Extracto
Objetivo
El papel de la quercetina en el tratamiento del cáncer de ovario sigue siendo controvertido, y el mecanismo es desconocido. El objetivo de este estudio fue investigar los efectos terapéuticos de la quercetina en combinación con cisplatino y otros fármacos antineoplásicos en células de cáncer de ovario tanto
in vitro
y
in vivo
, junto con el molecular mecanismo de acción.
Métodos
la quercetina tratamiento a diversas concentraciones se examinó en combinación con cisplatino, taxol, pirarrubicina y 5-FU en humanos epiteliales de ovario C13 cáncer de células SKOV3 * y. CCK8 ensayo y ensayo de anexina V fueron para la viabilidad celular y la apoptosis análisis, ensayo de inmunofluorescencia, tinción DCFDA y en tiempo real PCR se utilizaron para las especies reactivas de oxígeno (ROS) de detección de la lesión inducida y antioxidante endógeno enzimas expresión. /ratones desnudos c-nu atímicos BALB fueron inyectados con células C13 * para obtener un modelo de xenoinjerto para
in vivo
estudios. El análisis inmunohistoquímico se llevó a cabo para evaluar la actividad de la lesión y la SOD1 ROS inducida por los tumores de xenoinjertos.
Resultados
A diferencia del efecto pro-apoptótica de alta concentración (40 mM-100 mM) de quercetina, bajas concentraciones (5 mM-30 mM) de la quercetina como resultado diversos grados de atenuación de la citotoxicidad del tratamiento cisplatino cuando se combina con cisplatino. Se observaron efectos anti-apoptóticos similares cuando la quercetina se combinó con otros agentes antineoplásicos: Taxol, pirarrubicina y 5-fluorouracilo (5-FU). Se observaron bajas concentraciones de quercetina para suprimir la lesión inducida por ROS, reducir intracelular nivel ROS y aumentar la expresión de enzimas antioxidantes endógenos, lo que sugiere un mecanismo mediado por ROS de atenuar fármacos antineoplásicos. En el modelo xenogénico, quercetina condujo a una reducción sustancial de la eficacia terapéutica de cisplatino junto con el aumento de la expresión de la enzima antioxidante endógeno y la reducción de daño inducido por ROS en el tejido tumoral de xenoinjerto.
Conclusión
En conjunto, estos datos sugieren que la quercetina a bajas concentraciones atenuar los efectos terapéuticos de cisplatino y otros fármacos anti-neoplásicas en células de cáncer de ovario mediante la reducción de daños ROS. la suplementación de quercetina durante el tratamiento del cáncer de ovario puede afectar negativamente a la respuesta terapéutica
Visto:. Li N, Sun C, Zhou B, Xing H, Ma D, Chen G, et al. (2014) baja concentración de quercetina antagoniza los efectos citotóxicos de Medicamentos antineoplásicos en cáncer de ovario. PLoS ONE 9 (7): e100314. doi: 10.1371 /journal.pone.0100314
Editor: Rubí Juan Anto, Centro de Biotecnología Rajiv Gandhi, India
Recibido: December 11, 2013; Aceptado: 26-may de 2014; Publicado: 7 Julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación básica de China (973 Programa, 2009CB521808); Fundación de Ciencias de China National Naturaleza y (; 81272859; 81230038 81025011; 81090414; 81000979; 81101962); La naturaleza y la Fundación de Ciencias de la provincia de Hubei (2011CBD542); Los fondos de investigación fundamental para el Universitario Centroamericano (HUST: 2012TS058). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es el cáncer invasivo más frecuente del tracto genital de la mujer en los Estados Unidos, con un estimado de 22.240 casos diagnosticados cada año. Aproximadamente 14.030 mujeres mueren cada año de cáncer de ovario, lo que representa la causa más común de muerte entre las mujeres con cánceres ginecológicos [1]. fármacos de platino, tales como cisplatino y carboplatino, son agentes quimioterapéuticos de primera línea para el tratamiento del cáncer de ovario. Aunque la mayoría de los pacientes presentan quimiosensibilidad al comenzar la terapia, la resistencia a los medicamentos adquiridos se ha convertido en un obstáculo importante en el tratamiento del cáncer. Los factores que pueden mejorar o suprimir el efecto anticancerígeno de los fármacos anti-neoplásicas parecen ser importantes en el tratamiento de cáncer de ovario.
quercetina (3,3 ', 4', 5,7-pentahidroxiflavona, Quer) pertenece a una clase de compuestos flavonoides, y se encuentra en varias verduras, frutas, semillas, frutos secos, té y vino tinto [2]. Es el principal flavonoide en la dieta humana, con una ingesta dietética diaria estimada de 25 mg en los Estados Unidos [3]. Como antioxidante demostrada, se recomienda quercetina tomar por vía oral para la prevención y atención de la salud del cáncer [4]. En los últimos años, varios estudios han señalado que la quercetina puede actuar como un fármaco potencial anticáncer mediante la mejora de la toxicidad de cisplatino en el tratamiento de hepatoma HA22T /VGH y las células de cáncer de ovario A2780 [5] - [7]. Sin embargo, hay estudios informaron que en contraste con las altas concentraciones de la flavonoide disminución de la supervivencia celular y la viabilidad, bajas concentraciones aumentaron la capacidad antioxidante total de las células cancerosas y prevenir la muerte celular debido a los fármacos citotóxicos tales como cisplatino y 5-FU en A549 del cáncer de pulmón y células HCT116 de cáncer colorrectal [8], [9]. El papel de la quercetina en el tratamiento del cáncer de ovario es objeto de controversia, y se desconoce el mecanismo de acción.
El cisplatino y otros agentes antineoplásicos implique un aumento de especies reactivas del oxígeno (ROS) intracelulares que pueden contribuir a su efecto terapéutico . Antioxidante tal como suplementos de vitamina C puede atenuar la actividad anti-neoplásica de fármacos que aumentan ROS [10]. La quercetina es conocida por reducir los niveles de ROS intracelulares en diversos tipos de células, promoviendo el sistema de captación de ROS intracelular, que incluye la modulación de las enzimas de desintoxicación, tales como la superóxido dismutasa 1 (SOD1) y catalasa (CAT). Que nos llevó a la pregunta de que si la quercetina también podría anular los efectos citotóxicos de fármacos antineoplásicos que el aumento de ROS. El objetivo de este estudio fue investigar los efectos de la quercetina en combinación con cisplatino y otros fármacos antineoplásicos en células de cáncer de ovario tanto
in vitro
y
in vivo
, junto con el mecanismo molecular de la acción.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de la Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentos con Animales de Tongji Medical College, Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología (Número de Permiso: S292). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales
Productos químicos y reactivos
La quercetina (& gt; 99% de pureza)., cis-Diammineplatinum (II) dicloruro (cisplatino), el Taxol (paclitaxel) fue adquirido de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), disuelto en DMSO, se dividió en alícuotas y se almacenaron a -20 ° C. Pirarrubicina (Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd., China) y 5-fluorouracilo (5-FU) (Shanghai Xudong Haipu Pharmaceutical Co Ltd, China) se disolvieron en solución salina normal.
Cultivo de células
la línea de ovario epitelial humano de células de cáncer C13 * [11] es el clon resistentes al cisplatino de la línea celular OV2008 que se deriva de un carcinoma de ovario humano. Esta línea celular C13 * fue un regalo del profesor Rakesh en el Centro de Cáncer Regional de Ottawa, Ottawa, Canadá [3]. línea celular de cáncer de ovario SKOV3 se obtuvo de American Type Culture Collection (ATCC). células de cáncer de ovario se cultivaron en medio RPMI 1640 con 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C con 5% de CO
2.
La viabilidad celular
La viabilidad celular se midió con CCK8 ensayo (kit de recuento de células-8, Dojindo Molecular Technologies, Tokio, Japón). Las células se prepararon en placas de cultivo celular de 96 pocillos a una densidad celular de 5 x 10
3 células /pocillo y tratados con quercetina /fármacos antineoplásicos (cisplatino, taxol, pirarrubicina y 5-FU) o vehículo (DMSO con la misma tasa de dilución como las drogas) a 37 ° C durante 48 h. La monocapa celular se lavó tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene CaCl 1,2 mM
2 y MgCl 0,7 mM, se añadió
2 a continuación, una solución 1:10 CCK8 diluida en RPMI 1640 a las células y se incubó durante 2 horas a 37 ° C. Los resultados se midieron mediante un lector de microplacas a 450 nm y se expresaron como porcentajes de los valores de control (obtenidos para las células tratadas con vehículo).
Anexina V /PI tinción
Las células se trataron con tripsina y se lavaron con medio que contenía suero. Las muestras (5 × 10
5 células) se centrifugaron durante 5 min a 400 x g y se desechó el sobrenadante. Las células fueron teñidas utilizando un kit de Anexina V-FICT /PI apoptosis (keygen Biotech, Nanjing) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se detectó el número de células apoptóticas y analizados mediante citometría de flujo.
Medición de ROS
ROS se detectó usando el oxígeno reactivo Especies Kit de ensayo (Beyotime, China) según las instrucciones del fabricante. Después de la sonda molecular 5- (y-6) -chloromethyl-2 ', 7'-diacetato dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA) se difunde en las células y es secuestrado intracelularmente por de-esterificación, la reacción posterior con peróxidos genera fluorescente 5-clorometilisotiazolona 2 ', 7'-diclorofluoresceno (DCF). En pocas palabras, después del tratamiento, las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en PBS que contiene 10 mmol /L DCFH-DA, se incubaron durante 20 min a 37 ° C, se lava con PBS para eliminar el exceso de colorante, y luego se incubaron con medio RPMI a 37 ° C durante 10 min, los resultados de fluorescencia se obtuvieron utilizando el canal de FL-1 de un Becton Dickinson FACSCalibur, y se analizaron utilizando CellQuest Software. El porcentaje de células que presentan aumento de la captación de tinte se utiliza para reflejar un aumento en los niveles de ROS.
inmunofluorescencia ensayo
Brevemente, C13 * células se sembraron en placas de cultivo celular de 24 pocillos que contienen un vidrio estéril diapositiva a una densidad celular de 2 × 10
4 células /pocillo. Después de tratada con diferentes fármacos durante 48 h, las células se lavaron tres veces con PBS enfriado en hielo, y se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 20 min a temperatura ambiente. Después de bloquear con leche no grasa al 1% durante 2 h, se añadieron anticuerpos de cabra anti-γH2AX anti-8-OHdG y de ratón (Millipore) a los portaobjetos respectivamente. Después de 4 h de incubación, los portaobjetos se lavaron 3 veces con 0,5% PBS-Tween 20 (PBST) y se añadieron los fluoresceína conjugado con Cy3 anticuerpo de ratón secundario anti-cabra y conjugado con FITC de cabra anti-ratón anticuerpo secundario (Sigma-Aldrich) a una dilución de 1:100. Las células se incubaron durante 45 min a 37 ° C. Finalmente, las células se lavaron como se describió anteriormente y se examinaron con microscopía de fluorescencia (Olympus, Tokio, Japón). Cinco imágenes de campo de alta potencia al azar se tomaron de cada grupo, el software Image J se utilizó para calcular el número de células teñidas altamente positivos.
En tiempo real de transcripción inversa reacción de polimerasa en cadena (RT-PCR)
C13 * Las células se sembraron en placas de cultivo celular de 6 pocillos a una densidad de 5 × 10
5 células /pocillo, y se trató con quercetina y cisplatino para 48 h. El ARN total se extrajo utilizando Trizol (Invitrogen, China). El ADN complementario se sintetizó de acuerdo con el protocolo de los fabricantes (Toyobo, Japón). la amplificación por PCR en tiempo real se realizó en un termociclador ABI PRISM 7500 con el reactivo SYBR (Toyobo, Japón). Los ciclos térmicos condiciones fueron establecidos como se indica en las instrucciones que se incluyen con el dispositivo de ciclos, con una temperatura de 60 ° C. Los oligonucleótidos utilizados para la amplificación de la superóxido dismutasa 1 (SOD1), endonucleasa G (ENDOG), el citocromo c (cito-c), glutatión peroxidasa (GPx), catalasa (CAT) y proteína desacoplante 2 (UCP2) (Tabla S1) fueron diseñados utilizando Primer 5.0 y sintetizados por Invitrogen. normalización cuantitativa de ADNc se realizó utilizando la deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato limpieza de genes (GAPDH) como control interno para determinar la uniformidad de la plantilla de ARN para todas las muestras. Para cada muestra, la expresión del gen de interés se deriva de la relación de su expresión a la expresión de GAPDH utilizando la siguiente fórmula:. Expresión relativa = 2- (muestra de control-Ct Ct), Ct = Ct gen-Ct GAPDH
en vivo
estudios de xenoinjertos
El
in vivo
evaluación de quercetina se llevó a cabo utilizando un modelo de xenoinjerto de células C13 * humanos. Atímicos Balb /c ratones desnudos-nu (4-6 semanas de edad, obtenidos a partir de Beijing HFK compañía de ciencias biológicas, Pekín, China) fueron alojados en una habitación libre de patógenos específicos dentro de las instalaciones de los animales en el Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad de Tongji Medical College . Animales se les permitió aclimatarse a su nuevo entorno durante una semana antes de su uso. células C13 * (2 × 10
6) se resuspendieron en medio PBS con Matrigel matriz de membrana basal (BD Biosciences, Bedford, MA) en una relación 1:01 (volumen total 100 l), a continuación, se inyectaron por vía subcutánea en los flancos los ratones de desnudos (día 0). Desde el décimo día de la inyección, los ratones se asignaron aleatoriamente a 4 grupos de tratamiento (n = 8 para cada grupo) y se inyectaron por vía intraperitoneal (ip) con solución salina normal (NS), quercetina (20 mg /kg de peso corporal, diariamente), cisplatino ( 4 mg /kg de peso corporal, cada cuatro días), y tratamiento combinado quercetina y cisplatino (usando las dosis anteriores) durante 21 días consecutivos. El peso corporal y la masa del tumor se midieron cada 5 días. El volumen del tumor se determinó usando un calibre y se calculó según la fórmula (anchura
2 x longitud) /2. Los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical bajo anestesia después de tres semanas de tratamiento (día 30).
El análisis inmunohistoquímico
Se realizaron estudios inmunohistoquímicos en los xenoinjertos de tumores después de que fueron retirados de ratones desnudos. Los tumores fueron fijadas en 40 mg /ml de paraformaldehído, incluido en parafina y cortadas en 4 micras de serie de secciones. A continuación, las peroxidasas endógenas se inactivaron y las secciones se lavaron cuidadosamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) tres veces. Las secciones fueron bloqueadas con 2% de suero de cabra y suero de conejo, respectivamente, en PBS a 37 ° C de temperatura durante 45 min, después se incubaron con anticuerpo de ratón anti-SOD1 (dilución 1:500, Abcam) y anticuerpo de cabra anti-8-OHdG (1 :800 dilución, Millipore) durante la noche a 4 ° C. Posteriormente, las secciones se incubaron con anticuerpo de cabra anti-ratón y el ratón anti-cabra de rábano picante anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa separado y complejo avidina-biotina seguido de diaminobenzidina (Vector ABC, Burlingame, CA, EE.UU.). Sumergido en el agua de amoniaco al 2%, se utilizó para la tinción de contraste con hematoxilina. Las secciones se incubaron con los controles, respectivamente, como negativos de conejo y suero IgG de cabra.
Positivo 8-OHdG tinción fue principalmente en los núcleos mientras que la expresión positiva de SOD1 era principalmente un patrón citoplasma, tanto en células tumorales y no en las células del estroma . Debido a la intensidad de 8-OHdG y SOD1 tinción dentro de cada sección era en su mayoría homogénea, la inmunoreactividad en las muestras fue evaluada utilizando los siguientes criterios semi-cuantitativa: fuertemente positivo (marcado como 3), la fuerte intensidad de la tinción (& gt; 90% de Células cancerígenas); positiva moderada (puntuación como 2), intensidad de la tinción moderada (& gt; 50 a 89% de células positivas); positiva débil (marcado como 1), intensidad de tinción débil (& gt; 10 a 49% de células positivas); ausente (marcado como 0), no hay intensidad de la tinción y no positivo o sólo unas pocas células positivas [12], [13]. La intensidad de la tinción y el porcentaje de cada sección teñida se calcularon utilizando cinco imágenes de alta potencia de campo al azar de cada grupo por dos investigadores independientes.
Análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando SPSS19.0. Las diferencias entre los dos grupos se compararon mediante
t
test de Student. Las diferencias estadísticas entre más de dos grupos se determinaron mediante análisis ANOVA de una vía seguido de comparaciones por pares post hoc.
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
La quercetina a bajas concentraciones promueve la supervivencia de las células de cáncer de ovario * C13 tratados con cisplatino
quimioterapia basada en platino es la terapia más importante en el tratamiento del cáncer de ovario. Para determinar el papel potencial de la quercetina puede jugar en la resistencia a cisplatino en el cáncer de ovario, células C13 * fueron expuestas a diferentes concentraciones de quercetina, cisplatino, o una combinación de los dos. La IC50 de células * C13 tratados con cisplatino fue de aproximadamente 80 mM (IC50 = 78,8 M, IC del 95%: 72,9 a 85,1 M) (Figura S1 A). Cuando las células C13 * fueron tratados con 80 M de cisplatino en combinación con dosis crecientes de quercetina, se encontró que la citotoxicidad del cisplatino se redujo cuando se combina con bajas concentraciones de quercetina (5 M a 30 M), mientras que la alta concentración relativa de quercetina (100 M) aumentó la citotoxicidad cisplatino (Fig. 1A). Para determinar el efecto antagonista o sensibilización de la combinación de fármacos, se calculó el índice de combinación (IC) para los medicamentos a base de Chou y Talalay teorema de [14]. Los resultados mostraron que las bajas concentraciones de quercetina antagoniza los efectos citotóxicos del cisplatino en las células C13 *, mientras que altas concentraciones de quercetina tienen un efecto aditivo con cisplatino (Tabla S2). También llevamos a cabo experimentos de combinación con una serie de diferentes concentraciones de cisplatino más concentraciones de quercetina (20 M), que mostraron que las bajas concentraciones de quercetina mayor resistencia celular C13 * a cisplatino en diversos grados (Figura S2) fijo. imágenes de contraste de fase de células C13 * tratados con control de vehículo, cisplatino, o combinaciones de quercetina (20 mM, 80 mM) con cisplatino (80 mM) se muestran en la Fig. 1B.
(A), la viabilidad celular de los grupos expuestos a diferentes concentraciones de quercetina solo, o en combinación con cisplatino 80 M durante 48 horas se midió con el ensayo CCK8 y se expresó como porcentaje de los valores de control. *
P = 0,039
,#
P = 0,009
, & amp;
P = 0,027
,%
P
= 0,010, prueba de ANOVA seguido de correo hoc comparaciones por pares. (B), las imágenes de contraste de fase de células C13 * tratados con control de vehículo (DMSO con la misma tasa de dilución como las drogas), cisplatino, o combinación de quercetina (20 M, 80 M) con cisplatino (80 mM). (C, D), se detectó la apoptosis de células de diferentes grupos de tratamiento y se analizaron mediante citometría de flujo. Los experimentos se realizaron por triplicado (N = 3 por experimento). Grupo de cisplatino en combinación con VS. tratamiento quercetina grupo de cisplatino tratamiento, **
P = 0,033
, ***
P = 0,043
, prueba de ANOVA seguido de comparaciones pareadas post hoc.
Para más cuantificar los efectos apoptóticos de la quercetina y cisplatino tratamiento, las células C13 * fueron teñidas con anexina V-FITC y PI, y posteriormente se analizaron mediante citometría de flujo para la apoptosis celular. se detectaron disminuciones evidentes en el número de células apoptóticas para las células tratadas con cisplatino y 20 mM de quercetina con cisplatino solo (Fig. 1C, 1D). Las proporciones de células teñidas con anexina-V fueron más altos en las células tratadas con cisplatino que los de las células tratadas con un adicional de 20 M quercetina.
Con el fin de generalizar nuestras conclusiones, hemos llevado a cabo ensayos en CCK8 SKOV3, una de uso general línea celular de cáncer de ovario. Los resultados revelaron que las bajas concentraciones de quercetina redujo los efectos citotóxicos del cisplatino en las células SKOV3 (Figura S3).
La quercetina atenúa los efectos de la terapia de diferentes fármacos antineoplásicos en células de cáncer de ovario
Para examinar si la quercetina atenuar los efectos anticancerígenos de otros fármacos antineoplásicos, nos trataron células C13 * con otros tres fármacos antineoplásicos utilizados comúnmente en el tratamiento del cáncer de ovario, 5-Fu, Taxol, y pirarrubicina. células C13 * fueron tratados con una serie de dosis crecientes de quercetina y se fijaron 5-FU (5 M), Taxol (3 M) y pirarubicina (3 nM) a concentraciones aproximadas de la IC50 respectivamente (Figura S1). Similar a los resultados obtenidos con cisplatino, el tratamiento con estos fármacos en combinación con quercetina resultó en más resistencia de las células que el tratamiento con fármacos antineoplásicos por sí solos (Fig. 2.) a la concentración de 20 mM, quercetina mostró evidentes efectos anti-apoptóticos contra estos tres fármacos. La quercetina mostró una baja concentración-efecto específico a las células de cáncer de ovario tratados con 5-FU (Fig. 2A) la protección, similar a los resultados obtenidos con cisplatino. En combinación con Taxol o pirarubicina, sin embargo, la quercetina mantiene el efecto de promover células survial contra medicamentos contra el cáncer, incluso a concentraciones relativamente altas (80 mM, 100 mM) (Fig. 2B, 2C).
(A~C ), la viabilidad celular de la quercetina en combinación con 5-Fu, Taxol y pirarubicina se midió con el ensayo CCK8 y se expresó como porcentaje de los valores de control. N = 3 por experimento. Grupo de cisplatino en combinación con quercetina VS. tratamiento 20 M El cisplatino grupo de tratamiento, *
P = 0,048
, **
P = 0,040
, ***
P = 0,032
, prueba t de Student.
quercetina redujo el daño oxidativo de las células de cáncer de ovario causada por el cisplatino
Hemos investigado el mecanismo por el cual quercetina atenúa los efectos citotóxicos del cisplatino. Como se informó anteriormente [15], muchos fármacos antineoplásicos que incluyen cisplatino, implique un aumento de ROS intracelular que contribuyen a su efecto terapéutico. Se analizó si la quercetina puede alterar la lesión asociada a ROS causado por estos fármacos. La expresión de 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG), un marcador de estrés oxidativo del ADN y la lesión de ADN más frecuentemente detectado y estudiado [16], se estimó por el ensayo de immunefluorescence. También se midió el nivel de la lesión total del citotóxico mediante la detección de γH2AX, un marcador común de daño en el ADN. Los resultados mostraron que las intensidades de fluorescencia de ambos γH2AX y 8-OHdG fueron mucho más bajos en el grupo de tratamiento de 80 M de cisplatino en combinación con baja concentración Quercetina (20 mM) que en el grupo de 80 M cisplatino solo. Contrariamente a esto, 80 mM cisplatino con alta concentración (60 mM, 100 mM) de quercetina aumentó la intensidad de fluorescencia (Fig. 3A, 3B). Recuento de células positivas utilizando el software Image J mostró que el tratamiento de combinación con quercetina (20 M) tuvo una disminución más evidente de 8-OHdG que la de γH2AX, en comparación con el tratamiento cisplatino solo (36,40% y 19,33%, respectivamente) (Fig. 3B) . Se indicó que las concentraciones bajas de quercetina redujo el daño oxidativo de las células de cáncer de ovario causada por el cisplatino.
(A), 8-OHdG y expresión H2AX en células C13 tratadas con quercetina * en combinación con cisplatino se detectó por inmunofluorescencia ensayo. (B), el número de células teñidas altamente positivos en cinco campos de alta potencia al azar fueron contados por la imagen J y se expresan como porcentaje de los valores del grupo cisplatino. Grupo de cisplatino en combinación con quercetina VS. tratamiento 20 M El cisplatino grupo de tratamiento, N = 3. *
P = 0,004
,#
P = 0,001
, prueba t de Student.
La quercetina redujo el nivel de ROS células de cáncer de ovario en tratamiento cisplatino
para determinar si quercetina redujo la lesión ROS por la disminución intracelular de ROS, especies reactivas de oxígeno Kit de ensayo se utilizó para detectar los niveles de ROS intracelulares de células C13 * en diferentes grupos de tratamiento. En comparación con las células tratadas con el control del vehículo o cisplatino solo, tratamiento con un 20 M quercetina ventaja adicional a una reducción en los niveles intracelulares de ROS (Fig. 4A, 4C). El análisis cuantitativo mostró que la quercetina tratamiento (20 mM) dio una reducción evidente en el nivel de ROS (valor medio 70,4) en comparación con el grupo control (valor medio 99,05) (
P Hotel & lt; 0,001). (Figura 4B, 4D ). De acuerdo con los resultados anteriores, la exposición a cisplatino causada células C13 cáncer de ovario * para acumular el intracelular de ROS, con un nivel medio de ROS 123,5. En el grupo de tratamiento de cisplatino en combinación con quercetina, este valor se redujo a 83,38 (Fig 4D.), Incluso más bajo que el grupo de control del vehículo (99.05) (
P
& lt; 0,001). (Fig. 4B)
niveles de ROS intracelulares de células C13 * de diferentes grupos de tratamiento fueron detectados por el oxígeno reactivo Especies de ensayo citometría de flujo. (A, B) Los niveles de ROS de células C13 * tratados por el control del vehículo o 20 mM quercetina durante 24 horas. Los niveles de ROS de células C13 * tratados por 80 M cisplatino con o sin 20 mM quercetina durante 24 horas (C, D). N = 3. *
P Hotel & lt; 0,001,#
P
. & Lt; 0,001, prueba t de Student
La quercetina aumentó la expresión de enzimas antioxidantes endógenas en el cáncer de ovario células
Los anteriores resultados indican que la quercetina podría reducir ROS intracelular de las células de cáncer de ovario, por lo que hemos tratado de determinar un mecanismo de acción. Los componentes antioxidantes más importantes de las células contra ROS son las enzimas antioxidantes endógenos, incluyendo la superóxido dismutasa 1 (SOD1), endonucleasa G (ENDOG), el citocromo c (cito-c), glutatión peroxidasa (GPx), catalasa (CAT), y desacoplamiento la proteína 2 (UCP2). Se midió la expresión de enzimas antioxidantes endógenos por PCR en tiempo real. En comparación con las células tratadas con el control del vehículo o cisplatino solo, la combinación de tratamiento con cisplatino 20 M quercetina dar lugar a diversos grados de aumento de la expresión de SOD1, ENDOG, cito-c, GPx, CAT y UCP2 (Fig. 5A~F).
(A~F), la expresión de las enzimas antioxidantes de las células C13 * fue detectado por PCR en tiempo real. N = 3.
La quercetina promueve el crecimiento del cáncer de ovario con el tratamiento con cisplatino
in vivo
Se utilizaron células C13 * para generar los xenoinjertos de tumores en ratones atímicos desnudos BALB /c -nu ratones para determinar si la quercetina podría atenuar los efectos de la quimioterapia
in vivo
. Como era de esperar, el tratamiento con cisplatino solo redujo el crecimiento del tumor en comparación con los ratones tratados con vehículo. El tratamiento con solo el crecimiento del tumor ligeramente suprimida quercetina en comparación con el control de solución salina normal (volúmenes tumorales de 111,75 mm
3 y 120.51 mm
3, respectivamente) (P = 0,015). Los tumores de los ratones tratados con cisplatino en combinación con quercetina eran aproximadamente 1,8 veces mayor en el día 30 que los tratados con cisplatino solo (
P
& lt; 0,001; Fig. 6A, 6B). La comparación de los pesos medios de los tumores extraídos de los ratones, se encontró que los tumores tratados con la combinación de la quercetina y cisplatino (72,53 ± 7,33 mg) fueron significativamente más pesado que el tratado con cisplatino solo (41,47 ± 6,72 mg),
P
& lt; 0,001 (Fig. 4D). Además, la combinación de tratamiento cisplatino y quercetina muestra un efecto promotor del cáncer en comparación con el grupo de control, medida tanto en el tamaño del tumor y en el peso del tumor (Fig. 6C).
Los ratones fueron inyectados con NS, 20 /kg La quercetina, 4 mg /kg de cisplatino, o quercetina más cisplatino, ip. xenoinjertos de células C13 * (2 × 10
6) se inocularon en el flanco derecho de ratones nu /nu atímicos desnudos femeninos. Los volúmenes tumorales se determinó mediante un calibre y se calculan según la fórmula (anchura2 x longitud) /2. (A), la formación de tumores en ratones de grupo de tratamiento cisplatino y combinado con el grupo de la quercetina. (B), el crecimiento tumoral relativo medio como analizada por el aumento en los volúmenes tumorales para 8 ratones por grupo experimental ** cisplatino más quercetina VS. Cisplatino,
P Hotel & lt; 0,001; * La quercetina VS. Control,
P = 0,015
, prueba de ANOVA seguido de comparaciones pareadas post hoc; (C), los pesos medios de los tumores de cada grupo. #Cisplatin Combinado con quercetina VS. Cisplatino,
P Hotel & lt; 0,001, prueba de ANOVA seguido de comparaciones pareadas post hoc; (D), el análisis inmunohistoquímico de 8-OHdG y SOD1 en los tumores de xenoinjertos retirados de ratones desnudos. (E), los datos de cuantificación de las diferencias en la expresión de SOD-1 y 8-OHdG, *: P & lt; 0,001, **:. P & lt; 0,001, prueba de ANOVA seguido por comparaciones por pares post hoc
la quercetina aumentó la expresión de SOD1 enzima antioxidante endógeno de las células de cáncer de ovario
in vivo
, evitando daños ROS inducida
con el fin de confirmar el efecto protector contra el daño oxidativo por quercetina in vivo , ensayos inmunohistoquímicos se llevaron a cabo en los tumores extraídos de modelo de xenoinjerto de ratones desnudos. 8-OHdG, un marcador de estrés oxidativo del ADN, se localiza principalmente en el núcleo de células de cáncer. En los tumores tratados con vehical o quercetina solas, 8-OHdG tinción mostró intensidad débil con las puntuaciones de 0,4 y 0,6 respectivamente. En el grupo tratado con cisplatino solo, casi todas las células cancerosas muestran extremadamente fuerte tinción 8-OHdG con la puntuación de 2,8. Como era de esperar, los ratones del grupo tratado por el cisplatino en combinación con quercetina tuvo un nivel mucho más bajo de 8-OHdG tinción (puntuación de 1,6) en los tumores que el uno tratado con cisplatino solo (Fig. 6D-E).
DNA enzimas de reparación evitar la acumulación de ADN dañado y antioxidantes protegen a las células contra los radicales libres. Detectamos expresión SOD1, que es una enzima antioxidante endógeno crítico para tolerar el estrés oxidativo, para averiguar si quercetina afectada en la actividad de la enzima antioxidante endógeno. Expresión positiva de SOD1 era principalmente un patrón citoplasma de las células de cáncer de ovario en lugar de las células del estroma. La SOD1 enzima antioxidante fue altamente sobreexpresado en los tumores tratados con quercetina o cisplatino más quercetina (puntuación de 2,0 y 2,6, respectivamente) en comparación con los tumores tratados con vehículo o cisplatino solo (puntuación de 1,2 y 0,6, respectivamente) (Fig. 6D-E). Los resultados indicaron que la quercetina aumentó la expresión de SOD1 enzima antioxidante endógena de las células de cáncer de ovario
in vivo
, evitando daños ROS inducida.
Discusión
Como un compuesto flavonoide clásica , quercetina generalmente se recomienda tomar por vía oral todos los días para el cuidado de la salud general y la prevención del cáncer. Staedler
et al.
Descubrió que la quercetina en concentraciones de 5 mM y 10 mM podrían aumentar la eficacia de 100 M doxorubicina en células de cáncer de mama in vitro [17], [18], mientras que otros investigadores llegaron a conclusiones diferentes [8], [9]. Samuel
et al.
[8] informó de que en las células de cáncer colorrectal y de próstata, los efectos terapéuticos de fármaco en combinación con quercetina fueron influenciados por las dosis efectivas y el estado de p53 de las células (la combinación de 5- fu con un máximo de 6 micras quercetina promueve la supervivencia cologenic en células nulas en p53, mientras que 50 M quercetina actuó papel contrario en las células p53 de tipo salvaje). En este estudio, la quercetina a altas concentraciones, ya sea solos o combinados con cisplatino muestra efectos anti-neoplásicas en células * C13 cáncer de ovario, mientras que una concentración baja (5 mM-30 mM) de quercetina apareció para antagonizar los efectos citotóxicos de agentes antineoplásicos incluyendo cisplatino, 5-FU, taxol, y pirarrubicina. También exploramos el mecanismo del efecto anti-apoptótica de quercetina cuando se combina con cisplatino.