Extracto
Antecedentes
RNasas son actualmente estudiadas como alternativas no mutagénicos a los medicamentos contra el cáncer que dañan el ADN perjudiciales utilizados habitualmente en la práctica clínica. Muchos RNasas de mamíferos no son potentes toxinas debido a la fuerte inhibición por el inhibidor de ribonucleasas (RI) se presenta en el citoplasma de las células de mamíferos.
Metodología /Principales conclusiones
En busca de nuevos RNasas anticancerígenos eficaces que estudiaron los efectos de la barnasa, una ribonucleasa de
Bacillus amyloliquefaciens
, en células de cáncer humano. Se encontró que la barnasa es resistente a la RI. En ensayo de viabilidad celular MTT, barnasa fue citotóxica para las líneas celulares de carcinoma humano con concentraciones de la mitad inhibidora (IC
50) que varía de 0,2 a 13 mM y a las líneas celulares de leucemia con IC
50 valores que van desde 2,4 a 82 mM . Además, se caracterizaron los efectos citotóxicos de la base-barnasa immunoRNase scFv 4D5-dibarnase, que consiste en dos moléculas de barnasa en serie fusionados al fragmento de una sola cadena variable (scFv) del anticuerpo humanizado 4D5, que reconoce el dominio extracelular de HER2 marcador de cáncer. El scFv 4D5-dibarnase une específicamente a las células HER2 positivos y se internaliza a través de endocitosis mediada por receptor. La localización intracelular de internalizado scFv 4D5-dibarnase se determinó por microscopía electrónica. El efecto citotóxico de scFv 4D5-dibarnase sobre el carcinoma de ovario humano HER2 positivo células SKOV-3 (IC
50 = 1,8 nM) era tres órdenes de magnitud mayor que la de la barnasa solo. Tanto barnasa y apoptosis inducida scFv 4D5-dibarnase en 3-SKOV células acompañados por la fragmentación de la cromatina internucleosomal, formación de ampollas en la membrana, la aparición de fosfatidilserina en la cara externa de la membrana plasmática, y la activación de la caspasa-3.
conclusiones /Importancia
Estos resultados demuestran que la barnasa es un potente agente tóxico para la orientación de las células cancerosas
Visto:. Edelweiss E, Balandin TG, Ivanova JL, Lutsenko GV, Leonova OG, Popenko VI , et al. (2008) Barnasa como un nuevo agente terapéutico Activación de la apoptosis en células de cáncer humano. PLoS ONE 3 (6): e2434. doi: 10.1371 /journal.pone.0002434
Editor: Gedeón Schreiber, Instituto de Ciencia Weizmann, Israel
Recibido: 22 Agosto, 2007; Aceptado 13 de mayo de 2008; Publicado: 18 Junio 2008
Derechos de Autor © 2008 Edelweiss et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación rusa para la investigación básica (Nos. 07-02-00649, 07-04-00584, 06-04-49686-a), FNS (núm IB73AO-110842/1), y el Programa " Biología molecular y celular "RAS
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
barnasa, una ribonucleasa de
Bacillus amyloliquefaciens
, se sintetiza como una proenzima activa, procesado por la eliminación del péptido señal amino-terminal, y secretada al espacio extracelular. En esta especie de bacterias, barstar, un inhibidor intracelular específico de barnasa, se produce. Barstar se une fuertemente a barnasa y por lo tanto inhibe su actividad enzimática intracelular y protege las células huésped del efecto perjudicial de este RNasa. Barnasa es una pequeña (110 bis) de proteína de una sola cadena. No tiene enlaces disulfuro y no requiere de modificaciones post-traduccionales, cationes divalentes, o de otros componentes no peptídicos para su función [1], [2]. Debido a estas características favorables, la barnasa es activa en cualquier tipo de célula en la que se expresa. La capacidad de barnasa para escindir ARN se ha explotado en una amplia variedad de bio-aplicaciones desde la introducción de esta enzima en células causa la muerte celular. La ablación específica de células particulares es factible por la dirección de la expresión del gen barnasa mediante el uso de promotores específicos de células [3] - [5]. Alternativamente, las proteínas que se dirigen a la barnasa a células específicas dotan especificidad de barnasa acción [6] - [8].
El efecto tóxico de la expresión de gen de la barnasa se utilizó para diseñar vectores para la selección positiva de insertos clonados [9], [10], para generar esterilidad masculina y femenina en las plantas [11], [12], para conferir resistencia a los nematodos a los cultivos [13], para producir agentes potentes para matar la tercera estadio las larvas del gusano de la cápsula del algodón [14], para estudiar las enfermedades causadas por la pérdida de un tipo específico de célula en mamíferos, y para eliminar las células cancerosas [5]. Estos ejemplos ilustran claramente la eliminación efectiva y específica de las células en diferentes especies por el uso de la expresión del gen barnasa; Sin embargo, poco se ha centrado en los efectos de la adición exógena de barnasa en células de mamíferos malignos y normales. De hecho, el examen de la nefrotoxicidad de la barnasa es el único ejemplo publicado [15]. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue caracterizar los efectos de la barnasa ribonucleasa en el cáncer humano y las células normales.
RNasas son actualmente objeto de intensa investigación por su potencial contra el cáncer [16], [17]. El más prometedor de ellos son RNasas de tipo pancreático humano bien toleradas por el sistema inmunológico humano. Pero el potencial citotóxico de muchos de ellos se reduce por su sensibilidad a la inhibición por el inhibidor de ribonucleasas citoplásmica (RI) se encuentra en cada célula de mamífero estudiado [18]. Varios enfoques han sido exploradas para reducir la sensibilidad de las RNasas de tipo pancreático a RI [19] - [22]. El uso de RNasas intrínsecamente resistentes a RI proporciona otra manera de superar este obstáculo. Hemos examinado la susceptibilidad de barnasa a RI y se encontró que la barnasa es afortunadamente insensible a la inhibición por RI.
Las células cancerosas son una población celular específica, que se caracteriza por la presencia de promotores específicos de tumores y marcadores de cáncer. Uno de estos marcadores es el antígeno HER2 (también llamado HER-2, erbB2, p185HER-2), que se sobreexpresa en una amplia variedad de tumores humanos [23], en particular en ovario y de mama carcinomas [24], [25]. Hemos fusionado dos moléculas barnasa a anticuerpo de cadena sencilla (scFv) del anticuerpo humanizado 4D5, que reconoce el dominio extracelular de HER2, para producir scFv 4D5-dibarnase [8]. Hicimos una immunoRNase (IR) que incluye dos ribonucleasas por portadora, ya que la citotoxicidad específica está limitada por la densidad de la superficie celular del antígeno HER2. Esta configuración habilita la introducción de dos veces la actividad de ribonucleasa en células con sólo un receptor HER2. Como se muestra anteriormente [26], un aumento de dos veces en el número de moléculas de ARNasa en el inmunoconjugado potenció por quince veces. El propósito de este estudio fue examinar si scFv 4D5-dibarnase es capaz de interactuar específicamente con células de ovario humano HER2-positivo, internalizarse en las células, y ejercer citotoxicidad.
En consecuencia, en este trabajo se estimó ventajas de barnasa para el desarrollo de medicamentos contra el cáncer y demostró la potencia de immunoRNase basada en barnasa para la ablación de las células cancerosas.
Resultados
Caracterización de barnasa y scFv-4D5 dibarnase
las proteínas recombinantes se producido en
E. coli
y se purificó como se describe en Materiales y Métodos. Las proteínas obtenidas eran del tamaño esperado y homogénea de acuerdo con SDS-PAGE (datos no mostrados). La actividad enzimática de la barnasa preparado fue 1,8 × 10
6 unidades /mg, que fue consistente con los valores publicados previamente [27]. La actividad de ribonucleasa de cada enzima barnasa en la proteína de fusión 4D5-dibarnase scFv era 75% de la barnasa nativa (Figura 1A). La actividad de ribonucleasa de scFv 4D5-dibarnase fue inhibida por barstar (Figura 1B, línea discontinua). Por lo tanto, fracción barnasa de scFv-4D5 dibarnase retuvo su funcionalidad.
(A) Las actividades de ribonucleasa barnasa (línea discontinua y diamantes) y scFv-4D5 dibarnase (línea de puntos y círculos) se determinaron de acuerdo con el método de Rushizky et al. [58]. El eje x representa la concentración de barnasa solo o la mitad de la concentración de scFv 4D5-dibarnase. La absorbancia de 0,5 AU
260 corresponde a la actividad de 2 nM barnasa nativa como se describe anteriormente [27]. (B) Susceptibilidad de barnasa de HRI (línea sólida y círculos) y del scFv 4D5-dibarnase a barstar (línea de trazos y triángulos). Los datos son medias ± SD de determinaciones por triplicado; las curvas son los resultados de regresión sigmoidal realizaron con el software SigmaPlot.
Después de la penetración en las células, la exógenamente añadió RNasa puede dejar de ser activo debido a la susceptibilidad a la inhibidor de la ribonucleasa citoplasmática [18]. Por lo tanto, antes de probar la citotoxicidad de scFv-4D5 dibarnase, se analizó la sensibilidad de la barnasa de inhibidor de ribonucleasa humana (HRI). A una concentración de cuatro veces mayor que la requerida para inhibir la RNasa A por 50% (determinada de acuerdo con las instrucciones del fabricante), HRI no inhibió la barnasa (Figura 1B, línea continua).
La unión de la barnasa y scFv 4D5-dibarnase a las células
La unión de la barnasa y scFv 4D5-dibarnase a carcinoma de ovario humano con sobreexpresión de HER2 SKOV-3 células [28] y murina CTLL-2 células T citotóxicas que carecen de HER2 humano se determinó mediante fluorescente microscopía. se observó la fluorescencia de la membrana de las células Skov-3, pero no las células CTLL-2, se tiñeron con 4D5 20 nM scFv-dibarnase (Figura 2, B y D). En los controles, cuando se omitieron scFv 4D5-dibarnase o conejo antisuero anti-barnasa, no se detectó fluorescencia en células SKOV-3 y células CTLL-2 (datos no mostrados). La adición de scFv 4D5 a 4D5 scFv-dibarnase llevó a notable extinción de la fluorescencia de la membrana celular (Figura 2, comparar B y C), lo que indica que scFv 4D5-dibarnase unido al receptor HER2. No se detectó fluorescencia, ya sea en células SKOV-3 o 2-CTLL células en presencia de 20 nM de barnasa (datos no mostrados). A una concentración de 20 barnasa mu M, se observó una tinción citoplásmica brillante de células SKOV-3 (Figura 2E), lo que sugiere la penetración de barnasa en las células. controles apropiados sin ya sea barnasa o antisuero de conejo anti-barnasa fueron negativos (datos no presentados).
La capacidad de unión a células de las proteínas recombinantes demostradas por microscopía de fluorescencia. Las células se incubaron a 4 ° C durante 1 h, ya sea con 20 nM scFv 4D5-dibarnase (A, B y D), o una mezcla de 20 nM scFv 4D5-dibarnase y 20 nM scFv 4D5 (C), o 20 mM de barnasa ( MI). Las proteínas no unidas se eliminaron, y después de estar (A-D) o células fijadas (E) se tiñeron con antisuero de conejo anti-barnasa y GAR-TR como se describe en Materiales y Métodos. El scFv 4D5-dibarnase unido a SKOV-3 células HER2-positivas (A y B), esta unión específica fue inhibida por scFv 4D5 (C). El scFv 4D5-dibarnase no se unió a células CTLL-2 HER2-negativo (D). se observó tinción citoplásmica de SKOV-3 células con 20 barnasa mu M (E). Magnificación, 400 ×.
La interacción de scFv-4D5 dibarnase con carcinoma de mama que sobreexpresan HER2 humana células BT-474 [25] se estudió mediante microscopía confocal. BT-474 células fueron incubadas con 20 nM scFv 4D5-dibarnase en cualquiera de 4 ° C para suprimir la internalización o 37 ° C para dejar que la internalización y se tiñeron con antisuero de conejo anti-barnasa seguido de cabra conjugado con ficoeritrina de IgG anti-conejo. Se observó la fluorescencia predominantemente en la superficie de las células se incubaron a 4 ° C (Figura 3A) y dentro de las células se incubaron a 37 ° C (Figura 3B), lo que indica que scFv 4D5-dibarnase se une a y penetra en las células BT-474. En los controles, cuando se omitieron scFv 4D5-dibarnase o conejo antisuero anti-barnasa, no se detectó fluorescencia en células BT-474 (datos no mostrados).
Las células (A) se incubaron con scFv 4D5-dibarnase en 4 ° C o (B) a 37 ° C. El scFv 4D5-dibarnase se detectó con antisuero de conejo anti-barnasa seguido de GAR-PE. La fluorescencia se observó predominantemente en la superficie de las células se incubaron a 4 ° C y dentro de las células se incubaron a 37 ° C. Esta diferencia en la localización de la etiqueta fluorescente sugiere internalización de scFv-4D5 dibarnase a 37 ° C en las células BT-474.
Internalización de scFv-4D5 dibarnase investigado por microscopía electrónica
La localización intracelular de scFv-4D5 dibarnase fue explorada por microscopía electrónica. El scFv 4D5-dibarnase fue complejo con partículas de oro (Au). El complejo de scFv 4D5-dibarnase-Au unido a células SKOV-3 (Figura 4), pero no se unen o penetrar células CTLL-2 (datos no mostrados) a 4 ° C y 37 ° C. Tras la unión del complejo a la superficie celular de células SKOV-3, las partículas de oro fueron depositados en los salientes y partes lisas de la membrana celular (Figura 4, A-D). Se observó la penetración de scFv 4D5-dibarnase-Au en SKOV-3 células a 37 ° C pero no a 4 ° C, lo que implica que la penetración es un proceso dependiente de la temperatura. La internalización de scFv-4D5 dibarnase-Au implicó la formación de depresiones revestidas (Figura 4D) que floreció desde la membrana celular y la transforman en vesículas recubiertas (Figura 4E). Dentro de las células, la mayoría de las partículas de oro se encontraban en los endosomas (Figura 4, F y G). Unas pocas partículas de oro se encuentra libre en el citoplasma adyacente a los endosomas (Figura 4, F y G, puntas de flecha). Estas observaciones sugieren que el scFv 4D5-dibarnase puede ser liberado de los endosomas en el citoplasma. Las partículas de oro también se produjeron en cuerpos multivesiculares (Figura 4H). Los núcleos no fueron etiquetados (Figura 4F).
Skov-3 células fueron incubadas con 20 nM scFv 4D5-dibarnase-Au durante 1 hora a 4 ° C oa 37 ° C. (A y B) a 4 ° C, la etiqueta de oro se depositó sobre la membrana citoplasmática (m) y salientes (asteriscos), pero no dentro de la célula. (C-H) a 37 ° C, scFv 4D5-dibarnase-Au unido a la superficie celular en la misma manera que a 4 ° C, pero también se encontró en el interior de las células en pozos recubiertos (cp) (D), vesículas recubiertas ( cv) (e), los endosomas (e) (F y G), el citoplasma (c) (F y G, puntas de flecha), y cuerpos multivesiculares (MVB) (H). El scFv 4D5-dibarnase-Au no se encontró en el núcleo (n) (F). Bar, 200 nm.
Efecto de la barnasa y scFv-4D5 dibarnase sobre la supervivencia celular
Se investigaron los efectos de la barnasa recombinante y scFv-4D5 dibarnase en la supervivencia de cáncer humano diferente líneas celulares. células mononucleares de sangre periférica humana (hPBMCs) se aislaron de la sangre periférica de donantes sanos y se utilizaron inmediatamente para examinar la citotoxicidad de la barnasa y scFv 4D5-dibarnase en células humanas normales. también se utilizaron murina CTLL-2 células T citotóxicas que carecen de HER2 humano. Todas las líneas celulares y hPBMCs se incubaron con las proteínas a varias concentraciones en medio de cultivo completo durante 72 h y se evaluó la viabilidad celular en el ensayo de MTT (Tabla 1). Las carcinoma de mama humano BT-474 células que presentan una mayor sensibilidad a la barnasa (IC
50 = 0,21 M), la más baja fue mostrado por la leucemia mieloide células HL-60 (IC
50 = 82 M). Para otras líneas celulares de cáncer, barnasa era tóxico con IC
50 varía entre el 2,4 13 de M. Las curvas de dosis-respuesta no alcanzaron equilibrio de saturación, lo que sugiere una interacción no específica de barnasa con las células. Las células Skov-3 mostraron una sensibilidad moderada (IC
50 = 5 M), lo que demuestra la respuesta más general a la citotoxicidad inducida por la barnasa que las células BT-474. Por lo tanto, se utilizaron células Skov-3 para una caracterización adicional de los efectos dibarnase-4D5 scFv en células que sobreexpresan HER2. Para hPBMCs, el efecto citotóxico máxima (27%) se logró a 110 barnasa mu M (Figura 5A, línea corta de trazos), mientras que para células SKOV-3, 1,2 M de barnasa era suficiente para producir el mismo efecto. Por lo tanto, la toxicidad barnasa era dos órdenes de magnitud mayor para el cáncer humano Skov-3 células que para hPBMCs.
(A) Los efectos de la barnasa y scFv-4D5 dibarnase sobre la viabilidad de cáncer humano y las células normales. Skov-3 células fueron tratadas durante 72 h con barnasa (línea larga discontinua) o scFv 4D5-dibarnase (línea continua), y se trataron con hPBMCs barnasa (línea discontinua corta) o scFv 4D5-dibarnase (línea de puntos y trazos). (B) La inhibición competitiva de la citotoxicidad de scFv 4D5-dibarnase por scFv 4D5. células SKOV-3 fueron tratados durante 72 h con scFv 4D5-dibarnase en ausencia (círculos negros) o presencia (triángulos blancos) de 300 nM scFv 4D5 o con scFv 4D5 sola (cuadrados blancos). (C) La inhibición de la citotoxicidad de la barnasa y la citotoxicidad scFv 4D5-dibarnase por barstar. células SKOV-3 fueron tratados durante 72 h con la barnasa (círculos blancos), barnasa y cantidades equimolares de barstar (triángulos blancos), scFv 4D5-dibarnase (círculos negros), scFv 4D5-dibarnase con un exceso molar de tres veces de barstar (negro triángulos), o barstar sola (cuadrados negros). (D) Los efectos de HRI sobre la citotoxicidad de scFv-4D5 dibarnase. Skov-3 células fueron tratadas durante 72 h con cualquiera de scFv-4D5 dibarnase en ausencia de HRI (círculos negros), scFv 4D5-dibarnase en presencia de HRI (diamantes blancos), o solo HRI (diamantes negros). La viabilidad celular se expresa como el porcentaje de la actividad metabólica de las células tratadas con respecto a las células no tratadas (retículo). Cada curva de regresión en el panel A (con intervalos de confianza del 95% indicado por líneas de puntos) representa al menos tres experimentos independientes. sigmoide de regresión se realizó con el software SigmaPlot. Las curvas de la B-D representan experimentos típicos. Las barras de error (B-D) se obtuvieron a partir de mediciones por triplicado.
La exposición de Skov-3 células que sobreexpresan HER2-a-4D5 scFv dibarnase durante 72 h mostró una citotoxicidad dependiente de la dosis de 0,1 nM a 20 nM (Figura 5A, línea continua). Otros incrementos en la concentración mejoran la citotoxicidad ligeramente, apuntando a que el efecto de scFv 4D5-dibarnase estaba limitada por la densidad de la superficie celular del receptor de HER2. El IC
50 de scFv 4D5-dibarnase era 1,8 nM, que era 2800 veces menos que el IC
50 de barnasa (Figura 5A, comparar líneas continuas y largo de trazos). Las células BT-474 mostraron la sensibilidad 4D5-dibarnase scFv comparable a la de células SKOV-3. Como IC
50 y IC
30 de scFv 4D5-dibarnase fue de 1,3 veces mayor para las células BT-474 que para células SKOV-3, pero IC
70 era 1,5 veces menor para BT-474 células que para SKOV células -3 (Tabla 1). Digno de mención, mientras que los efectos de barnasa solo en Skov-3 y BT-474 células se diferenciaron 25 veces, el scFv 4D5-dibarnase demostró efectos similares sobre estas células HER2-positivo. Al mismo tiempo, hPBMCs HER2-negativo no fueron afectados por scFv 4D5-dibarnase en concentraciones de hasta 2600 nM (Figura 5A, la línea de rayas y puntos). Estos resultados indican que el efecto de scFv 4D5-dibarnase era específica y mediada por receptor.
Para confirmar aún más que la citotoxicidad de scFv 4D5-dibarnase estaba mediada por la interacción de la fracción de scFv 4D5 con el receptor de HER2, se examinó el efecto de scFv 4D5-dibarnase en células SKOV-3 en presencia de scFv 4D5 a una concentración de 300 nM. Mientras que en sí scFv 4D5 no afectó células SKOV-3 (Figura 5B, cuadrados blancos) a concentraciones de 0,1 nM a 2000 nM, la minianticuerpo disminuye la citotoxicidad de scFv 4D5-dibarnase de una manera dependiente de la dosis (Figura 5B, triángulos blancos) . Esta dependencia sugiere que scFv 4D5 y 4D5 scFv-dibarnase compiten por el mismo sitio de unión y posterior confirmó la interacción específica de scFv-4D5 dibarnase con el receptor HER2.
Para determinar si la actividad enzimática de la barnasa era esencial para citotoxicidad, barstar, un inhibidor específico de la barnasa, se utilizó. Barstar solo no inhibió la viabilidad de células SKOV-3 a concentraciones de hasta 2000 nM. (Figura 5C, cuadrados negros). Además de barstar de barnasa en cantidades equimolares abolió la citotoxicidad barnasa en un intervalo de concentración de 0,4 a 13 mM (Figura 5C, triángulos blancos). Cuando se añade en exceso de tres veces, barstar reduce el efecto tóxico de scFv 4D5-dibarnase a concentraciones de 0,6 nM a 80 nM (Figura 5C, triángulos negros).
La inhibición de la citotoxicidad de scFv 4D5-dibarnase por barstar y scFv 4D5 confirmó que tanto 4D5 scFv y barnasa contribuir a la citotoxicidad de scFv 4D5-dibarnase a SKOV-3 células.
para probar si HRI influye en los efectos de scFv 4D5-dibarnase en las células cancerosas, HRI y scFv 4D5-dibarnase se incubaron en una proporción de 100 unidades HRI a 1 g scFv 4D5-dibarnase durante 30 min a 4 ° C y luego se añadieron a las células. El HRI solos tampoco influye Skov-3 supervivencia celular (Figura 5D, diamantes negros) ni citotoxicidad scFv 4D5-dibarnase (Figura 5D, comparar círculo negro y diamantes blancos).
degradación del ARN inducida por la barnasa en Skov-3 células
análisis en gel de poliacrilamida de ARN celular total aislado de células SKOV-3 demostró que el ARN celular se somete a la degradación en las células tratadas con 50 barnasa mu M (Figura 6). Amplia la degradación del ARN fue evidente 24 h después de la exposición de las células a barnasa (carril 3); después de 48 h, la degradación de ARN celular fue casi completa (carril 4). Tanto bajo peso molecular tRNA y rRNA 5.8S, pero no 5S rRNA, parecían más susceptibles a las 24 h de tratamiento barnasa. La aparición de las bandas adicionales (carril 3, asteriscos) indica la escisión enzimática de rRNA de alto peso molecular mediante barnasa. análisis de la imagen digital del gel en la Figura 6 (carriles 2 y 3) muestra que la abundancia relativa de tRNA y rRNA 5.8S se redujo a 30% y el 16% de las células de control, respectivamente, mientras que los niveles de 5S, 18S y 28S rRNA se disminuyó a 60%, 43% y 54% de las células de control, respectivamente.
SKOV-3 células fueron expuestas a 50 barnasa mu M durante 24 h (carril 3) o 48 h (carril 4). El ARN total se aisló como se describe en Materiales y Métodos y se analizaron en un gel de poliacrilamida 9% que contiene 7,5 M urea. Cada carril muestra se cargó con ARN a partir de 2 × no tratados 10
5 tratadas (+) o (-) de las células. Carril 2 corresponde al control de modelo de tratamiento. Las posiciones de los patrones de peso molecular de ARN (carril 1) se muestran como el número de bases a la izquierda del panel. Los asteriscos indican las bandas más prominentes que aparecen como resultado de la escisión enzimática de rRNA de alto peso molecular mediante barnasa (carril 3).
Mecanismo de acción de la barnasa y scFv-4D5 dibarnase en Skov-3 células
Para identificar y caracterizar el modo de muerte celular provocada por barnasa o scFv tratamiento 4D5-dibarnase, se prepararon células Skov-3 como se describe en Materiales y Métodos. Tanto barnasa y scFv-4D5 dibarnase indujeron una característica formación de ampollas en apoptótica de la membrana celular que fue detectable en ciertas células a las 6 h después del tratamiento y continuó siendo evidente para los siguientes 72 h (Figura 7) guía.
(a) las células tratados de forma simulada se unen a la placa y se mantuvieron estables. Las células incubadas con cualquiera de barnasa 50 M o 50 nM scFv 4D5-dibarnase (B y C) se redondearon y separan. se observó formación de ampollas en la membrana (B y C, asteriscos) y células rotas (B, punta de flecha). Fase microscopía de contraste de un campo aleatorio con una ampliación de 400 aumentos.
fragmentación del ADN en las células que mueren es un punto final en general que es común a ambos mecanismos necróticos y apoptóticos de muerte celular. Para determinar si la barnasa y scFv 4D5-dibarnase inducen roturas de ADN en células SKOV-3, se analizaron las células de yoduro de propidio (PI) se tiñeron para las alteraciones en la distribución del ciclo celular utilizando mediciones del contenido de ADN a través de citometría de flujo. El tratamiento de células SKOV-3, ya sea con o barnasa scFv 4D5-dibarnase dio lugar a una elevación gradual de la proporción de células en la fase sub-G1 (células que contienen menos de ADN de 2 N), en comparación con células control sin tratar (Figura 8a). tratados con Barnasa células SKOV-3 mostraron incrementos de 2,1%, 4,5% y 23,9% en el número de células en fase sub-G1 y disminuye en 4,0%, 0,2% y 19,5% en el número de células en la fase G1 de el ciclo celular en comparación con los controles después de 24, 48, y 72 h de tratamiento, respectivamente. Del mismo modo, tratados con 4D5-dibarnase scFv células SKOV-3 mostraron incrementos de 8,5%, 8,1% y 19,7% en el número de células en fase sub-G1 y disminuciones de 7,5%, 3,0% y 20,6% en el número de células en la fase G1 en comparación con sus respectivos controles. Además, el número de células en fase S se redujo en 4,9% y 3,1% en las células tratadas con barnasa después de 48 y 72 h, respectivamente, y por 3,6% en las células tratadas 4D5-dibarnase-scFv después de 48 h. Por otra parte, el análisis del ciclo celular no reveló diferencias significativas en las células en G2 /M fase del ciclo celular entre el control y las células tratadas (Figura 8A). Estos resultados sugieren que tanto la barnasa y scFv 4D5-dibarnase inducen roturas en el ADN principalmente en las células G1. Por el contrario, SKOV-3 células privadas de suero mostraron un aumento en el porcentaje de células en fase sub-G1 (35,7%), que acompaña disminuye en las otras tres fases [G1 (12,7%), S (9,1%), y G2 /M (13,8%)] en comparación con las células de control.
se realizó un análisis de citometría de (a) de flujo de la distribución del ciclo celular como se describe en Materiales y Métodos. Los histogramas representan las diferencias en los porcentajes de células entre las células barnase- o 4D5-dibarnase tratados con scFv y no tratados para cada etapa del ciclo celular (sub-G1, G1, S y G2 /M) mide después de 24 h (barras negras), 48 h (barras azules) y 72 h (barras verdes) de tratamiento. Las barras de error muestran la desviación estándar. Los controles positivos para la fragmentación de ADN fueron SKOV-3 células cultivadas durante 7 días en medio libre de suero (barras de color naranja). ensayo de electroforesis (B) de ADN. Las células se trataron con 50 barnasa mu M o 50 nM scFv 4D5-dibarnase. Setenta y dos horas más tarde, el ADN genómico de ambos tratados (+) y sin tratar (-) las células se aisló y el ADN de un número igual de células se resolvió en no desnaturalizante 1,5% geles de agarosa. El ADN se visualizó por tinción con bromuro de etidio. fragmentos de cromatina resultantes de la escisión internucleosomal estaban presentes en muestras de ADN de las células tratadas con la barnasa (carril 2) y scFv 4D5-dibarnase (carril 6). ADN de las células privadas de suero (ss) se escindieron de manera irregular (carril 7). Carriles 3 y 5 representan los controles no tratados. Los carriles 1 y 4 son marcadores de peso molecular ((M) Hyperladder I, Bioline). (C) Las células se expusieron a 50 nM scFv 4D5-dibarnase durante 72 h y luego se tiñeron con naranja de acridina, se analizaron por microscopía de fluorescencia, y se fotografiaron. Se muestra un caso representativo de picnosis nuclear y la fragmentación (cariorrexis) (recuadro). Magnificación de 400 × (1200 ×, recuadro).
Para dilucidar el modo de apoptosis o necrosis de la fragmentación del ADN fue provocada por la barnasa y scFv-4D5 dibarnase, ADN genómico que se aisló de Skov-3 células tratados con 50 barnasa mu M o 50 nM scFv 4D5-dibarnase a electroforesis a través de un gel de agarosa al 1,5% (Figura 8B). Setenta y dos horas después de la barnasa o scFv 4D5-dibarnase tratamiento, SKOV-3 células muestran característica escisión internucleosomal de la cromatina (Figura 8B, calles 2 y 6), que difiere de la escisión de ADN irregular de SKOV-3 células privadas de suero (Figura 8B, carril 7). Por otra parte, el tratamiento de células SKOV 3 con scFv 4D5-dibarnase indujo un patrón distinto de picnosis nuclear y la fragmentación (cariorrexis) como se observa por microscopía de fluorescencia después de la tinción de las células con naranja de acridina (Figura 8C).
También usado anexina-V-FITC /PI tinción para medir la aparición de fosfatidilserina, un marcador de la apoptosis, en el prospecto exterior de la membrana plasmática de las células SKOV-3 (Figura 9, a-C). Las células tratadas durante 72 h con o bien 50 barnasa mu M o 50 nM scFv 4D5-dibarnase se encontró que eran anexina-V-FITC positivo y PI negativo en un porcentaje más alto (21,7% y 32,7%, respectivamente) que en las células no tratadas (1,5% ). Estos resultados indican que la naturaleza de la muerte celular inducida por tanto barnasa y scFv 4D5-dibarnase es apoptótica. Un aumento en las células necróticas (anexina-V-FITC positivo y PI positivo) fue del 2,0% para las células barnasa tratados y 2,6% para scFv células-dibarnase tratados con 4D5 en comparación con los controles, diez veces menor que la de las células apoptóticas.
(a-C) SKOV-3 células fueron modelo de tratamiento (a) o tratados con 50 barnasa mu M (B) o 50 nM scFv 4D5-dibarnase (C) durante 72 h. Las células se analizaron para la apoptosis temprana mediante tinción con anexina-V-FITC /PI. Los cuadrantes inferior izquierda de cada panel muestran las células viables, que excluyen PI y son negativas para la unión de Anexina-V-FITC. Los cuadrantes superior derecho contienen los, células necróticas no viables, que son positivos para la unión tanto de anexina-V-FITC y la captación de PI. Los cuadrantes inferiores derecha representan células apoptóticas, Anexina-V-FITC positivo y negativo PI. Se muestra un experimento representativo de tres. (D y E) Las actividades enzimáticas de caspasa-3-como de las células tratadas con o bien 50 barnasa mu M (D, pico sin relleno) o 50 nM scFv 4D5-dibarnase (E, pico sin relleno) durante 72 h se evaluaron mediante la escisión de la fluorogénico sustrato PhiPhiLux-G
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2 y en comparación con la de las células no tratadas (picos rellenos). marcadores M1 y M2 se corresponden con los niveles de activación de la caspasa-3 en las células tratadas y no tratadas, respectivamente.
Para investigar más a fondo el modo de muerte celular inducida por la barnasa y scFv-4D5 dibarnase, que mide la activación de un-apoptosis específica de la caspasa-3 por el ensayo de escisión proteolítica de PhiPhiLux-G
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2 sustrato (Figura 9, D y e). la actividad de caspasa-3-como se incrementó en un 13,1% para barnase- y un 11,6% para los tratados 4D5-dibarnase-scFv-3 SKOV células en comparación con los controles no tratados.
En conclusión, la capacidad de barnasa y 4D5 scFv -dibarnase para inducir la formación de ampollas en la membrana, la aparición de fosfatidilserina en la cara externa de la membrana plasmática, la fragmentación de la cromatina internucleosomal, y la activación de la caspasa-3 apoyan la noción de que estas proteínas desencadenan la muerte celular apoptótica.
Discusión
Barnasa se ha empleado con éxito en una serie de estudios para la eliminación de las células en varias especies [3] - [5 y 9 a 14]; sin embargo, los efectos citotóxicos de la barnasa en las células cancerosas no se han investigado suficientemente. Aquí, la barnasa recombinante ha demostrado ser tóxico para las líneas celulares de carcinoma humanas con CI
50 valores que van desde 0,2 a 13 mM y a las líneas celulares de leucemia con IC
50 valores que van desde 2,4 a 82 mM (Tabla 1). En comparación con otras RNasas [29], la barnasa es moderadamente tóxico para las células cancerosas humanas. Los efectos de la barnasa en diferentes líneas celulares de cáncer variaron 400 veces. La línea celular más sensible fue BT-474 (IC
50 = 0,21 M), y la menos sensible fue HL-60 (IC
50 = 82 M). La amplia propagación en el IC
50 valores para varias líneas de células también es inherente a la ribonucleasa bovina seminal (BS RNasa) y la onconasa, una ribonucleasa de
Rana pipiens
. Los efectos de la BS RNasa en las líneas celulares de carcinoma de variaron de 570 veces; y los efectos de la onconasa en líneas celulares de carcinoma de leucemia y variadas 6.000 veces [30]. La variedad observada en la susceptibilidad de las líneas celulares de barnasa puede ser causada por las diferencias en modificaciones y /o composición de las moléculas de superficie celular que determinan la unión de barnasa a la superficie celular. La forma y la fuerza de la influencia de unión a la eficiencia de la captación celular de RNasa [31] o la vía de la internalización de RNasa.