Extracto
semiconductores representan una nueva clase de fluoróforos con propiedades físicas y químicas únicas que podrían permitir a un ensanchamiento notable de las aplicaciones actuales de formación de imágenes fluorescentes y diagnóstico óptico. Los complejos de puntos cuánticos y los anticuerpos son prometedores agentes que visualizan para la detección de biomarcadores fluorescentes selectivos sobreexpresados en los tejidos tumorales. A continuación se describe la construcción de complejos fluorescentes de autoensamblado de puntos cuánticos y anticuerpos anti-HER2 /neu scFv anti-HER1 o y sus interacciones con las células tumorales cultivadas. Una estrategia de unión basado en una interacción no covalente muy específica entre dos proteínas, barnasa y barstar, se utiliza para conectar los puntos cuánticos y los anticuerpos dirigidos. Esta estrategia permite combinar las funciones de orientación y visualización simplemente variando los módulos correspondientes del complejo fluorescente
Visto:. Zdobnova TA, Stremovskiy OA, Lebedenko ES, Deyev SM (2012) auto-montaje Complejos de Quantum Dots y anticuerpos scFv para Cancer Cell Orientación e Imagen. PLoS ONE 7 (10): e48248. doi: 10.1371 /journal.pone.0048248
Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: July 9, 2012; Aceptado 21 de septiembre de 2012; Publicado: 25 Octubre 2012
Derechos de Autor © 2012 Zdobnova et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por la Fundación rusa para la Investigación básica (nn proyecto. 12-04-00757-a, 11-04-12091-ofi-m-2011 y 10-04-01506), Presidium de la Academia rusa de Ciencias (Molecular & amp ; Biología celular y nanotecnologías & amp;. Nanomateriales) y el Ministerio de Educación y Ciencia de la Federación rusa (nn proyecto 16.740.11.0497, 14.740.11.0253, 16.512.11.2053 y 11.g 34. 31.0017). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Entre los principales métodos de visualización fluorescente de tumores es el basado en la detección de biomarcadores selectivos sobreexpresados en los tejidos tumorales que permite que revela el tipo de tumor, los procesos metastásicos, resistencia a los medicamentos tumor, etc. [1]. agentes de contraste utilizados para este propósito generalmente constan de dos partes, o módulos:. un módulo de visualización que es responsable de la detección de objetivos y una orientación que se une selectivamente a un determinado tipo de célula
En la última década, semiconductor fluorescente nanocristales, conocidos como puntos cuánticos (QD), han atraído mucho la atención como agentes de visualización para aplicaciones biológicas. Entre las propiedades más ventajosas de QD son la notable brillo de la fluorescencia, fotoestabilidad, gran excitación y espectros de emisión estrecho, y una rica paleta de bandas de emisión espectralmente sintonizables, etc. Estas propiedades permiten el etiquetado multicolor y la identificación simultánea de varios objetos biológicos, así como a largo plazo bio-imágenes [2].
como un módulo de orientación, los anticuerpos scFv parecían ser más prometedor para ambos
in vitro Opiniones y
in vivo sobre las aplicaciones [ ,,,0],3]. Los anticuerpos scFv consisten en una cadena polipeptídica única que combina los dominios variables de ligera de inmunoglobulina y cadenas pesadas que están conectados a través de un enlazador peptídico. Tales derivados de anticuerpos pueden ser producidos en sistemas de expresión bacterianos como proteínas estables que mantienen la especificidad de antígeno de un anticuerpo de longitud completa, pero que carece del dominio Fc que es responsable de la función efectora de las inmunoglobulinas y es generalmente indeseable para aplicaciones in vivo de orientación.
En este trabajo, en busca de anticuerpos modelo (como un módulo de orientación), elegimos antitumoral 425scFv [4] y 4D5scFv [5], que se unen selectivamente a Oncomarcadores HER1 /EGFR y HER2 /neu, respectivamente. Estos Oncomarcadores son proteínas transmembrana de la familia de los receptores del factor de crecimiento epidérmico que se sobreexpresan en muchas células tumorales y tienen una gran importancia diagnóstica y pronóstica [6]. Anteriormente, estos scFv se han utilizado con éxito para la administración dirigida de proteínas fluorescentes y agentes terapéuticos a las células tumorales [7], [8], [9], [10].
En la actualidad, existen dos enfoques de QD conjugación con agentes de direccionamiento: conjugación directa y la conjugación a través de moléculas adaptadoras. conjugación directa no es un método óptimo porque agentes de direccionamiento se alteran durante el procedimiento de conjugación. Por ejemplo, anticuerpos conjugados con QD conservan su especificidad por el antígeno, pero su afinidad pueden disminuir de manera significativa. [11]. Por otra parte, la conjugación directa de QD a un anticuerpo dirigido requiere probar la actividad del anticuerpo en cada caso particular
El uso de adaptadores de autoensamblaje -. Moléculas de unión "adheridos", pequeña y eficaz y específicamente el uno al otro sin la formación de homodímeros, que parece ser un método más prometedor de la unión del anticuerpo dirigido a los puntos cuánticos. En este trabajo, presentamos el sistema de barnasa-barstar (BBS) como una herramienta universal para la producción de complejos fluorescentes de diferente selectividad y parámetros de fluorescencia sobre la base de anticuerpos scFv QDs y para la visualización de las células tumorales.
Materiales Métodos y
expresión bacteriana y purificación de proteínas recombinantes
El barstar mutante C40 /82A (en adelante denominado barstar), de tipo salvaje barnasa [7], [12], anti-recombinante HER2 /neu 4D5scFv y anticuerpos anti-HER1 425scFv [13], así como (4D5scFv) proteína de fusión
2-Bn [14] se produjeron en
Escherichia coli
y purificado como se describe anteriormente [7].
el plásmido de expresión para la proteína de fusión 425scFv-B se construyó sobre la base del plásmido PSD-4D5scFv-barstar [15] (
Figura 1 |). manipulaciones de ingeniería genética, cultivo de células y lisis celular se realizaron de acuerdo con protocolos estándar. El fragmento de ADN que codifica la proteína 425scFv se amplificó a partir de un plásmido pKM30425M1ChCl [4] usando cebadores 5'GACTCGATATCGAAGTGCAACTGCAGCAGTC y 5'CTGTGGAATTCCCGTTTGATCTCCAGTTCTG. El producto de amplificación se clonó en el plásmido PSD-4D5scFv-barstar en lugar de gen 4D5scFv usando EcoRV y EcoRI endonucleasas de restricción. El resultado PSD-425-B-Su
6 construcción fue verificada por secuenciación.
El 425scFv-B-Su
6 construcción comienza con una etiqueta corta FLAG N-terminal (F, azul oscuro ) seguido de 425scFv en V
H-enlazador-V
L orientación (V
H, cian; L, gris; V
L, turquesa), enlazador bisagra 16-amino-ácido (verde ), barstar (púrpura). El constructo termina con un Su
6-tag (azul oscuro) unido al C-terminal de la proteína de fusión 425scFv-barstar. El gen de fusión está bajo el control de la
lac
promotor.
OmpA CD - el péptido señal para la secreción dirigida de la proteína recombinante a la
E. coli
periplasma.
Para la producción de 425scFv-B que contiene Su
6-etiqueta en
C-terminal
, el
Escherichia coli cepa
BL21 se transformó con PSD-425-B-Su
6 y crecido en caldo lysogeny (LB) a 28 ° C. La expresión 425scFv-B fue inducida por la adición de IPTG 0,5 mM a una OD
550 de 0,8. Las bacterias se incubaron a continuación a 28 ° C durante 12 h. Las células se recogieron, se centrifugaron y el sedimento se resuspendió en tampón de lisis (0,01 M Tris-HCl, pH 8,3, con 0,1 M NaCl y 10 mM EDTA) y se sonicaron en hielo. El lisado se centrifugó a 22.000 g durante 30 min a 4 ° C. El sedimento se utiliza para la purificación de su
proteína 6-tagged en Ni
2 + columna NTA (Qiagen) en condiciones desnaturalizantes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La proteína se desnaturalizó con 8 M urea, replegada durante 5 h usando un gradiente lineal 8-0 M urea y se eluyó con imidazol 250 mM. Para la purificación final del 425scFv-B, fracciones de elución se diluyeron 20 veces, aplican sobre Q Sepharose FF columna de 1 ml (GE Healthcare) y se eluyeron usando un gradiente lineal de 0 a NaCl 500 mM.
SDS /PAGE análisis de las proteínas se realizó de acuerdo a los protocolos estándar utilizando 14% (para la barnasa y barstar) o 12,5% (para las otras proteínas recombinantes) geles de poliacrilamida.
QD conjugación
puntos cuánticos con la emisión de fluorescencia máxima a 565 o 605 nm se utilizaron para el diseño del módulo de visualización. Los puntos cuánticos recubierta con grupo carboxilo (Qdot 565 ITK ™ carboxilo puntos cuánticos y Qdot 565 ITK ™ carboxilo puntos cuánticos, Invitrogen) se conjugaron con cualquiera de las proteínas BBS usando química de acoplamiento EDC /NHS. 2 M puntos cuánticos en 0,1 M de MES (pH 6,0) y 0,5 M NaCl fueron activados primero con EDC (~ 2 M) y NHS (~ 5 M) a temperatura ambiente durante 15 min. La mezcla de reacción se aplicó a la columna Sephadex G-25 y se eluyó con un tampón que contiene Na2B4O7 mM 40 mM KH2PO4 y 30, pH 8,0. partículas Siguiente, se eluyó activados se mezclaron con barstar o barnasa disuelto en el mismo tampón y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se aplicó sobre una columna Sephadex G-25 y las proteínas no unidas se eluyeron con PBS (pH 7,4). Los QD: relaciones molares de proteína se optimizaron para cada proteína
electroforesis en gel de agarosa
Electroforesis de puntos cuánticos y QD-conjugados se realizó usando 1% en gel de agarosa en tampón TAE (50 mM Tris-acetato. , EDTA 1 mM, pH 7,6) a 10 V /cm durante 30 min. Los puntos cuánticos se diluyeron en TAE y se mezclaron con 6 x tampón de carga (50% de glicerol, 0,1% azul de bromofenol) antes de cargar sobre el gel. Los geles se visualizaron con el sistema Multi Transiluminador Doc-It Digital Imaging.
actividad barnasa Barstar y el ensayo
La actividad de ribonucleasa de barnasa, (4D5scFv)
2-BN y QD-Bn conjugados se ensayó con el ensayo de precipitación de ARN insoluble en ácido se describe en [16], con la modificación de todos los volúmenes de solución a escala hacia abajo 5 veces. La actividad de barstar, 425scFv-B, y conjugados QD-B fue evaluada por su capacidad para inhibir la actividad de ribonucleasa de la barnasa. Barnasa a una concentración constante de 26 nM se incubó con diluciones seriadas al doble de barstar, 425scFv-BS, o QD-BS conjugados. Las soluciones obtenidas se utilizaron en el ensayo de Rushizky [16].
Evaluación de la afinidad de anticuerpos
Las mediciones de una constante se realizaron utilizando instrumentos de BIAcore de disociación (BIAcore 3000). p185 recombinantes
HER2-ECD o dominio extracelular de EGFR (Sino Biológica, Inc.) se acopló a un chip CM5 a una densidad de 4500 RU mediante química de acoplamiento de amina estándar. Todas las proteínas se utilizaron a cuatro concentraciones (1 M, 330 nM, 110 nM y 37 nM) en HBS-PE (0,1 M HEPES, pH 7,4, 0,15 M NaCl, EDTA 3 mM, 0,005% de Tween-20). Los sensograms se obtuvieron con un caudal de 5 l /min a 25 ° C. La fase de disociación se prolongó durante 20 min.
Los cultivos de células
El adenocarcinoma de ovario humano Skov-3 (HTB-77, ATCC), el carcinoma epidermoide humano A431 (CLR-1555), y de hámster chino células de ovario de CHO (en ruso Cell Culture Collection) fueron cultivadas en medio 5A de McCoy (por SKOV-3) o RPMI-1640 (para A431 y CHO) con 10% (v /v) de suero de ternera fetal (Hyclone) y 2 mM
L
-glutamine. Las células fueron cultivadas en 5% de CO
2 a 37 ° C.
etiquetado de la célula y la imagen
Para obtener imágenes de células HER2 /neu-dirigido, Skov-3 células que sobreexpresan HER2 /neu fueron se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 2 × 10
4 células por pocillo y se cultivaron durante la noche. Las células se lavaron dos veces con PBS (pH 7,4) antes de la tinción. Todas las proteínas y los conjugados de QD se disolvieron en PBS (pH 7,4). Después de un breve lavado con PBS frío, las células fueron incubadas posteriormente con el (4D5scFv)
2-Bn proteína de direccionamiento a una concentración final de 30 nM y después con 80 nM QD
605-B o QD
565-B en conjuga durante 40 min a 4 ° C. Después de cada etapa de incubación, las células se lavaron tres veces con PBS frío (pH 7,4). Los resultados de marcaje de las células se analizaron con un microscopio de fluorescencia invertido Axiovert 200 (Zeiss, Alemania). Las imágenes se obtuvieron utilizando una cámara CCD (AxioCamHRc, Zeiss, Alemania) y el software AxioVision (Zeiss, Alemania).
imágenes de células HER1 dirigida se realizó de manera similar, el uso de células A431 HER1 que sobreexpresa, 425scFv-B en el módulo de orientación y QD
605-BN o QD
módulos de visualización de 565 a Bn.
La citometría de flujo análisis
Para el análisis de citometría de flujo, las células se sembraron en placas de 6 pocillos (Corning) a una densidad de 4 x 10
3 células por pocillo y se cultivaron durante la noche. Las células se tiñeron como se describe anteriormente. Las células teñidas se separaron con PBS (pH 7,4) que contiene EDTA 5 mM y se centrifugó. El sedimento se resuspendió en 1 ml de PBS (pH 7,4) que contiene azida de sodio al 0,1%. la intensidad de fluorescencia asociada a las células se midió usando un flujo FACS Calibur citómetro (BD Bioscience) en una longitud de onda de excitación de 488 nm (láser de argón). Se analizó la fluorescencia de al menos 10.000 células por muestra. autofluorescencia celular se estimó utilizando células tratadas con PBS como controles.
in vitro
análisis de citotoxicidad
La citotoxicidad de los puntos cuánticos utilizados, se evaluó sus conjugados y complejos en la línea celular utilizando ensayo de microtitulación. Las células Skov-3 se sembraron a una densidad de 4 × 10
3 células por pocillo en una placa de 96 pocillos, y se dejó que se unieran durante la noche. A continuación, las células se incubaron con PBS (pH 7,4) que contenía diferentes concentraciones de sondas QD a 4 ° C durante 1 h. Después de la incubación las células se lavaron tres veces con PBS frío (pH 7,4) y se cultivaron durante 48 h en condiciones standart. Después de 48 h, la viabilidad celular se estimó por el ensayo de MTT standart como se describe en [9]. La viabilidad celular se expresó como porcentaje de la densidad óptica de las células no tratadas a partir de dos experimentos realizados por triplicado
Resultados
Estrategia general:. El sistema de barnasa-barstar
nuestros trabajos anteriores, el sistema de barnasa-barstar (BBS) fue desarrollado inicialmente para el anticuerpo multimerización [15], [17]. La ribonucleasa barnasa bacteriano de
amyloliquefaciens
Bacillus y su inhibidor natural barstar son pequeñas proteínas (12 y 10 kDa, respectivamente) con muy alta afinidad de unión (K
d~10
-14 M) [18], que es comparable con afinidad de estreptavidina-biotina interacción [19]. Aquí hemos utilizado estas proteínas como adaptadores moleculares para obtener una serie de complejos fluorescentes de autoensamblaje basados en puntos cuánticos con diferente especificidad anti-tumor y el color (
Tabla 1
). Las sondas se componen de un módulo de visualización, a saber, los puntos cuánticos conjugados a una de las proteínas BBS (ya sea barstar o barnasa), y un módulo de orientación, es decir, los anticuerpos anti-tumorales fusionados a la proteína BBS pareja (ya sea barnasa o barstar, respectivamente ) (
figura 2A
). Los módulos resultantes visualización y de orientación se pueden combinar de diferentes maneras dependiendo de la especificidad molecular y las propiedades ópticas necesarias para una tarea en particular bioimagen (
figura 2B
).
La unión de los puntos cuánticos a través de anticuerpos scFv se muestran los adaptadores moleculares barnasa-barstar (a) y el constructor molecular basado en BBS que comprenden un conjunto de fluorescencia variable y segmentación módulos (B)
orientación módulo:. construcción y caracterización de reconocimiento proteínas
anticuerpos
anti-HER1 425scFv y anti-HER2 4D5scFv fueron utilizados como moléculas para la entrega dirigida de los puntos cuánticos a las células tumorales. Obtuvimos una serie de proteínas de fusión 425scFv y 4D5scFv con barnasa o barstar en diferentes combinaciones. Dos proteínas de fusión con los rendimientos más altos de expresión fueron elegidos como los módulos de orientación para la prestación de los puntos cuánticos: monovalente 425scFv fusionado a barstar (425scFv-B) y divalente 4D5scFv fusionan a barnasa ((4D5scFv)
2-Bn)
Orientación de las proteínas de fusión se produjeron en
E. coli
y se purificó como se describe en Materiales y Métodos. Las proteínas obtenidas fueron del peso molecular esperado y la homogeneidad según SDS-PAGE (
Figura
3A). La constante de disociación del (4D5scFv)
2-Bn de la p185 purificados
HER2-ECD era ~2.2 nM. Este valor concuerda bien con la del anticuerpo parental 4D5scFv (~5.2 nM). La actividad enzimática de la preparado (4D5scFv)
2-Bn evaluada por ensayo de precipitación de ARN insoluble en ácido [16] era de ~ 8% de la actividad barnasa nativa (
Figura 3B
). Para la comparación, la actividad de la barnasa fusionado a diferentes proteínas se ha informado de que ~ 75% por cada molécula de enzima en proteínas 4D5scFv-dibarnase [7] y ~ 80% para barnasa fusionado a la exotoxina A de
Pseudomonas aeruginosa
[20]. Presumiblemente, la fusión de dos moléculas de anticuerpo a barnasa resultados en efecto el impedimento estérico y la disminución concomitante de la actividad de RNasa.
(A) 12% de SDS-PAGE de confirmar la purificación de (4D5scFv)
2-Bn ( a, 71 kDa) y 425scFv-B (a ', 40 kDa), Brillian Coomassie Blue R-25 gel teñido; se muestran marcador de proteína estándar (M) y los carriles de proteínas de fusión (p). (B) la actividad RNAsa de (4D5scFv)
2-Bn (línea continua) en comparación con la actividad de la barnasa libre (línea discontinua) y evaluado con ensayo de precipitación de ARN insoluble en ácido. (C) La inhibición de la barnasa libre por 425scFv-B (línea continua) en comparación con la inhibición por barstar libre (línea discontinua).
La constante de disociación del (4D5scFv)
2-Bn de el EGFR purificado fue de ~ 2 M. El patrón de la inhibición de la barnasa por 425scFv-B fue similar a la de barstar libre (
figura 3C
). Por lo tanto, el resto de la proteína de fusión barstar 425scFv-B mantiene su funcionalidad
Visualización de módulos fluorescentes:. Conjugación de los puntos cuánticos con las proteínas BBS
Los siguientes conjugados QD con las proteínas BBS se obtuvieron para su posterior utilizar como visualizar módulos fluorescentes: QD
605-B, QD
605-Bn, QD
565-B, y QD
565-Bn. Los puntos cuánticos para ser utilizado en combinación con el módulo de orientación que contiene barnasa-((4D5scFv)
2-Bn) se conjuga con barstar, mientras que los que se utilizarán con el módulo que contiene barstar-(425scFv-B) se conjuga con la barnasa. Barnasa y barstar se conjugaron con los puntos cuánticos usando química de acoplamiento EDC /NHS. En el curso de la reacción, los grupos carboxilo activados en la superficie de los puntos cuánticos reaccionan con los grupos -amino de los residuos de lisina de proteínas, así como el grupo α-amino del residuo N-terminal que resulta en la formación de enlaces amida estables.
la eficiencia de la etapa de conjugación se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa (
figura 4A
). En las condiciones de explotación en la configuración de electroforesis (pH 7,6), los puntos cuánticos no conjugados están cargadas negativamente, y por tanto migran del cátodo al ánodo (
Figura 4A
,
carril 1, 4
). Tras la adición de las proteínas BBS a la suspensión QD, la movilidad electroforética de las nanopartículas parece estar afectada de diferentes maneras, dependiendo de la proteína añadida. El patrón de migración de la mezcla de los puntos cuánticos y barstar cargado negativamente (pI 4,6) es similar a la de los puntos cuánticos libres (
Figura 4A
,
carril 2
) .En contraste, la adición de positivamente barnasa cargada (pI 9,8) que pueden unirse a los puntos cuánticos debido a la atracción electrostática dio lugar a un patrón de migración manchada (
figura 4A
, carril 5)
.
(a) la movilidad electroforética de los puntos cuánticos y QD -conjugates en gel de agarosa al 1%, en tampón de Tris-acetato-EDTA (pH 7,4). Puntos cuánticos van de cátodo (-) para el ánodo (+). Carriles: 1 - QD
605, 2 - mezcla de QD
605 y barstar (sin EDC), 3 - QD
conjugado 605-B, 4- QD
565, 5 -mixture de QD
565 y barnasa (sin EDC), 6 - QD
565 Bn-conjugado. (B) los espectros de fluorescencia normalizada de QD
565 (línea azul), QD
605 (línea violeta) y sus conjugados, QD
565-Bn (línea verde) y QD
605-B ( línea roja). (C) La actividad de ribonucleasa de QD
605-Bn (línea roja y círculos) y barnasa libre de inhibición de la actividad RNAsa de QD
605-B (línea azul y cuadrado). QD
605 (línea verde) no afectan a la actividad ribonucleasa de barnasa.
Conjugación covalente de los puntos cuánticos con las proteínas BBS utilizando EDC reticulante dado lugar a una alteración significativa de los patrones de migración. conjugados QD-B exhibieron movilidad más baja que los puntos cuánticos iniciales o la mezcla de los puntos cuánticos y barstar libre, lo que indica éxito funcionalización de la superficie QD (
figura 4A
, carril 3
). conjugados QD-Bn apenas dejan los pocillos del gel de agarosa, presumiblemente debido a la neutralización de la carga negativa del QD en conjugación con barnasa (
figura 4A
, carril 6
) .También probados proteínas QDs y el BBS para la retención de sus propiedades dentro de los conjugados. medidas de espectroscopia de fluorescencia demostraron que los espectros de emisión, así como los rendimientos cuánticos de fluorescencia QD después de la conjugación de barnasa o barstar se mantuvieron prácticamente sin cambios (
figura 4B
). El ensayo de precipitación de ARN insoluble en ácido [16] indica que los conjugados QD-Bn conservan las propiedades funcionales de la barnasa, es decir, la actividad de ribonucleasa, y conjugados QD-B conservan actividad de inhibición de la barnasa capacidad y de unión barnasa-(
Figura 4C
).
imágenes de células vivas
HER1- y líneas celulares de cáncer con sobreexpresión de HER2, incluyendo epidermoide humano A431 (3 × 10
6 receptores de HER1 /celular [21]) y el carcinoma de ovario humano Skov-3 (2,6 x 10
5 HER2 /neu receptores /célula [22]) las células, fueron elegidos para poner a prueba la tinción específica de las células tumorales con complejos fluorescentes de autoensamblaje. Se han usado HER1- y HER2 /hámster chino células de ovario neu-negativo (CHO) como controles.
Un problema importante para la imagen celular con los puntos cuánticos es que las sondas QD tienden a ser "pegajosa" y, a menudo se unen de forma no específica a la membrana celular, las proteínas, y la matriz extracelular [23], [24], [25], [26], [27], [28], [29]. La unión no específica depende de las propiedades superficiales de QD y las líneas celulares utilizadas. Se evaluó la no específica propiedades de los puntos cuánticos carboxilados iniciales utilizados para la construcción de la sonda fluorescente de unión. Como se muestra en
figura 5 gratis (
Aa y B - línea verde
), una considerable unión no específica se observa con QD
605 se incubaron con Skov-3, las células A431 y CHO en 4 ° C. Atribuimos el nivel de unión no específica a las interacciones electrostáticas de los puntos cuánticos con carga negativa con la superficie celular. En consecuencia, para la tinción dirigida y específica de las células tumorales con los puntos cuánticos, es necesario no sólo para asegurar la correcta orientación de la oncomarker de interés, sino también para disminuir la unión no específica de los puntos cuánticos. Para reducir la unión no específica, los puntos cuánticos se modifican a menudo con poli (etilenglicol) (PEG), un polímero hidrófilo utilizado habitualmente para tales propósitos en aplicaciones biológicas. Pero, en el presente trabajo la necesidad de PEGilación se puede evitar. Sorprendentemente, se encontró que QD conjugación tanto a la BBS proteínas - barnasa y barstar - disminuye la unión no específica de los puntos cuánticos a la superficie celular. Cuando las células se incubaron con QD
605-B o QD
605-Bn a 4 ° C, se detectó débil o ninguna señal fluorescente en la superficie celular, lo que indica que los puntos cuánticos conjugados a proteínas BBS tienen no despreciable específicos de unión (
Figura 5
, Ab y la línea B-naranja por QD
605-B o línea amarilla por QD
605-Bn
). Se obtuvieron resultados similares para QD
565 y sus conjugados. Por lo tanto, el uso de las proteínas BBS permitió no sólo la unión de los puntos cuánticos con la orientación por anticuerpos, sino también reducir la unión no específica de los puntos cuánticos a la superficie celular
.
(A) La microscopia óptica de las células A431 HER1overexpressing que se incubaron previamente con QD
605 (a), QD
605-Bn (b), 425scFv-B y QD
605-Bn (c). Se utilizaron células CHO HER1-negativos como controles para la tinción con 425-B y QD
605-Bn (d). Como control adicional de ensayo de unión competitiva de libre 425scFv y anti-HER1 425scFv-B /QD complejo
605-Bn se llevó a cabo (e). fila de la izquierda, la imagen de campo brillante; fila de la derecha, imagen de fluorescencia con excitación a 488 nm y 605 nm picos de emisión. (B) La citometría de flujo de SKOV-3, A431 & lt; $ & gt; \\ raster (70%) = "rg1" & lt; $ & gt; Las células CHO incubadas con QD
605 (línea verde), QD
605-Bn (línea amarilla), QD
605-B (línea naranja), (4D5scFv)
2-BN y QD
605-B (línea roja), 425scFv-Bsand QD
605-Bn (línea azul).
El "etiquetado específico armament'of conjugados de proteína QD-BBS con la orientación anticuerpos permitido y obtención de imágenes de células tumorales. La estrategia general para el etiquetado de las células tumorales específicas por fluorescentes complejo QD-scFv auto-montaje basado en el sistema BBS se ilustra en la
figura 6
(izquierda)
. Las células tumorales se pre-incubaron con proteína de fusión de orientación y luego se tiñeron con conjugados de proteína QD-BBS. módulo de Visualización se conecta al módulo de orientación asociada a las células a través de la interacción barnasa-barstar. Por lo tanto, el QD
605-Bn conjugados con eficacia tiñeron HER1 en la superficie de las células A431 después de que las células se incubaron con el 425scFv-Bs proteína de direccionamiento (
Figura 5
, Ac
) . Del mismo modo, Skov-3 que sobreexpresan HER2 células /neu se obtuvieron imágenes mediante tratamiento secuencial con (4D5scFv)
2-BN y QD
605-B. Los controles con HER1- y células CHO HER2 /neu-negativos no mostraron tinción, lo que indica la especificidad de unión de los complejos de auto-montaje específicos. Además, cuando las células A431 se trataron con anti-HER1 complejo fluorescente y 425scFv libre (relación molar 01:02), la unión de complejo a la membrana celular fue completamente bloqueado (
Figura 5
, Aprovecha
). Análogos resultados se obtuvieron utilizando Skov-3 células, anti-HER2 complejo /neu y libre 4D5scFv.
Leyendas como en la figura 1.
El uso de QD
565- módulo B hace posible la realización de imágenes de células en la región espectral verde. Por lo tanto, los complejos de QD-scFv con especificidades anti-tumorales deseados y los espectros fluorescentes fueron obtenidos por combinación de la visualización y la orientación módulos (Tabla 1).
Además, las células tumorales se obtuvieron imágenes con éxito por un método de un solo paso utilizando pre-ensamblados complejos QD-scFv. En este caso, el módulo de orientación (425scFv-B o (4D5scFv)
2-Bn) y el módulo de visualización (Bn-QD o Bs-QD, respectivamente) fueron pre-mezclado para la formación del complejo seguido de la incubación de las células tumorales con los complejos resultantes. (
figura 6
).
A pesar de que los puntos cuánticos son agente de visualización única en términos de su fotofísico y las propiedades químicas, su despliegue en aplicaciones biomédicas están todavía muy debatido debido a su potencial citotoxicidad. Se realizó algunos experimentos preliminares con el fin de estimar la citotoxicidad de los dotes cuánticos utilizados y sus conjugados y complejos. Los ensayos de citotoxicidad no demostraron ninguna influencia significativa de QD
605 y QD
565 (así como sus derivados) sobre la supervivencia de SKOV-3 (
Figura 7
). Estos resultados se corresponden bien con los datos publicados anteriormente que demuestra que los puntos cuánticos recubiertas con cubierta de polímero en concentraciones necesarias para la visualización de los receptores de superficie en particular no muestran ninguna influencia en la supervivencia de cultivos de células [30].
relativamente viabilidad celular de SKOV -3 células después del tratamiento con los puntos cuánticos iniciales (línea roja), se muestran sus conjugados con barstar (línea azul) y su complejo con la 4D5scFv (línea naranja).
Discusión
La propiedades físicas y químicas excepcionales de los puntos cuánticos permiten multicolor y de imagen a largo plazo, mejorando así sustancialmente los métodos actuales de imágenes fluorescentes de las células cancerosas y perfiles de múltiplex de marcadores tumorales moleculares [2].
Oncomarcadores
El HER1 y HER2 /neu, los miembros de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico, juegan un papel clave en la génesis y progresión de ciertos tipos de tumores, incluyendo los de endometrio, ovario, mama, próstata y de pulmón, y son marcadores clínicamente significativos tumorales [6].
para la entrega selectiva a las células tumorales que sobreexpresan los biomarcadores de interés, los puntos cuánticos necesita ser funcionalizado con moléculas dirigidas. Los anticuerpos monoclonales contra HER1 [31] y HER2 [31], [32], [33], [34], [35], así como EGF, el ligando natural de HER1 [36], [37], [38], se han utilizado con éxito como restos de direccionamiento para el diseño de agentes de contraste antitumorales basado en puntos cuánticos. Sin embargo, los anticuerpos de larga duración son relativamente grandes, por lo que el número de los anticuerpos que se pueden vincular a la superficie de los puntos cuánticos es limitado y la distribución intra-tumoral de las nanopartículas se ve impedido, lo que restringe el uso de anticuerpos de longitud completa como la focalización QD agentes. El scFv parece ser más ventajoso para la generación de HER1- o HER2 /neu sondas QD-dirigida, ya que son más pequeños que los anticuerpos de longitud completa pero retienen la especificidad de antígeno y alta afinidad atracones de anticuerpos parentales. Otras ventajas de anticuerpos scFv como módulos de orientación incluyen la relativa simplicidad de su producción en bacterias, baja inmunogenicidad, y la falta de la función efectora de anticuerpos [17].
Estudios previos han puesto de manifiesto la viabilidad de in vitro e in vivo obtención de imágenes de células tumorales utilizando nanopartículas conjugadas con anticuerpos scFv dirigido HER1 [38] o HER2 /neu [39].
El uso de adaptadores de autoensamblaje (pequeñas moléculas pegajosas '' que se unen entre sí con una alta eficiencia y especificidad, pero no forman homodímeros) es un enfoque más prometedor para la unión de la conjugación directa QD-anticuerpo. La formación de complejos que implican estas moléculas no tiene efecto considerable en la afinidad del anticuerpo y permite una fácil preparación de diversas combinaciones de anticuerpos con diferentes especificidades y puntos cuánticos con diferentes espectros de fluorescencia.
En este estudio, hemos utilizado el sistema basado en una interacción muy específica y fuerte no covalente (es decir, electrostática) entre dos proteínas, barnasa y barstar, como adaptadores moleculares de autoensamblaje. La afinidad de unión de barnasa y barstar es comparable a la de la (estrept) sistema avidina-biotina, el más fuerte conocido entre biomoléculas.
BBS fue elegido debido a varios notables propiedades esenciales para el diseño de módulos de orientación . (I) La biotina no es un péptido, su fijación a las proteínas, por ejemplo, anticuerpos, por métodos de ingeniería genética no es posible. enlace químico es caótica, por lo general no específico en términos de cinemática y con frecuencia requiere sofisticada separación posterior a la modificación de los componentes. Por el contrario, ambos componentes de BBS son genéticamente codificados, lo que permite la creación de módulos como proteínas de fusión codificadas por un gen único objetivo expresado en sistemas bacterianos [15] .Barnase y barstar se carga opuesta y por lo tanto nos permiten elegir el más adecuado BBS proteína para cada anticuerpo utilizado para la construcción de módulos de orientación. Eso ayuda a evitar las complicaciones asociadas con el aislamiento de proteínas, por ejemplo, mutua 'atasca' de los dominios de la proteína recombinante obtenida. Además, barnasa como un constituyente de las proteínas recombinantes puede actuar como una chaperona molecular garantizar su plegado correcto [40]. (Ii) Ninguna de las proteínas BBS tiene análogos en los mamíferos, lo que disminuye el fondo no específica cuando se utiliza este sistema
in vivo
.