb2), 42 (B19) y 56 (Man7) fueron significativamente mayores en los pacientes con HCC que en individuos sanos.
ratios de fluorescencia relativa se calcularon como la intensidad de fluorescencia relativa de cada análogo glicano dividido por la intensidad de fluorescencia relativa de GB5, y son expresada como porcentajes en la figura. La figura muestra la relación media ± desviación estándar para cada una de glicanos. Los asteriscos indican los glicanos en la que el glicano media: GB5 IgG relación fue significativamente mayor en el suero de pacientes con HCC (n = 155) que en el suero de individuos sanos (n = 33). Los
p valores se calcularon con
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p Hotel & lt; 0,01).
la comparación de los niveles de anticuerpos anti-glicanos Siete entre los pacientes femeninos y masculinos con CHC e individuos sanos
En un estudio previo [22], los hombres tenían una mayor incidencia de carcinoma hepatocelular que las mujeres. En nuestro estudio, hemos aumentado el número de muestras de HCC hasta 293 pacientes y se estratificó a los resultados por género para determinar si los niveles de anticuerpos anti-glicanos variaron según el sexo. Entre las mujeres, los niveles de IgG contra glicanos números 15, 18, y 35 fueron significativamente mayores en los pacientes con HCC que en los individuos sanos (
P & lt; 0,01
) (Figura 3A). Entre los hombres, los niveles de IgG contra glicanos números 15, 18, 35, 36, y 42 fueron significativamente mayores en los pacientes con HCC que en los individuos sanos (
P & lt; 0,05
) (Figura 3B). Curiosamente, se observó resultados similares para los números de glicano 15, 18 y 35 entre dos grupos.
ratios de fluorescencia relativa se calcularon como la intensidad de fluorescencia para cada análogo glicano dividido por la intensidad de fluorescencia para GB5, y se expresan como porcentajes en las figuras. La figura muestra la relación media ± desviación estándar para cada una de glicanos. (A) El glicano: relaciones GB5 IgG para los números de glicano 15, 18, y 35 fueron significativamente más altos en el suero de pacientes de sexo femenino con HCC (n = 70) que en el suero de las hembras sanos (n = 11). (B) El glicano: relaciones GB5 IgG para los números de glicano 15, 18, 35, 36 y 42 fueron significativamente más altos en el suero de pacientes de sexo masculino con HCC (n = 223) que en el suero de los machos sanos (n = 22). Los asteriscos indican los glicanos en la que el glicano media: relación GB5 IgG fue significativamente mayor en el suero de los pacientes con HCC que en el suero de individuos sanos. El
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Comparación del nivel Los anticuerpos de anti-glicanos Seleccionar desde CHC y la enfermedad hepática crónica (EPC), por género
a nivel mundial, más del 52% de los casos de CHC se relaciona con infección crónica por VHB, y el 25% de los casos de CHC están asociados con la infección por VHC [23]. VHB o VHC infección conocida puede aumentar el riesgo de desarrollar HCC [7]. Para examinar las diferencias en los pacientes con HCC con VHB o VHC, se dividió a los pacientes en el HCC VHB-positivo (VHB-HCC; n = 132) o HCC positivos para el VHC (VHC-HCC; n = 65) para comparar la enfermedad hepática crónica ( VHB-CLD; n = 133 y VHC-CLD; n = 134). Para ambos sexos, niveles de IgG contra glicanos 15, 18, y 36 para las hembras y los machos fueron más altos en los pacientes con HCC VHB de los pacientes sin HCC (
P Hotel & lt; 0,05) (Figura 4A y B). No hubo diferencias significativas en los niveles de anti-glicano entre los pacientes con HCV-HCC y pacientes con VHC crónicos (Figura 5A y B).
ratios de fluorescencia relativa se calcularon como la intensidad de fluorescencia para cada análogo glicano dividida por la fluorescencia intensidad para GB5, y se expresan como porcentajes en las figuras. La figura muestra la relación media ± desviación estándar para cada una de glicanos. Las relaciones para los números de glicano 15, 18, y 36 fueron significativamente más altos de HCC relacionado con el VHB de CLD (HBV) en mujeres (n = 30 y 44, por separado) (A) y machos (n = 102 y 89, por separado) ( SEGUNDO). El
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proporciones relativas de fluorescencia se calcularon como la intensidad de fluorescencia para cada análogo glicano dividida por la intensidad de fluorescencia para GB5, y se expresan como porcentajes en las figuras. La figura muestra la relación media ± desviación estándar para cada una de glicanos. Las proporciones de los números de glicanos 15, 18, 35, 36 y 42 hubo diferencia significativa entre el HCC relacionada con el VHC y la EPC (VHC) en las mujeres (n = 18 y 61, por separado) (A) y machos (n = 47 y 73 , por separado) (B). (
P Hotel & gt; 0,05).
detección en comparación al lado de análogos de glicanos y AFP por su sensibilidad diagnóstica para el CHC CLD y saludable. Para un paciente con antecedentes de enfermedad hepática, el consenso para el diagnóstico de HCC se puede lograr con un nivel elevado de AFP (≥200 ng /dl), junto con un estudio de imagen dinámica que muestra un tumor hepático. En Taiwán, el valor de corte de nivel de AFP en suero para el diagnóstico de HCC se ha fijado en 200 ng /ml, y de acuerdo con las directrices de los criterios de diagnóstico y estadificación clínica de HCC. Por lo tanto, cambiamos el valor de corte de la AFP. Cuando AFP
200 (AFP en un valor de corte de & gt; 200 ng /ml) se utilizó para predecir la etapa de HCC, una sensibilidad del que se obtuvo para las hembras 33,33% (10 de 30), y 24,51% (25 de 102 ) se obtuvo para los hombres (Tabla 2). Hemos observado que la sensibilidad de 3 números anti-glicano (15, 18, y 36) fueron mejor que la de AFP a 63,33% (19 de 30) /42.16% (43 de 102), 56,67% (17 de 30) /35,29% (36 de 102), y 43,33% (13 de 30) /45.1% (46 de 102), respectivamente, en mujeres /hombres. (Tabla 2). Para probar si la sensibilidad de la clasificación se podría aumentar mediante la inclusión de los datos clínicos, los valores de AFP se incluyeron en el análisis. Como se ve en la Tabla 2, la inclusión de los valores de AFP y 3 marcadores anti-glicanos aumento de la sensibilidad de la correcta clasificación de los estados de HCC al 80% (24 de 30) y el 74,5% (76 de 102), respectivamente, en femenino y masculino.
La utilidad diagnóstica de las tres anticuerpos anti-glicanos para el CHC
para evaluar si los niveles de anti-glicanos séricos pueden utilizarse como un marcador de diagnóstico potencial de HCC, las características de funcionamiento del receptor (ROC) se realizaron análisis de curva. Se puso de manifiesto que el suero 3 marcadores anti-glicanos, más los niveles de AFP es un marcador potencial para discriminar pacientes con HCC-HBV positivo de los controles sanos con una AUC (las áreas bajo la curva ROC) de 0,6843 (IC del 95%: 0,5882-0,7805) ( la Figura 6A). En el valor de corte de 0,4974, la sensibilidad y la especificidad de este marcador fue de 46.21% y 84.85%. El AUC de suero de 3 marcadores anti-glicanos más niveles de AFP para discriminar HCC-VHB positiva de VHB crónica (IC del 95%: 0,6215 a 0,7631) 0,6923 (Figura 6B). En el valor de corte de 0,5268, la sensibilidad y la especificidad de este marcador fue de 57.58% y 82.43%. Este resultado sugiere que estos 3 marcadores anti-glicano más AFP pueden ser aplicables al diagnóstico de HCC relacionado con el VHB.
Estos 3 anticuerpos anti-glicano produjeron un AUC (las áreas bajo la curva ROC) de 0,6843 ( IC del 95%: 0,5882 a 0,7805) con la sensibilidad 46.21% y 84.85% de especificidad para discriminar pacientes con HCC de controles sanos (a), y una AUC de 0,6923 (IC del 95%: 0,6215-0,7631) con la sensibilidad 57.58% y 82.43% para la HCC discriminar entre pacientes VHB-CLD (B).
Discusión
los marcadores tumorales en el suero de pacientes con HCC se pueden utilizar como herramientas de diagnóstico, factores pronósticos y parámetros de tratamiento [ ,,,0],24]. Utilizando nuestro microarrays de glicanos, se analizó el suero para buscar anticuerpos que permiten distinguir entre los pacientes con HCC y los individuos sanos. Este estudio ha demostrado el potencial de un microarray glicano para identificar CACAS candidatos de biomarcadores en el suero de los pacientes con HCC. En nuestro estudio, las diferencias en los niveles de anticuerpos en suero entre los pacientes con HCC y los individuos sanos eran sustanciales, con los niveles de anticuerpos para 7 de 58 glicanos diferencialmente abundantes (p & lt; 0,01). Estos eran los glicanos SLacNAc 6Entonces
3, DSGG, fucosiltransferasa GM1, Gb3, Gb2, B19, y Man7. Las alteraciones en la glicosilación en el cáncer, así como otras enfermedades, han atraído mucho interés y han demostrado potencial como fuente de marcadores de la enfermedad y como dianas para la inmunoterapia de los tumores [15]. Los cambios en los niveles de expresión de glicosiltransferasa conducen comúnmente a un aumento en el tamaño y la ramificación de glicanos ligados a N, lo que crea sitios adicionales para los residuos de ácido siálico terminales [25]. Un aumento correspondiente en la expresión de sialiltransferasa en última instancia, conduce a un aumento global de sialilación [26]. La sobreexpresión de las glicosiltransferasas que están implicadas en la vinculación de los residuos terminales de glicanos conduce a la sobreexpresión de ciertos epítopos de glicano terminales tales como SLacNAc 6Entonces
3, DSGG, y fucosil GM1 en tumores [27] - [29].
Se encontró que los niveles de anti-DSGG distinguir entre los pacientes con HCC y la EPC. DSGG es un glicoesfingolípidos disialyl con una estructura de núcleo-series globo [27]. En un estudio anterior, DSGG se identificó como una molécula de adhesión expresa en carcinoma de células renales, y su relación con el cáncer metastásico se demostró [27]. Nuestros datos son los primeros en sugerir que DSGG es altamente expresado en el CHC
Curiosamente, una diferencia de género se ha descrito para el CHC en casi todas las poblaciones de estudio, con un macho:. Proporción de mujeres para la incidencia de HCC con un promedio entre 2:01 y 4:01 [30]. Uno de los mecanismos que pueden explicar la disparidad de género observadas en la incidencia de carcinoma hepatocelular es el aumento de la actividad de los estrógenos en pacientes de sexo femenino, lo que puede ofrecer protección frente a hepatocarcinogénesis [22]. Además, es probable que haya otras moléculas reguladoras celulares implicados en la disparidad de género en la incidencia de carcinoma hepatocelular. En nuestro estudio, se observó una disparidad de género en niveles ligeramente diferentes de anticuerpos anti-carbohidrato. Los niveles de anti-fucosiltransferasa GM1 diferían en pacientes con HCC y VHB crónica o individuos sanos. Fucosiltransferasa GM1 pertenece a una clase de gangliósidos [28]. En un estudio anterior, fucosil GM1 está fuertemente asociada con el cáncer de células pequeñas del pulmón, y no se detectó este antígeno asociado al tumor con alta sensibilidad y especificidad usando un método de inmunofluorescencia [28]. El papel de este glicano en el cáncer no está claro. La glicosilación de los receptores de hormonas ha sido sugerido como una explicación de las diferencias de género en la enfermedad coronaria y el cáncer de próstata [31], [32]. Aunque la forma general de estas observaciones son de poblaciones con una etiología de las enfermedades más heterogéneo queda por examinar, los resultados presentados aquí acerca de los posibles biomarcadores de glucanos parecen bastante alentador. Recientemente, los métodos de análisis a gran escala se han desarrollado para la glicoproteoma suero humano, que es también una poderosa herramienta para el descubrimiento de dianas de diagnóstico y terapéuticos. Utilizando el análisis de glycoproteomic a base de la lectina, la glicoproteína (GP) 73 se encontró que era un nuevo marcador tumoral para el HCC [33]. Los niveles séricos de GP73 fueron significativamente superiores en pacientes con HCC, incluso en pacientes con HCC con los niveles séricos de AFP de menos de 20 ng /ml [24]. Se ha informado de fucosilación de GP73 que aumentar en los pacientes con HCC [33]. Un estudio anterior sugirió que fucosilación juega un papel importante en la interacción entre la interleucina-8 y su receptor, lo que induce la migración de células de cáncer en HCC [34]. Nuestros resultados actuales sugieren que fucosiltransferasa GM1 es un candidato hepáticas biomarcadores cacas.
HCC está asociada con la infección por el VHB en aproximadamente el 50% de los casos [35]. En este estudio, se observó que cinco tipos de anticuerpos anti-glicano se incrementaron en los pacientes con infección por el VHB y el CHC. Por lo tanto, se extrapola que el aumento de los anticuerpos y la infección por HBV están relacionados. Las marmotas se utilizan como modelo animal preferido de la infección por VHB crónica [36]. Este modelo recapitula la progresión de la enfermedad de la infección por HBV en HCC y ha documentado similitudes en la glicosilación de proteínas con HCC humano [36]. Como CHC suele tardar años en desarrollarse como resultado de la infección crónica por VHB, la investigación de los primeros eventos en el modelo de marmota de infección por el VHB puede proporcionar información útil acerca de posibles marcadores biológicos para el pronóstico de HCC. Las influencias biológicas que impulsan estos cambios requieren un examen más detenido.
La AFP es el único marcador serológico utilizado actualmente para la detección clínica de HCC. Aunque AFP mejora la detección de HCC, un número significativo de pacientes con CHC no tienen niveles elevados de AFP, y por lo tanto, se necesitan biomarcadores adicionales para aumentar la sensibilidad de detección de HCC [37], [38]. En investigaciones anteriores, la AFP ha mostrado una sensibilidad limitada (41-65%) en el diagnóstico de HCC [39]. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de descubrir biomarcadores adicionales para la detección y el diagnóstico de HCC. Nuestro estudio comparó pacientes con HCC y la EPC, más saludable, y estos glicanos 3 proporciona una mejor sensibilidad que la AFP. Por otra parte, la sensibilidad de 3 anticuerpos anti-carbohidrato más AFP proporciona una mejor sensibilidad del diagnóstico.
Además, no hubo correlación entre los niveles de estos 3 anticuerpos anti-glicano y la etapa de tumor (datos no mostrados). Por lo tanto, se sugiere que los 3 anticuerpos anti-carbohidrato pueden ser como biomarcadores para el inicio de la formación de tumores, pero no la progresión del tumor. Un examen más detallado utilizando un grupo de pacientes más grande y un proceso de validación que incluye recogen de forma prospectiva se necesitan muestras de pacientes para verificar nuestras observaciones. Estos nuevos biomarcadores CACAS, en combinación con otros biomarcadores serológicos existentes, pueden ser valiosos en el diagnóstico de HCC. En base a los resultados, se sugiere que la combinación de análisis de microarrays de glicanos con las mediciones de AFP proporcionará una herramienta mucho mejor para el diagnóstico de HCC que el uso de la AFP solo.
Los biomarcadores se han buscado durante mucho tiempo para su diagnóstico, pronóstico y terapéutico usos. Sin embargo, no hay biomarcadores fiables para la mayoría de los tumores sólidos, incluyendo HCC. Los métodos descritos en nuestro estudio son útiles para la identificación de posibles marcadores biológicos de la enfermedad. El desarrollo de un microarray de glicanos ha permitido a alta sensibilidad y análisis de alto rendimiento de las interacciones proteína-carbohidrato y ha contribuido a avances significativos en glycomics. Este enfoque proporciona una poderosa herramienta para la investigación básica y una técnica prometedora para el diagnóstico médico y la detección de patógenos y el cáncer [20]. Este método requiere cantidades muy pequeñas de material y es más eficaz y sensible que el método tradicional ELISA; por lo tanto, proporciona otra plataforma para monitorear la respuesta inmune a los hidratos de carbono epítopos en diferentes etapas durante la diferenciación, la metástasis, y el tratamiento [21]. Nuestra investigación actual se identificaron cinco CACAS biomarcadores para el diagnóstico de HCC que necesitan ser evaluados más en el trabajo futuro. Identificación de CACAS será útil en el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer tales como la generación de vacunas o anticuerpos dirigidos CACAS [14], [19], [40] - [42]. Creemos que el microarray glicano es un método viable para el diagnóstico clínico de HCC. Este método debe mejorar el pronóstico y puede ofrecer conocimientos sobre el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para otros tipos de cáncer. Nuevos antígenos glicanos pueden demostrar ser dianas útiles de vacunas de carbohidratos existentes y los que están en desarrollo.
En conclusión, hemos demostrado que el análisis de microarrays glicano utilizado para identificar nuevos candidatos biomarcadores de glicano para HCC puede ser útil en el cribado de biomarcadores séricos para el CHC. Los biomarcadores candidatos que hemos identificado mediante análisis de microarrays de glicanos mostraron buena sensibilidad predictiva en la población estudiada, y en general, que eran superiores a la AFP. Además de los resultados anteriores a las pruebas de función hepática convencionales de hecho puede mejorar la precisión diagnóstica de las enfermedades del hígado. el análisis de microarrays de glicanos proporciona una poderosa herramienta para la alta sensibilidad y detección de alto rendimiento de anticuerpos séricos contra cacas, y los biomarcadores séricos identificados puede ser útil para la detección precoz de CHC en poblaciones de alto riesgo.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
el protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Revisión de sujetos Humanos Comité de Ética de Investigación del hospital de la Universidad Cheng Kung de Taiwán (Nº ER-99-176). Además, el consentimiento informado por escrito se obtuvo de los participantes para el uso de su sangre en este estudio.
Las muestras de suero
Las muestras de suero de individuos sanos (n = 33), VHB crónica (n = 133 ), la hepatitis C crónica (n = 134) y los pacientes con HCC (n = 293) se recogieron en el hospital de la Universidad Nacional Cheng Kung en Tainan, Taiwán. Las muestras fueron codificadas para proteger la confidencialidad del paciente y se utilizan bajo un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Sujetos Humanos de Investigación Comité de Ética del Hospital de la Universidad Cheng Kung en Tainan, Taiwán. Los pacientes fueron diagnosticados utilizando una combinación de datos (clínicos, de laboratorio y hallazgos de imagen y /o biopsia). Todas las muestras fueron almacenadas a -20 ° C hasta su uso.
Métodos generales
diapositivas Nexterion H fueron adquiridos de SCHOTT Norteamérica. El recubrimiento sobre la SCHOTT Nexterion Slide H consiste en una capa de polímero reticulado, multi-componente activado con ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) para proporcionar la inmovilización covalente de grupos amina. El procedimiento general para la síntesis de glucanos se llevó a cabo según lo informado [20], [21], [43]
glicanos Microarray fabricación
Los microarrays se imprimieron. (BioDot; cartesianas Technologies) con una pin robótico (SMP3; TeleChem International) con una deposición de ≈ 0,7 nL de diversas concentraciones de glicanos que contienen amina en tampón de impresión (300 mM de tampón de fosfato [pH 8,5] que contiene 0,005% de Tween-20) a partir de una placa de microtitulación de 96 pocillos en NHS-recubierto portaobjetos de vidrio. Las diapositivas fueron vistos con 50 soluciones uM de cada glicano, con dos filas de abajo hacia arriba y cinco repeticiones verticales en cada subconjunto. Cada diapositiva fue diseñado para 14 cuadrículas. diapositivas impresos se dejaron reaccionar en una atmósfera de 80% de humedad durante 1 h seguido de la noche a la desecación. Las diapositivas fueron almacenadas a temperatura ambiente en un desecador hasta su uso. Antes de que el ensayo de unión, los portaobjetos se bloquearon con etanolamina (etanolamina 50 mM en tampón de borato 50 mM [pH 9,2]) y después se lavaron dos veces con agua y tampón fosfato salino (PBS) (pH 7,4).
Microarray Análisis de muestras de suero
las muestras de suero de pacientes con HCC y los individuos sanos se diluyó 1:20 con un tampón que consiste en 0,05% de Tween 20 y 3% de BSA en PBS (pH 7,4), aplicado a las rejillas de la microarrays de glicano, y después se incubaron en una cámara humidificada con agitación durante 1 h. Los portaobjetos a continuación se lavaron tres veces cada uno con 0,05% de Tween 20 en PBS (pH 7,4), PBS (pH 7,4), y H
2O. A continuación, se añadió de cabra conjugado con Cy3 anti-humana de anticuerpos IgG (Jackson ImmunoResearch) a los portaobjetos, como se describe anteriormente, y los portaobjetos se incubaron en una colcha en una cámara humidificada con agitación durante 1 h. Los portaobjetos se lavaron tres veces cada uno con 0,05% de Tween 20 en PBS (pH 7,4), PBS (pH 7,4), y después se secaron H
2O, y. Las diapositivas fueron escaneadas a 532 nm (para anticuerpo secundario conjugado con Cy3) con un lector de chips de fluorescencia de microarrays (arrayWoRx lector de microarrays).
Análisis de Datos
El software GenePix Pro (Axon Instruments) se utilizado para el análisis de fluorescencia de los datos extraídos. El fondo local fue restada de la señal en cada punto de anticuerpo. Las medianas de "relaciones" de puntos replicados se promediaron en la misma matriz. Para obtener las intensidades de unión relativas de glicanos en sueros humanos, establecimos la intensidad de unión para GB5 al 100% y se normalizaron las intensidades de unión relativas de cada análogo glicano para cada muestra de suero. La relación de anti-glicano: anti-GB5 en el suero se calculó dividiendo la intensidad de unión relativa media de repeticiones de glicano por la intensidad de unión relativa media para GB5 replica, y los resultados se expresaron como porcentajes. La sensibilidad se calcula como la relación entre el número de muestras de HCC que fueron clasificados correctamente como HCC (verdaderos positivos) al número total de muestras de HCC. Por último, se realizó un análisis estadístico de los niveles de IgG en pacientes con HCC y los individuos sanos utilizando una de Student para datos independientes
t-test
. (ROC) curvas características de operación del receptor se construyeron y el área bajo la curva (AUC) se calculó para evaluar la especificidad y sensibilidad de la predicción de los casos y controles. El análisis de datos se realizó usando Prism 5 (GraphPad Software, Inc.) y el software SigmaPlot 9.0 (Sigma Plot).
Apoyo a la Información
Figura S1.
Síntesis de glicanos. El método de composición química se utiliza para sintetizar 58 antígenos de carbohidrato
doi:. 10.1371 /journal.pone.0039466.s001 gratis (TIF)