Extracto
Antecedentes
Muchos procesos biológicos importantes son controlados a través de interacciones célula-célula , incluyendo la colonización de las células tumorales metastásicas y el control de la diferenciación de células madre dentro de su nicho. A pesar de la importancia crucial del entorno celular en la regulación de la señalización celular,
in vitro
métodos para el estudio de tales interacciones son difíciles y /o indirecta.
Metodología /Principales conclusiones
Se presenta en el desarrollo de un método basado en la imagen para distinguir dos tipos de células cultivadas en co-cultivo. Además, las células de un tipo que están en contacto directo con las células de un segundo tipo (células adyacentes) pueden ser analizados por separado de las células que no están dentro de un solo pozo. Los cambios se evaluaron utilizando las estadísticas de población, que son útiles en la detección de cambios sutiles en dos poblaciones. Hemos usado este sistema para caracterizar los cambios en la línea celular de carcinoma de próstata LNCaP cuando se cultivan en contacto con células endoteliales vasculares humanas (HUVECs). Encontramos que la expresión y la fosforilación de WWOX se reduce en las células LNCaP cuando se cultiva en contacto directo con las HUVEC. señalización WWOX reducido se ha asociado con la activación reducida o expresión de JNK y p73. Encontramos que los niveles de p73 también se reducen en las células LNCaP cultivadas en contacto con las HUVEC, pero no se observó un cambio en los niveles de JNK.
Conclusiones /Importancia
Nos encontramos que el método descrito es estadísticamente robusto y se puede adaptar a una amplia variedad de estudios en los que la función celular o la señalización se ven afectados por el contacto célula-célula heterotípicos. Irónicamente, un potencial desafío para el método es su alto nivel de sensibilidad es capaz de clasificar eventos como estadísticamente significativa (debido a las células de alto número de evaluados individualmente), cuando el efecto biológico puede ser menos clara. La metodología se utiliza mejor en conjunción con los métodos adicionales para evaluar la función biológica de las diferencias potencialmente sutiles entre poblaciones. Sin embargo, muchos eventos importantes, tales como el establecimiento de un tumor metastásico, se producen a través de cambios raros pero importantes, y métodos como se describe aquí puede ser utilizada para identificar y caracterizar la contribución del medio ambiente a estos cambios.
Visto: P Lapan, Zhang J, colina A, Zhang y, Martínez R, S Haney (2009) basado en imagen evaluación del crecimiento y cambios de señalización en las células cancerosas mediado por la célula directa de células de contacto. PLoS ONE 4 (8): e6822. doi: 10.1371 /journal.pone.0006822
Editor: Andreas Bergmann, Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 20 Abril, 2009; Aceptado: July 13, 2009; Publicado: 31 Agosto 2009
Derechos de Autor © 2009 LaPan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer es una enfermedad compleja que a menudo se caracteriza por ser. crecimiento dysregulated [1]. Mientras que la raíz de la proliferación de células de cáncer es el resultado de una pérdida de los controles reguladores de crecimiento y ciclo celular dentro de las células de cáncer de los propios, los cambios en la forma en las células del cáncer interactúan con el ambiente circundante también son críticos para el desarrollo de tumores y cáncer clínica [2], [3]. Estos incluyen señales proliferativas e invasivos de transmisión a partir de células del estroma y las señales de proangiogénicos de células cancerosas al endotelio. Estas interacciones entre las células cancerosas y su entorno han sido más difíciles de caracterizar y objetivo para la intervención terapéutica de los cambios intrínsecos a las células cancerosas, ya que
in vitro
modelos de las interacciones célula-célula son difíciles de establecer y normalizar, especialmente en la escala necesaria para la detección de drogas. A pesar de estas dificultades, la interacción entre las células cancerosas y su entorno han demostrado ser una estrategia efectiva para el tratamiento del cáncer [4], y por lo tanto una mayor atención a cómo funcionan las células cancerosas como tumores es un problema importante.
Los métodos para
in vitro
estudio de las interacciones celulares de cáncer con células estromales y endoteliales se han desarrollado, por ejemplo, cómo las células cancerosas inducen la angiogénesis y reclutan macrófagos [5] - [8]. métodos relacionados permiten el estudio de la señalización intercelular a través de una fase de co-cultivo para inducir paracrina y cambios dependientes del contacto heterotípicos, seguido de separación de los tipos de células para la cuantificación por el perfil transcripcional, Western Blot o métodos relacionados. La capacidad para detectar cambios en las muestras cultivadas en cocultivo directo, el monocultivo mixto (mediante el uso de insertos o barreras físicas relacionadas), y el monocultivo estándar usando medios condicionados permite tales procesos para ser atribuidos a niveles específicos de interacciones. Si bien valioso, estos sistemas llevan limitaciones basándose en las respuestas que deben ser promediados a través de toda la muestra para cada tratamiento, y típicamente implican un procesamiento significativo para separar los tipos de células después de cocultivo directo para generar muestras homogéneas para perfiles o análisis relacionados. La integración de la microscopía de fluorescencia cuantitativa (High Content Screening, o HCS) en el proceso y el descubrimiento de fármacos principios de la investigación biológica básica [9] - [11] ofrece métodos para mejorar los estudios de cocultivo, facilitando la medición directa de la morfología, proliferación y señalización celular en las células cultivadas en contacto directo con los diferentes tipos de células.
Hemos desarrollado y probado un algoritmo para la cuantificación de los cambios en las células cancerosas epiteliales cultivadas en contacto directo con las células endoteliales. El método identifica el tipo de células y la ubicación para determinar la proximidad de las células endoteliales a las células cancerosas, y cuantifica las características celulares, incluyendo la salud de las células y el grado de activación de vías de señalización de las células adyacentes a las células endoteliales y compara estas características a las células epiteliales que no son -Junto a las células endoteliales. El proceso puede ser invertido, para caracterizar los cambios en las células endoteliales que resultan de interacciones con las células cancerosas. El efecto de las células cancerosas en las células endoteliales se puede medir mediante la comparación de estos dos grupos dentro de la misma muestra sin separar células. Demostramos el enfoque utilizando células de la próstata y el cáncer de mama, y validar el método demostrando que la expresión génica cambios identificados en los estudios de perfiles de transcripción se observa en las muestras estudiadas con los métodos descritos.
Materiales y Métodos
Las células, medios, reactivos y condiciones de cultivo
Las células HUVEC se compraron de Cambrex (Cat #: CC-2519) y se mantuvieron en medio EBM-2 (endotelial medio de crecimiento celular: CC-3162 con 2% de FBS) , las células HUVEC se cultivaron durante no más de diez pases. La línea de cáncer de próstata LNCaP (ATCC, Manassas, VA) se cultivó en RPMI 1640 suplementado con glutamato, aminoácidos no esenciales, penicilina-estreptomicina y 10% de FBS (todos de Invitrogen, Carlsbad, CA).
Mouse anti-CD31 (Cat #: 550389) era de BD Pharmingen (San Diego, CA), de ratón anti-CDw75 (IgM) (Cat #: ab9515-500) fue de Abcam (Cambridge, MA), de conejo anti WWOX (28- 42) (Cat #: AP1008) era de Calbiochem /Merck Chemicals (Gibbstown, NJ), anti-conejo (pThr33) WWOX (Cat #: AP1009), era de Calbiochem /EMD Chemicals, ratón anti p73 (Cat #: 32- 4200) fue de Zymed /Invitrogen, ratón anti-c-Jun (Cat #: OP55) era de Calbiochem, ratón anti-JNK1 (Cat #: MAB17761) era de R & amp; D Systems (Minneapolis, MN)
alto contenido de análisis
Las células HUVEC y LNCaP fueron cultivadas por separado en frascos T75, se trataron con tripsina y se mezcla en un medio FBS 01:01 en relación EBM2-2%, a 5000 células (total) /pocillo en poli- placas de 96 pocillos D-lisina (BD: Biocoat 356640). 48 horas más tarde, las células se lavaron una vez en PBS, se fijaron en 4% PFA durante 10 min, se lavaron dos veces con PBS, se permeabilizaron mediante incubación en 1% de Triton X-100 durante 3 minutos, y se lavaron tres veces en PBS. Todo tinción de anticuerpos se realizaron en PBS con suero de cabra al 1%. Se añadieron los anticuerpos primarios en su determinado empíricamente-dilución óptima: anti-CDw75 a las 1:50; anti-WWOX, anti-pWWOX, anti-P73, anti-c-Jun, anti-JNK1 se utiliza todo a una dilución de 1:100. Después de tres lavados con PBS, Alexa marcado con anticuerpos secundarios (Molecular Probes /Invitrogen) se añadieron a una dilución 1:200 y DAPI esta en núcleos de manchas, como se indica en la figura de leyendas.
Coculture, la separación y el ARN preparación de perfiles de transcripción
células
LNCaP y HUVEC se expandieron por separado en matraces T75. HUVECs fueron cultivadas a 70% de confluencia, momento en el que 7 × 10
5 células LNCaP se sembraron, y las células fueron cultivadas en EBM2-2% de FBS durante 48 horas. Las células se trataron con tripsina y se resuspendieron en 1 ml (para un matraz T75) helado de PBS /0,1% BSA (& lt; 4 × 10
6 células /ml), 25 l de Dynabeads CD31 unida (4 × 10
se añadieron 111-55D), se mezcló bien y se incubó a + 4ºC con suave inclinación y la rotación de 20 min: 8 perlas /ml) (Invitrogen. Se añadió 1 ml PBS enfriado en hielo /0,1% de BSA y la muestra se colocó en un Dynal MPC (Magnetic Particle Concentrador, Invitrogen) durante 2 min para sedimentar las perlas. El sobrenadante, que contenía las células LNCaP, se guarda por separado, y las perlas se resuspendieron en 1 ml PBS helado% 0.1BSA /de nuevo, y se eliminó el sobrenadante y se guarda. El proceso de lavado se repitió 4 veces y los sobrenadantes reunidos. La piscina se centrifugó y el sedimento se marcó la fracción LNCaP y las perlas se etiqueta como la fracción HUVEC. RNA tampón de lisis se añadió en ambas fracciones y el ARN se purificó usando un kit Qiagen miniRNA (Valencia, CA). muestras de ARNm se prepararon y se procesaron para el perfil transcripcional utilizando los GeneChips Affymetrix U133A como se describe anteriormente [12].
algoritmo de proximidad
co-cultivos celulares se tiñeron con DAPI, que manchará los núcleos de todas las células y un colorante específico segundo tipo de célula. Estamos utilizando cualquiera de CD44 para identificar células HUVEC o CDw75 para identificar las células LNCaP. La fluorescencia se cuantificó usando un escáner de alto contenido Celómica VTi. Las imágenes fueron analizadas en CellProfiler [13] siempre que la x-coordenada y ubicación de un núcleo dentro de una imagen determinada. Utilizando las coordenadas x-y nucleares, la x e y offsets de una celda de otra célula se puede calcular. Estos desplazamientos proporcionan la longitud de los lados de un triángulo rectángulo.
La distancia d entre los dos núcleos se calcula utilizando estas compensaciones y el Teorema de Pitágoras, whereand es la distancia x entre x
1 y x
2 y es la distancia y entre y
1 ey
2. Si la distancia d es menor que el diámetro medio de las células, se consideran las dos células para ser adyacentes entre sí. Por el contrario, si la distancia d es mayor que el diámetro medio de las células, se consideran las dos células a ser no adyacente. El diámetro medio de las células se determinó mediante la tabulación de los valores "MinorAxisLength" "MajorAxisLength" y que se calcula CellProfiler para un conjunto de imágenes de referencia
.
La distancia nuclear y la tinción o coloración CD44 fueron entonces CDw75 utilizado para determinar que las células HUVEC estaban en contacto con una célula LNCaP por el siguiente proceso. El primer paso incluye la identificación de todas las células en la población en general mediante el cocultivo tinción DAPI nuclear. El segundo paso consiste en subdividir la población de todas las células en dos subpoblaciones, las células que se tiñen con CD44 (HUVEC) y los que se tiñen con CDw75 (LNCaP). Por último, el tercer paso es subdividir aún más la población epitelial en dos subpoblaciones, las células LNCaP adyacentes a una célula HUVEC y los que no adyacente a una célula HUVEC. Una lista de todas las células LNCaP células (CDw75 positivos o negativos CD44) y HUVEC (CDw75 negativa o positiva CD44) se construyó. Se calculó la distancia de Pitágoras para cada célula LNCaP en comparación con cada célula HUVEC. Las distancias más pequeñas que el diámetro medio de una célula LNCaP fueron marcados como células LNCaP adyacentes a las células HUVEC.
KS estadística
Se identificaron subpoblaciones adyacentes y no adyacentes de células por medio de la proximidad se ha descrito previamente algoritmo. La intensidad de un antígeno de interés se comparó a través de estas dos poblaciones utilizando la función ks.test en el lenguaje de programación R (www.r-project.org). Se utilizó una de dos caras ks.test p-valor inferior a 0,05 inferir que las dos distribuciones de subpoblación no provenían de la misma distribución de los padres.
Análisis del mosaico de células LNCaP adyacentes y no adyacentes
Para los datos mostrados en la figura, se consideraron dos pozos. A partir de estos dos pocillos, 3428 células LNCaP estaban disponibles, y se clasifican como o bien adyacente (655) o no adyacente (2773). A partir de estas células, se seleccionaron todos los posibles 655 células adyacentes, y 1000 células no adyacentes se tomaron muestras al azar. Para hacer un mosaico cuadrado, los primeros 625 células de cada una de estas muestras se muestran en una matriz de 25 × 25 de las imágenes. Cada imagen celda era un cuadrado de píxeles 10 × 10, centrada en el (x, y) las coordenadas de una célula. Canal 3 imágenes (P73) se visualiza usando el mapa de color HSV por defecto, con límites fijos de color de 12 bits (intensidades de 0-4.096) de manera que las escalas de intensidad fueron los mismos para todas las imágenes.
Resultados
Desarrollo de un método basado en la imagen para el estudio de las células endoteliales en contacto directo con las células del cáncer
a través de inmunofluorescencia indirecta de antígenos específicos del tipo de células, hemos sido capaces de identificar las condiciones que permiten que las células de diferentes orígenes para estar etiquetados para HCS. Condiciones para etiquetar específicamente a las células HUVEC ya se han descrito, a través del uso de anticuerpos específicos para PECAM, o CD31 [14]. Este etiquetado se utiliza para estudios basados en la citometría de flujo y, como tal, había una alta probabilidad de que tal detección sería posible en un sistema de cultivo adherente. Los anticuerpos se obtuvieron de fuentes comerciales y se determinaron con condiciones mínimas de fijación de cribado y de tinción. Una amplia variedad de marcadores candidatos están disponibles para la detección de células de carcinoma de próstata, lo más notablemente antígeno prostático específico (PSA) y antígeno de membrana específico de la próstata, que son tanto clínicamente relevante para el cáncer de próstata (aunque sí PSA es una proteína secretada, su producción puede ser detectado dentro de las células de cáncer de próstata) [15]. marcadores candidatos adicionales incluyen antígenos tumorales que normalmente muestran expresión altamente restringido (por lo general de los tipos de tejidos fetales o de adultos limitado). Un ejemplo de esta última categoría es CDw75, un marcador de superficie celular para linfocitos de células B producidos por un beta-galactósido alfa-2,6-sialil-transferasa [16]. Expresión de antígenos CDw75 se ha observado en muchos cánceres epiteliales, tales como el estómago y el colon [17], [18]. En una pantalla de marcadores candidatos para la detección de células de carcinoma de próstata en cocultivo con células endoteliales, se encontró que CDw75 era un marcador específico de las tres líneas celulares de próstata en estudio. experimentos de cocultivo mostraron que los tipos de células pueden ser fácilmente identificados y definitivamente el uso de anticuerpos para estos marcadores.
Tras la identificación de determinados tipos de células en co-cultivo, hemos tratado de identificar las células que están en contacto heterotıpica. Nuestro enfoque para hacer esto fue identificar todas las células según el tipo y la ubicación, y luego desarrollar un método para analizar las células en grupos de células adyacentes y no adyacentes con respecto a las células no diana población se encuentra en cocultivo con. HCS es altamente multiparamétrico, la captura de entre una docena y más de 100 características por célula [10], [11], [19]. características fundamentales incluyen el contenido de ADN, el tamaño y la forma del núcleo. Las características adicionales son dependientes de los métodos utilizados para marcar las células, y pueden incluir mediciones del citoesqueleto, orgánulos, o proteínas específicas y su localización y la fosforilación de estado [20]. En el contexto del presente estudio, hemos desarrollado condiciones para la detección de células individuales y su expresión de CD31, ya sea o antígenos CDw75, y su ubicación en el campo. La última característica nos permite determinar la proximidad de dos células entre sí. La identificación de una célula como adyacente puede ser estrictamente definida por la distancia de los núcleos de una célula de cáncer a una célula endotelial. Como tal, las células pueden ser segregados en adyacentes y no adyacentes, y las diferencias entre estos dos grupos puede ser determinada.
El algoritmo se ha usado para identificar las células LNCaP adyacentes y no adyacentes, en relación con las células HUVEC, como se muestra en la Figura 1. en la Figura 1A, las células LNCaP, marcadas con un anticuerpo anti-CDw75 en rojo, se siembran con HUVECs, se tiñeron con un anticuerpo anti-CD44 en verde. La intensidad de la fluorescencia basada en CDw75 se registra para cada celda en el campo. Cada célula está numerada, y la intensidad para cada celda se muestra en la Figura 1B. A partir de esta medición, las células se pueden clasificar como cualquiera de cáncer o células endoteliales. Además de la tinción CDw75, otras propiedades asociadas con las células de cáncer se pueden utilizar en esta etapa, incluyendo el contenido de ADN (muchas líneas celulares de cáncer, incluyendo LNCaP son aneuploides y tienen significativamente mayor contenido de ADN de las células primarias). Estos datos pueden ser incluidos con la intensidad antígeno para marcar células como cancerosas o no, o en algunos casos se pueden utilizar como un único parámetro para esta determinación (datos no mostrados). Una vez se han identificado las células, su información espacial se utiliza para asignar cada célula a su ubicación. Habiendo identificado cada célula como LNCaP o HUVEC, cada célula es entonces obtuvo para las células que están cerca de él, la distancia límite se establece por el diámetro medio de las células. Las células de un tipo, LNCaP en este ejemplo, por lo tanto, se definen adicionalmente como adyacente a HUVEC o no. Las células identificadas como adyacente se muestran esquemáticamente en la figura 1C en amarillo, o no adyacentes, en rojo. Las células HUVEC se muestran como verde. Desde este punto en adelante, los datos cuantitativos pueden ser extraídos y analizados para los dos subconjuntos de células LNCaP. Las diferencias entre estos subconjuntos son indicativos de una respuesta al contacto directo con las células HUVEC.
Coculture de células LNCaP y HUVECs, las células LNCaP se marcan con anticuerpos anti-CDw75 y se muestran en rojo, HUVECs están etiquetados con anti-CD44 anticuerpos, en verde. A. Una imagen de ejemplo de campos. B. La cuantificación de la fluorescencia CDw75 utilizado en la caracterización de las células, ya sea como LNCaP (alta intensidad, rojo) o HUVEC (de baja intensidad, verde). C. Mapeo de LNCaP y células HUVECs. Las ubicaciones pueden ser comparadas con las células en el panel A. Las células se identifican como LNCaP adyacentes en células LNCaP amarillo, no adyacentes en rojo y en verde HUVEC.
Un desafío importante para el desarrollo de un algoritmo de proximidad para HUVECs puede verse en la Figura 1C. La heterogeneidad de tamaño y forma de las células hace que sea difícil asignar una distancia entre dos células basándose en la ubicación del núcleo. Asignación de una distancia de un núcleo que representa un radio medio para el cuerpo de la célula falsea las interacciones entre muchas células. Las células que varían en tamaño, o se alargan de manera significativa, no se pueden abordar en la mayoría de los algoritmos de análisis de imagen actuales. Dos cuestiones prácticas son: (a) qué medidas se pueden instituir para minimizar los efectos de la variabilidad en el tamaño celular, y (b) la cantidad de error puede tolerar el algoritmo antes de que un efecto no se pueden observar? Los efectos de cambiar la forma en la que se colocan al lado se examinó células, se evaluó el impacto global de la variabilidad de las condiciones de co-cultivo en placas sobre la solidez del enfoque, en general, en la sección de análisis, más adelante en este estudio.
Los genes candidatos en las células endoteliales que muestran los cambios en los niveles de expresión cuando se cultivan con células de cáncer
Varios estudios han sido publicados que describen los cambios en los niveles de expresión de genes en líneas celulares de cáncer cultivadas en co-cultivo [21] - [25]. Cada sistema ha identificado los eventos vía de señalización específicos, tanto en las células cancerosas y del estroma, que se activan por contacto célula-célula. Hemos tratado de identificar los cambios en las líneas celulares que estamos utilizando en estos estudios como la más robusta fuente de proteínas candidatas para ser utilizado para validar el sistema que hemos descrito. Utilizamos las células de carcinoma de próstata LNCaP sin semillas y células endoteliales HUVEC como el sistema de co-cultivo para desarrollar una lista de genes candidatos para los estudios de validación. Esto se logró utilizando métodos tradicionales para cocultivo directo, el crecimiento de las células durante un período específico de tiempo, seguido de una separación mecánica de los dos tipos de células. Específicamente, se utilizó perlas CD31 conjugado para separar rápidamente y cuantitativamente las células endoteliales de las células de carcinoma de próstata, después de tripsinización del cultivo mixto. La capacidad de las perlas para separar los dos tipos de células se caracteriza por inmunofluorescencia y por RT-PCR. Las dos muestras de células fueron verificados por inmunofluorescencia indirecta utilizando anticuerpos CD31, y se demostró que las células separadas por las perlas eran de hecho CD31 positivo, mientras que las células que no están vinculados por las perlas eran CD31 negativo. Estos resultados indican que el método era capaz de separar cuantitativamente los dos tipos de células después de cocultivo.
transcripcional cambios que se producen en células LNCaP después de co-cultivo con células HUVEC se identificaron utilizando arrays de oligonucleótidos, comparando el crecimiento de las células en co-cultivo con HUVEC células y después del crecimiento como un co-cultivo simulacro; células de monocultivos fueron tratados con el protocolo de separación basado en perlas de una manera idéntica a las muestras de cocultivo reales. Antes de la completa el perfil transcripcional de microarrays de ADN, hemos comprobado la separación de los tipos de células por RT-PCR de tres genes expresados en las células endoteliales. Los datos se presentan en la Figura 2. Aquí, se muestran los resultados para tres genes para el cocultivo y las muestras simuladas. Los tres genes, PECAM /CD31, KDR /MET y VE cadherina se expresa bien en células HUVEC, pero mal en las células LNCaP, como se muestra en los experimentos de monocultivos (Mock) en la Figura 2. Los datos de las muestras de cocultivo muestra la eliminación de HUVEC células de las células LNCaP en los sobrenadantes a ser esencialmente completa. Por lo tanto, hemos sido capaces de células LNCaP de cultivo con las células HUVEC, y luego separar los tipos de células para el análisis de perfiles de transcripción.
análisis de genes entothelial en muestras de mono y co-cultivo después de una separación de la célula de RT-PCR tipos. Las células cultivadas como monocultivos, cualquiera de las células endoteliales o de la próstata, se trataron de una manera idéntica a la utilizada para separar las células después de cocultivo. Las células se recuperaron mediante la unión a perlas se sedimentaron y ant-CD31 conjugado. Los datos de expresión de cada gen /condición se reporta como su nivel de expresión en relación con el gen de control (β-2-macroglobulina) para cada muestra. Círculos: pellet; Triángulos: sobrenadante [dependiendo del Diario, es posible que quieran esta información en una leyenda; La figura original tiene una leyenda]
transcripcional de perfiles identificado 44 genes que se upregulated por co-cultivo con células HUVEC, y 4 genes que son regulados a la baja, que se muestran en la Tabla 1. Se identificaron cuatro genes por cada dos clasificados en las matrices de oligonucleótidos, MOBK1B, SASH1, TGOLN2 y WIPI49; calificadores redundantes se eliminan de la lista. A partir de los genes candidatos en esta lista, que exhibió proveedores comerciales para los anticuerpos que identificar de manera específica los objetivos por Western Blot e inmunofluorescencia indirecta. En muchos casos, los anticuerpos comerciales no eran suficientemente específica, como se determina tanto por transferencia de Western y HCS. En general, los anticuerpos ya sea dieron una banda de reacción cruzada significativa en transferencias de Western o no mostraron una tinción titulable en un patrón celular esperado para el antígeno. Este fue el caso de TNFRSF19, que tenía el cambio más dramático en los niveles de expresión de ARNm. Sin embargo, en el caso de WWOX, identificado como las reguladas por el contacto célula-célula en las células LNCaP, hemos sido capaces de identificar y validar los reactivos apropiados. WWOX ha sido bien caracterizado como un supresor tumoral, a raíz de los estudios que su expresión se pierde con frecuencia como resultado de desplazamientos dentro del sitio frágil FRA16D [26], [27], incluyendo los cánceres de próstata [28]. Aunque la expresión se pierde en muchos tipos de cáncer, su expresión con frecuencia se puede observar en muchas líneas celulares de cáncer [29]. WWOX es fosforilada en el residuo de Thr-33 en respuesta al tratamiento con TNF-α y hyaluranidase [30]. Fosforilada WWOX activará entonces p53, pero esta inducción de la apoptosis es suprimida por JNK1, en parte, a través de una asociación directa con WWOX [31]. Como tal, la expresión WWOX reducido también atenuar la apoptosis que resulta de la exposición a ambientes exteriores, tales como sitios de pre-metastásicas antes del establecimiento de un nuevo crecimiento del tumor. La identificación de reducido significativamente la expresión de WWOX en las células LNCaP por contacto con HUVECs presenta un proceso biológicamente relevante que pueda ser analizada en el sistema que describimos.
La detección de cambios en las vías de transducción de señales en el carcinoma de próstata las células resultantes del contacto célula-célula
para probar la respuesta de los niveles de WWOX de co-cultivo, la metodología necesaria para ser alterado. Específicamente, el método es actualmente no robusto en cuatro canales, debido a la superposición espectral en el rango azul a naranja de los espectros y cierta debilidad en la intensidad en el rango rojo. Como tal, el etiquetado de un antígeno necesario para ser omitido para incluir WWOX. Intentamos omitiendo el antígeno CD31 y probando si CDw75 tinción fue suficiente para diferenciar entre células LNCaP y HUVEC. Se evaluaron Monocultivos y cocultivos para determinar la distribución de los niveles de tinción CDw75 en cada tipo de célula y para determinar el punto en el que HUVECs comenzó a ser llamado como LNCaPs. El rango de niveles para los dos tipos de células fue similar a lo que se observó en la fase inicial del estudio (Figura 1), donde las células LNCaP mostraron una amplia gama de manchas, pero sólo unas pocas células por campo se tiñeron lo suficientemente ligera que podría ser clasificado como HUVEC, y por lo tanto este método para distinguir los dos tipos de células apareció lo suficientemente robusta como para permitir la tinción de WWOX o fosfo-WWOX también. La identificación de tipos de células y cuantificación de los niveles WWOX se muestra en la Figura 3. Asociación de las intensidades de señalización con el tipo de célula correcto fue mejorado en los estudios iniciales (descrito anteriormente) mediante la limitación del número de células cultivadas en placas, en particular para el HUVECs.
células LNCaP y HUVECs en cocultivo se marcaron usando (panel a) DAPI, para identificar los núcleos, (panel B) anticuerpos anti-CDw75, para identificar las células LNCaP, y (panel C) anticuerpos anti-WWOX. En el panel D, las células clasificadas como HUVEC se muestran como cuadrados rojos, células LNCaP adyacentes como cuadros amarillos y células LNCaP no adyacentes como cuadrados azules.
Para probar el enfoque basado en imágenes que hemos desarrollado, examinamos si los cambios en la expresión WWOX hemos identificado en los estudios de perfiles de transcripción podrían recapitulan en células LNCaP en el sistema que hemos descrito anteriormente. Se compararon los niveles de proteína WWOX en células LNCaP en las células adyacentes y no adyacentes. pozos múltiples se utilizaron para las células y los HUVECs LNCaP de cultivo y posteriormente se fijaron y se tiñeron con DAPI y los anticuerpos a CDw75 y, o bien WWOX o fosfo-WWOX. Se determinaron las células LNCaP a ser adyacentes o no adyacentes a HUVECs y se analizaron para los niveles de proteína diana. Se determinaron los niveles de proteína diana medias y las desviaciones estándar. A partir de estos datos, se calcularon la relación y valor de p de los niveles de proteína diana en células LNCaP adyacentes y no adyacentes. Los datos de estas comparaciones se presentan en la Figura 4. Los datos muestran que las células LNCaP adyacentes con frecuencia han reducido los niveles de ambos WWOX y fosfo-WWOX y como la diferencia se hace más grande, mayor será la importancia de la medición. Por el contrario, los pozos no muestran una diferencia estadísticamente no fueron tan robusto. Esto parece demostrar que no siempre es posible hacer una determinación acerca de si el contacto directo ha tenido un efecto, pero cuando podemos hacer una determinación, los resultados muestran que estos antígenos son más bajos en las células LNCaP que entran en contacto HUVEC. Los pozos que no muestran un efecto han sido comparados con los que lo hacen, y se observa que los pozos que no muestran una diferencia lo hacen como resultado de muy pocas células LNCaP se puntúan como adyacente, normalmente a través de una distribución desigual de las células durante chapado .
determinaciones independientes, a través de múltiples pozos, de la relación de WWOX (cuadrados negros) y los niveles en las células LNCaP que son adyacentes o no adyacentes a HUVECs fosfo-WWOX (cuadrados rojos) se muestran. Cada punto representa un pozo individual, donde se evaluaron ~ 350 células LNCaP adyacentes y ~1500 no adyacentes.
Una observación separada es que a pesar de las diferencias en muchos pozos son estadísticamente significativos (con valores de p inferiores 1 × 10
-3), la magnitud del efecto parece modesto. En esta etapa se considera una prueba numérica diferente de la diferencia entre los niveles de proteína diana en poblaciones LNCaP. La prueba se utilizó fue la estadística de Kolmogorov-Smirnov (KS o). La prueba compara dos poblaciones como contribuciones fraccionales a la cantidad total de antígeno. Resultados para niveles WWOX se muestran en la Figura 5A y para fosforilada WWOX, que está mediada por Src, como se muestra en la Figura 5B. La diferencia en las dos curvas muestra que las células LNCaP adyacentes a HUVECs tienen menos proteína WWOX que las células LNCaP que no son adyacentes a HUVECs en comparación en un listado clasificado
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La cantidad de proteína WWOX (en el panel A) y la proteína fosfo-WWOX (en el panel B), se muestran para las células LNCaP adyacentes a HUVECs (en rojo) y las células no adyacentes a HUVECs (en negro). Los puntos de datos representan (fosfolípidos) los niveles de proteína por célula como que contribuyen a la intensidad total de antígeno para todo el campo.
La fosforilación de WWOX por los resultados de Src en la unión a JNK1, p53 y p73 [31 ] - [33], y estas asociaciones se han asociado con una reducción de la apoptosis. La reducción de la apoptosis es un paso esencial en la tumorigénesis [2], y se espera que para las células cancerosas que encuentran los tipos de células no nativas durante la invasión y la metástasis, y de hecho esto está vinculado directamente a la función JNK1 [34]. Dado que los niveles WWOX y pWWOX se reducen en las células LNCaP adyacentes, hemos decidido examinar los niveles de c-Jun, JNK1 y p73 también. Resultados para estas proteínas se muestran en la Tabla 2. Las tres proteínas muestran grados variables de sensibilidad a la proximidad de HUVECs. c-Jun y exhibición JNK1 sólo efectos modestos, como se muestra por la mayoría de las pruebas que muestran los valores de p y altas proporciones cerca de 1. p73 muestra un efecto más fuerte, comparable a lo observado para WWOX y fosfo-WWOX en los ensayos anteriores.