Se han hecho
Extracto
Los grandes esfuerzos para desarrollar nuevos productos terapéuticos y eficaces contra el cáncer de páncreas para mejorar los resultados del tratamiento. factor relacionado ligando inductor de apoptosis (TRAIL) de necrosis tumoral es una citocina tal terapéutico con efectos muerte selectiva hacia las células malignas. Sin embargo, algunos cánceres pancreáticos humanos son intrínsecamente resistentes a la apoptosis o la terapia mediada por TRAIL. En este estudio, hemos demostrado que el inhibidor de la histona deacetilasa LBH589 puede sinergizar con TRAIL para aumentar la apoptosis en las células incluso resistente a TRAIL. LBH589 disminución de los niveles de c-FLIP en todas las líneas celulares de la prueba y los niveles de survivina en algunas de las líneas celulares ensayadas. Forzada expresión de c-FLIP ectópico, pero no survivin, abolió la inducción cooperativa de la apoptosis por la combinación de LBH589 y TRAIL, lo que indica que la regulación por disminución de c-FLIP juega un papel crítico en la sensibilización LBH589 de células de cáncer pancreático a Trail. Por otra parte, LBH589 disminución de la estabilidad c-FLIP y la presencia del inhibidor de proteasoma MG132 impedido c-FLIP de la reducción por LBH589. En consecuencia, se han detectado niveles de c-FLIP ubiqutinated aumenta en las células tratadas con LBH589. Por consiguiente, estos datos indican que LBH589 promueve ubiqutin degradación /mediada por proteasoma de c-FLIP, que conduce a la regulación por disminución de c-FLIP. Colectivamente, LBH589 induce la degradación de c-FLIP y, en consecuencia sensibiliza a las células de cáncer de páncreas a la apoptosis inducida por TRAIL, destacando un nuevo régimen terapéutico contra el cáncer de páncreas
Visto:. Kauh J, Ventilador S, Xia M, P Yue, Yang L, Khuri FR, et al. (2010) Degradación de c-FLIP media la sensibilización de las células del cáncer pancreático a la apoptosis inducida por TRAIL por el Inhibidor de histona deacetilasa LBH589. PLoS ONE 5 (4): e10376. doi: 10.1371 /journal.pone.0010376
Editor: Dong-Jin Yan, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 12 Marzo, 2010; Aceptado: April 7, 2010; Publicado: 28 de abril 2010
Derechos de Autor © 2010 Kauh et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el premio Georgia Cancer Coalition Distinguido cáncer Académico (a SY. S.) y el fondo de investigación del departamento (JK). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es uno de los cánceres más difíciles de tratar, aunque representa sólo el 3% de todos los cánceres. A pesar de múltiples ensayos clínicos con nuevos agentes quimioterapéuticos, durante los últimos 25 años la tasa de supervivencia a los 5 años del 5%, y la supervivencia media de 6 meses en gran medida se ha mantenido sin cambios. La supervivencia media es de aproximadamente 6 meses [1], [2]. Una razón para la pobre supervivencia de cáncer de páncreas es la insensibilidad a la mayoría de las terapias convencionales, incluyendo la quimioterapia y la radioterapia [3]. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevos y eficaces agentes terapéuticos o regímenes para el tratamiento de cáncer de páncreas.
La apoptosis es una parte esencial de mecanismos que mantienen la homeostasis del tejido normal [4]. La desregulación de los mecanismos de apoptosis y la evasión de la apoptosis es un mecanismo general en el cáncer. La mayoría de las quimioterapias actúan por la inducción de apoptosis. Por lo tanto, la evasión de la apoptosis es el principal responsable de la insuficiencia de las terapias actuales [2], [5]. Es bien sabido que las células pueden morir de apoptosis principalmente a través de la vía del receptor inducida por la muerte extrínseca y /o la vía intrínseca mitocondrias mediada [6]. La activación de la vía apoptótica mediada por receptor de muerte extrínseca implica la ligadura de un ligando de muerte (por ejemplo, factor de necrosis tumoral relacionada ligando inductor de apoptosis; TRAIL) con su receptor de la superficie celular correspondiente muerte (s) o agregación (por ejemplo trimerización) de la muerte receptores, lo que lleva a la formación de la muerte de inducción de complejo de señalización (DISC), seguido de la escisión de activación de la caspasa-8 en el disco. Debido a que la subasta sirve como sustrato de la caspasa-8, la activación de la apoptosis vía del receptor de muerte extrínseca, también activa la vía intrínseca de apoptosis [7].
El ligando TRAIL muerte ha surgido recientemente como agente terapéutico potencial de cáncer, ya que preferencialmente induce la apoptosis en células transformadas o malignas [8]. Actualmente TRAIL humano recombinante se está probando en ensayos clínicos fase I. Además, los anticuerpos agonísticos contra DR4 y DR5, que activan directamente la ruta apoptótica extrínseca, también se han probado en la fase I o II de ensayos clínicos [9]. Por lo tanto, el receptor de la muerte, en particular la apoptosis mediada por TRAIL receptor de muerte ha sido objeto de intensa investigación como una diana terapéutica del cáncer [10], [11]. Muchos estudios preclínicos han demostrado potencial terapéutico de la orientación del TRAIL /apoptosis mediada por el receptor de muerte en el cáncer de páncreas [12] - [20]. Sin embargo, un problema importante en este sentido es la resistencia intrínseca de ciertas células cancerosas incluyendo células de cáncer pancreático a los receptores inducida por TRAIL /muerte apoptosis [17], [18].
celular de proteínas FLICE inhibidora (c- FLIP), que inhibe la activación de la caspasa-8 mediante la prevención de reclutamiento de la caspasa-8 en un disco, es el inhibidor primario de TRAIL /muerte apoptosis receptor inducida por [21], [22]. Los niveles de c-FLIP, incluyendo tanto FLIP
L y FLIP
S están sujetos a regulación por la ubiquitina /proteasoma mediada por la degradación [23] - [25]. la expresión de c-FLIP elevada protege a las células de la muerte apoptosis mediada por el receptor, mientras que la regulación por disminución de c-FLIP por productos químicos o pequeños ARN de interferencia sensibiliza a las células a la apoptosis mediada por receptor de muerte [26]. La sobreexpresión de c-FLIP se ha sugerido que el mecanismo subyacente RUTA resistencia clave en el cáncer de páncreas [13], [17].
LBH589 (panobinostat) es una histona pan-histonas (HDAC) con anticanceroso prometedor actividad [27]. la actividad de agente único contra el cáncer de páncreas se ha demostrado en modelos experimentales preclínicos [28]. En este estudio, hemos puesto de manifiesto una nueva actividad de LBH589, que sensibiliza a las células de cáncer de páncreas a la apoptosis inducida por TRAIL. Por otra parte, hemos demostrado que LBH589 facilita ubiqutin /proteasoma mediada por la degradación de c-FLIP, dando lugar a aumento de la apoptosis inducida por TRAIL en el cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Reactivos
LBH589 fue proporcionada por Novartis (Basilea, Suiza). El TRAIL humano recombinante soluble se adquirió de PeproTech, Inc. (Rocky Hill, NJ). El inhibidor del proteasoma MG132 y de la cyclohexemide inhibidor de la síntesis de proteínas (CHX) se adquirieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). anticuerpo anti-DR5 policlonal de conejo se adquirió de ProSci Inc (Poway, CA). Ratón anticuerpo anti-DR4 monoclonal (B-N28) se adquirió de Diaclone (Stamford, CT). anticuerpo monoclonal de ratón anti-caspasa-3 fue adquirido de Imgenex (San Diego, CA). policlonal de conejo anti-XIAP, anti-caspasa-8, anti-MCL-1, y los anticuerpos anti-PARP y anticuerpo monoclonal de ratón anti-survivin se adquirieron de Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). anticuerpo anti ratón de Bcl-2 se adquirió de Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA). Rabbit anti-GAPDH anticuerpo policlonal y el anticuerpo monoclonal anti-Bax ratón se adquirieron de Trevigen (Gaithersburg, MD). anticuerpo monoclonal de ratón anti-β-actina fue adquirido de Sigma Chemical Co.
Líneas celulares y cultivo celular
líneas celulares de cáncer pancreático humano usados en este estudio fueron adquiridos de la American Type Culture Collection ( Manassas, VA). Para el establecimiento de líneas celulares de cáncer pancreático que expresan de forma estable ectópico c-FLIP o survivin, Panc-1 células fueron infectadas con lentivirus que albergan vectores de expresión lentiviral de FLIP
L y survivin, respectivamente, como se describe anteriormente [29], [30]. También infectados células con lentivirus que llevaban el vector de expresión Lac Z como control [29]. clones de células individuales resistentes a la blasticidina se expandieron y se sometieron a screening de la expresión de la proteína objetivo por transferencia de Western. Estas líneas celulares se cultivaron en medio DMSM que contiene suero bovino fetal al 5% a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 y 95% de aire.
Ensayo de Supervivencia Celular
las células se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos y se trataron al día siguiente con los agentes indicados. El número de células viables se determinaron usando el ensayo de sulforrodamina B (SRB), como se describe anteriormente [31]. índice de combinación para la interacción de drogas (por ejemplo, la sinergia) se calculó utilizando el software CompuSyn (ComboSyn, Inc .; Paramus, Nueva Jersey). La significación estadística de las diferencias entre los dos tratamientos se analizó con de Student no pareada de dos caras
t
pruebas mediante el uso de software Graphpad InStat 3 (GraphPad Software, San Diego, CA). Los resultados se consideraron estadísticamente significativas a
P
. & Lt; 0,05
Detección de Apoptosis
La apoptosis se evaluó mediante tinción con anexina V usando el kit de detección de apoptosis anexina V-PE compró de BD Biosciences (San Jose, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. También se detectó la activación de caspasa mediante transferencia Western (como se describe a continuación) como un indicador adicional de la apoptosis.
análisis de transferencia Western
se prepararon y analizaron por transferencia de Western como se describe anteriormente de proteínas de células enteras lisados [32], [33].
inmunoprecipitación para la detección de Ubiqutinated c-FLIP
Panc-1 /FLIP
L-5 células, que expresan de forma estable FLIP
L, fueron transfectadas con el plásmido HA-ubiquitina usando el reactivo de transfección FuGENE 6 (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de 24 h, las células se trataron con LBH589 o MG132 más LBH589 para 4 h y luego se lisaron para la inmunoprecipitación de Flag-FLIP
L usando el anticuerpo monoclonal Flag M2 (Sigma Chemicals) como se describe anteriormente [34] seguida de la detección de FLIP ubiquitinated
L con Western Blot utilizando anticuerpos anti-HA (Abgent; San Diego, CA):
Resultados
LBH589 sensibiliza a las células del cáncer pancreático a la apoptosis inducida por TRAIL
.
Se determinó primero la sensibilidad de líneas celulares de cáncer de páncreas utilizados en este estudio para TRAIL. Tal como se presenta en la Fig. 1A, cuatro líneas celulares de cáncer de páncreas mostraron sensibilidades diferenciales: MiaPaCa-2 y BxPC3 mostraron disminución dependiente de la dosis en la supervivencia celular tras el tratamiento TRAIL y por lo tanto eran sensibles a TRAIL, mientras que Panc-1 y Capan-2 fueron resistentes a TRAIL porque mostraban un mínimo respuesta a TRAIL en términos de disminución de la supervivencia celular. Cuando se combina con LBH589, se observaron efectos de destrucción celular mejoradas no sólo en las células sensibles a TRAIL (por ejemplo, CMPC-3), sino también en líneas celulares resistente a TRAIL (por ejemplo, Panc-1 y Capan-2) ya que la combinación de LBH589 y TRAIL eran mucho más que cualquier agente solo en la disminución de la supervivencia de las células de cáncer de páncreas (Fig. 1B). Los índices de combinación para LBH589 (por ejemplo, 12,5 nM) y TRAIL (3,125-26 ng /ml) combinación en las líneas celulares ensayadas fueron & lt; 0,5 (Fig. 1C), indicando que LBH589 y la combinación de TRAIL ejerce efectos sinérgicos sobre la disminución de la supervivencia celular de células de cáncer pancreático. Por otra parte, se han detectado directamente la apoptosis mediante la medición de las células V-anexina positivo y la escisión de la caspasa en las células expuestas a LBH589 solo, solo RUTA y su combinación. De acuerdo con los datos de supervivencia celular, la combinación de LBH589 y TRAIL era mucho más potente que cada agente sencillo solo en la inducción de la escisión de la caspasa-9, caspasa-8, caspasa-3 y PARP (Fig. 2A) y el aumento de anexina V-positivo células (es decir, las células apoptóticas) (Fig. 2B). Específicamente, LBH589 y TRAIL solo causó aproximadamente 18% y 21% de apoptosis, respectivamente; Sin embargo, la combinación de LBH589 y TRAIL indujo sobre 62% de apoptosis, que es obviamente mayor que el efecto aditivo. En conjunto, estos resultados indican que LBH589 sensibilizar a las células de cáncer de páncreas a la apoptosis inducida por TRAIL.
Un
, Las líneas celulares indicadas se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos y se trataron al día siguiente con las concentraciones indicadas de TRAIL durante 24 h. El número de células se estimaron utilizando el ensayo SRB. Los datos son la media de cuatro determinaciones repetidas; bares, ± desviaciones estándar. *,
P Hotel & lt; 0,01 compara con las células no tratadas.
B Opiniones, Las líneas celulares indicadas se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos se trataron con las concentraciones indicadas de TRAIL solo, LBH589 solo, o la respectiva combinación de LBH y TRAIL durante 24 h. El número de células se estimaron utilizando el ensayo SRB. Los datos son la media de cuatro determinaciones repetidas; bares, ± desviaciones estándar. En las células Panc-1 BxPC-3 y, cada combinación es significativamente más eficaz que cualquiera de TRAIL solo o LBH589 solo en la disminución de la supervivencia celular (
P
& lt; 0,05 o & lt; 0,001). En las células Capan-2, LBH589 a 50 nM en combinación con 12,5 ng ng /ml o 25 /ml es significativamente más eficaz que LBH589 o TRAIL solo en la disminución de la supervivencia celular (
P
& lt; 0,001). Así son los LBH589 a 25 nM o 50 nM combinado con RUTA (
P Hotel & lt; 0,05).
C
, combinaciones de índices (IC) se calcularon sobre la base de los datos presentados en la Fig. 1B utilizando el software CompuSyn.
Un
, Las líneas celulares indicadas fueron tratados con DMSO control, 50 nM LBH589 25 ng TRAIL /ml solo, o LBH589 además TRAIL. Después de 16 h, las células se sometieron a la preparación de lisados de células enteras de proteínas para la detección de la escisión de la caspasa mediante transferencia Western. Casp, caspasa; CF, escinde fragmento.
B
, las células Panc-1 se trataron con 25 ng /ml de TRAIL solo, 50 nM LBH589 solo o su combinación para 24 h. Las células se sometieron a continuación a medición de la apoptosis mediante tinción con anexina V. Las porcentaje de células positivas en la parte superior derecha e inferior derecha cuadrantes representan la población total de células apoptóticas.
LBH589 disminuye los niveles de c-FLIP y survivina en células de cáncer pancreático
Para entender los mecanismos por los cuales LBH589 sensibiliza líneas celulares de cáncer pancreático a la apoptosis inducida por TRAIL, se analizaron en primer lugar los efectos moduladores de LBH589 en c-FLIP, DR5, DR4 y TRAIL, que están directamente involucrados en la regulación de la TRAIL muerte apoptosis /mediada por receptores , en tres líneas celulares de cáncer de páncreas. Panc-1 y Capan-2 células tenían mayores niveles basales de c-FLIP (particularmente FLIP
L) que BxPC-3 células. El tratamiento de estas líneas celulares con LBH589 disminuyó los niveles de c-FLIP en todas las tres líneas celulares de una forma dependiente de la concentración (Fig. 3A). La reducción de c-FLIP se produjo a las 3 h, y se hizo aún más pronunciada a las 12 h después y, posteriormente, después del tratamiento LBH589 (Fig. 3B). LBH589 no alteró los niveles de TRAIL en cualquiera de las líneas celulares ensayadas (Fig. 3A) y sólo mínimamente aumento de la expresión de DR5 en una de las tres líneas celulares sometidas a prueba (es decir, BxPC-3) (Figs. 3A y 3B). Estos resultados sugieren claramente que donwregulation c-FLIP es un evento importante inducida por LBH589
.
Las líneas celulares dadas fueron tratados con diferentes concentraciones de LBH589 como se indica durante 12 h (
A
) o con 50 nM LBH589 durante los tiempos indicados (
B Opiniones). Después de los tratamientos, las líneas celulares fueron sometidos a preparación de lisados de células enteras de proteínas y Western blot para la detección posterior de las proteínas indicadas.
Además, también examinó los efectos moduladores de LBH589 en otras proteínas incluyendo survivin, XIAP, Bcl-2, MCL-1, y Bax, que regulan la apoptosis mediada por mitocondrias. LBH589 disminución de los niveles de survivina en Panc-1 y Capan-2 células, pero no BxPC-3 células (Fig. 3A). tiempo de análisis de los niveles de survivina en células Panc-1 demostró que la reducción de la survivina pronunciada se produjo a las 12 h post-tratamiento LBH589 (Fig. 3B). LBH589 no alteró los niveles de Bax y XIAP en estas líneas celulares; sin embargo, aumentó los niveles de MCL-2 en estas líneas celulares, así como los niveles de Bcl-2 en BxPC-3 células (Fig. 2A). En conjunto, estos resultados también sugieren que la reducción de la survivina también puede ser un evento importante inducida por LBH589.
Expresión forzada de ectópico c-FLIP, pero no survivina, protege las células de inducción de la apoptosis por la combinación de LBH569 y TRAIL
Tanto c-FLIP y survivina están involucrados en la regulación de la sensibilidad de las células TRAIL [35]. Para determinar la implicación de c-FLIP y la regulación a la baja de survivina en la sensibilización de las células del cáncer pancreático a la apoptosis inducida por TRAIL por LBH589, establecimos Panc-1 líneas celulares que expresan de forma estable ectópico FLP
L o survivina a través de un sistema de expresión lentivial y luego examinado sus respuestas a la combinación de LBH589 y TRAIL. La expresión de survivina ectópico o c-FLIP se asumió por transferencia Western tal como se presenta en la Fig. 4A. Lac Z es una proteína irrelevante y aquí se utilizó como control. Como se ha demostrado anteriormente, la combinación de LBH589 y TRAIL efectivamente disminuyó la supervivencia celular en Lac Z o líneas celulares que expresan survivina, pero no lo hizo en ambas líneas celulares que expresan FLIP ectópico
L (Fig. 4B), lo que indica la la expresión forzada de FLIPL ectópico, en lugar de survivina, confiere resistencia celular a la inducción de la apoptosis por aumentada LBH589 y la combinación de TRAIL. Mediante la detección de la apoptosis, se encontró que la combinación de LBH589 indujo fuertemente la escisión de la caspasa-8, caspasa-9, caspasa-3 y PARP en Panc 1-líneas celulares que expresan Lac Z o survivin, pero sólo mínimamente en FLIP
L expresando células Panc-1 (Fig. 5A). De acuerdo, la combinación de LBH589 y TRAIL causó aproximadamente 79% y 69% de la apoptosis en Panc-1 /lac Z-1 y Panc-1 células, respectivamente, pero sólo alrededor del 25% de la apoptosis en Panc-1/4 survivin- /FLIPL-5 células (Fig. 5B), lo que confirma, además, que la FLIP
L sobreexpresión confiere resistencia celular a la combinación de LBH589 y TRAIL. En conjunto, estos resultados demuestran que la regulación a la baja de c-FLIP juega un papel clave en la sensibilización mediada por LBH-589 de células de cáncer pancreático a la apoptosis inducida por TRAIL.
Un
, la expresión de survivina ectópico o c-FLIP en las diversas trasnfectants como se indica se detectó mediante transferencia de Western con survivin o anticuerpo c-FLIP.
B Opiniones, Los transfectantes dadas fueron sembradas en placas de 96 pocillos y se trataron con las concentraciones indicadas de LBH589 solo, 25 ng /ml de TRAIL solo, o una combinación individual de LBH589 con RUTA. Después de 24 h, las células se sometieron al ensayo de SRB para la medida de la supervivencia celular. Los datos son la media de cuatro determinaciones repetidas; barras; Desviaciones estándar ±. *,
P Hotel & lt; 0,0001 y #,
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con el tratamiento solo LBH589
Los transfectantes indicados fueron tratados sin y con 50 nM. LBH589 más 25 ng /ml de TRAIL (L /T) durante 16 h (
Un
) o 24 horas (
B Opiniones). Las células se recogieron a continuación para la preparación de lisados de células enteras de proteínas para la detección de caspasa y PARP escisión mediante Western Blot (
A
) o para la medición de la apoptosis mediante tinción con anexina V (
B
). Las porcentaje de células positivas en la parte superior derecha e inferior derecha cuadrantes representan la población total de células apoptóticas.
LBH589 Donwregulates c-FLIP mediante la promoción de Ubiqitin /proteasoma mediada por la degradación de
Dada la crítica papel de la regulación a la baja de c-FLIP en la mediación de la mejora de la apoptosis inducida por TRAIL por LBH589 como se ha demostrado anteriormente, se trata con mayor detalle cómo LBH589 disminución de los niveles de c-FLIP. Debido a que se sabe que las proteínas c-FLIP ser regulada por la ubiquitina /proteasoma mediada por la degradación [23], [25], que luego determina si la regulación a la baja observada de c-FLIP por LBH589 estaría mediado a través de este proceso. De este modo, se analizó en primer lugar si LBH589 promueve la degradación de c-FLIP. Con este fin, se trataron Panc-1cells con DMSO o LBH589 durante 4 horas y después se elimina por lavado el fármaco seguido de recarga de las células con medio fresco que contiene la proteína de CHX inhibidor de la síntesis. En los tiempos indicados publicar CHX, se recogieron las células para el Western Blot para analizar la velocidad de degradación de c-FLIP. Tal como se presenta en la Fig. 6A, la tasa de reducción o degradación de la FLIP
L en las células tratadas con LBH589 era aparentemente más rápido que la de las células de control tratadas con DMSO, lo que indica que LBH589 de hecho facilita la degradación de c-FLIP. A continuación, las células tratadas con LBH589 en ausencia y en presencia del inhibidor de proteasoma MG132 y modulación c-FLIP continuación, en comparación en estas condiciones. Tal como se presenta en la Fig. 6B, LBH589 disminución de los niveles de c-FLIP en ausencia de MG132, pero no en presencia de MG132, lo que sugiere que LBH589 inducida por la degradación de c-FLIP es proteasoma dependiente. Por inmunoprecipitación transferencia /Western, también detectaron los niveles más altos de la FLIP ubiqutinated
L en las células tratadas con LBH589 más MG132 en comparación con las células expuestas a LBH589 solo o MG132 sola (Fig. 6C), lo que indica que el HNK aumenta ubiquitinación c-FLIP . Tomados en conjunto, llegamos a la conclusión de que LBH589 induce la ubiquitina /degradación de c-FLIP mediada por el proteosoma, que conduce a la regulación por disminución de c-FLIP en células de cáncer de páncreas humano.
Un
, las células Panc-1 eran tratados con DMSO o 50 nM LBH589 durante 4 h. Después, las células se lavaron con PBS 3 veces y volvieron a alimentar con medio fresco que contiene 10 mg /ml CHX. En los tiempos indicados poste CHX, se recogieron las células para la preparación de lisados de células enteras de proteínas y análisis de transferencia de Western posterior. Los niveles de proteína se cuantificaron con el software NIH Image J (Bethesda, MA) y se normalizaron a GAPGH. Los resultados se representaron gráficamente como los niveles de c-FLIP relativa en comparación con aquellos en el momento 0 del tratamiento CHX (panel inferior).
B
, las células Panc-1 se pretrataron con 20 M MG132 durante 30 minutos antes de la adición de 50 nM LBH589. Después de co-tratamiento durante 4 h, se recogieron las células para la preparación de lisados de células enteras de proteínas y análisis de transferencia de Western posterior.
C
, Panc-1 /FLIP
células L-5, que expresan de forma estable ectópico bandera-FLIP
L se transfectaron con el plásmido HA-ubiquitina utilizando Fugene 6 reactivo de transfección durante 24 h. Después las células se trataron previamente con 20 mM MG132 durante 30 minutos y después se co-tratadas con 50 nM LBH589 durante 4 h. De células enteras lisados de proteínas se prepararon entonces para la inmunoprecipitación (IP) usando anticuerpo anti-Flag seguida de Western Blot (WB) utilizando el anticuerpo anti-HA para la detección de la FLIP ubiquitinated
L (Ub-FLIP
L) y anti -flag anticuerpo para la detección de la FLIP ectópico
L.
Discusión
tumores de cáncer de páncreas humanos o líneas celulares exhiben respuestas heterogéneas a TRAIL. Algunos de estos tumores o líneas celulares son intrínsecamente sensibles a la apoptosis inducida por TRAIL [17], [18]. En este estudio, hemos presentado un nuevo hallazgo de que el inhibidor de la histona deacetilasa LBH589 aumenta efectivamente la apoptosis inducida por TRAIL en células de cáncer de páncreas humano, incluyendo aquellos que son resistentes a la apoptosis inducida por TRAIL. Teniendo en cuenta que LBH589 muestra actividad contra el cáncer en modelos de cáncer de páncreas preclínicos [28], así que el TRAIL-selectiva del tumor es una proteína terapéutica potencial de cáncer y se está probando en ensayos clínicos fase I, nuestros resultados justifican una evaluación adicional de la combinación de LBH589 y TRAIL como un potencial de regímenes terapéuticos contra el cáncer de páncreas en modelos animales y en ensayos clínicos
.
Tanto la survivina y XIAP se sugieren para regular la apoptosis mediada por TRAIL [12], [36], [37]. Se informaron algunos inhibidores de HDAC, tales como butirato de sodio y LAQ824 para aumentar la apoptosis inducida por TRAIL implica donwregualtion de survivina y XIAP [38], [39]. Un estudio reciente ha sugerido que LBH589 potencia la apoptosis inducida por TRAIL través de la regulación negativa de XIAP en células de mesotelioma [40]. En nuestro estudio, encontramos que LBH589 disminución de los niveles de survivina en dos (es decir, Panc-1 y Capan-2) de tres líneas celulares de cáncer de páncreas probadas, pero, obviamente, no altera los niveles de XIAP (Fig. 3). Además, la expresión forzada de survivina ectópico no conferir resistencia a LBH589 /apoptosis inducida por TRAIL (. Figs 4 y 5). Por lo tanto, la survivina y XIAP son poco probable que participe en la regulación de la sensibilización mediada LBH589 de la apoptosis inducida por TRAIL en células de cáncer de páncreas.
Bcl-2 miembros de la familia, tales como Bcl-2 y MCL-1 también han sido se sugiere en la regulación de la apoptosis inducida por TRAIL [14], [35]. Otros inhibidores de HDAC potenciar la apoptosis inducida por TRAIL en diferentes células de cáncer que implican la modulación de miembros de la familia Bcl-2, tales como la regulación por disminución de Bcl-2 y Bcl-X
L y la regulación positiva de Bax y Bim [39], [41] - [ ,,,0],44]. En nuestro estudio, LBH589 no cambió los niveles de Bax. Inesperadamente, LBH589 incrementó los niveles de Bcl-2 y MCL-1 (Fig. 3). Por lo tanto, la modulación de estas proteínas es improbable que se asocie con la potenciación LBH589 mediada de la apoptosis inducida por TRAIL en estas líneas celulares; más bien, el aumento de Bcl-2 y MCL-1 puede contrarrestar el efecto de LBH589 en la sensibilización de células de cáncer pancreático a la apoptosis inducida por TRAIL. Por lo tanto, una mayor inclusión de un inhibidor de Bcl-2 o MCL-1 de este régimen puede resultar en una eficacia contra el cáncer aún más eficaz que la combinación de LBH589 y TRAIL y debe estudiarse más a fondo.
inducción DR5 y c-FLIP regulación a la baja son importantes mecanismos subyacentes de aumento o sensibilización de la apoptosis inducida por TRAIL [45] mediada por fármacos. En nuestro estudio, encontramos que LBH589 o bien no o sólo débilmente aumento de la expresión de DR5 en líneas celulares de cáncer de páncreas (Fig. 3), lo que sugiere que la modulación DR5 tiene un papel limitado en la sensibilización LBH589 mediada de la apoptosis inducida por TRAIL en estas células. los niveles de c-FLIP se han sugerido para ser asociado con la sensibilidad de las células de cáncer de páncreas a la apoptosis inducida por TRAIL; Específicamente, se detectaron niveles más altos de c-FLIP en las líneas celulares de cáncer de páncreas resistente a TRAIL en comparación con las células sensibles a TRAIL [17]. La inhibición de c-FLIP con un pequeño ARN de interferencia o una molécula pequeña sensibiliza a las células de cáncer de páncreas a inducida por TRAIL apoptosis [13], [17]. Además, otros inhibidores de HDAC tales como LAQ824, MS-275, FR901228, ácido valproico y droxinostat se ha demostrado que regular a la baja los niveles de c-FLIP y mejorar la muerte del receptor inducida por apoptosis [46] - [52]. En nuestro estudio, también se encontró que las líneas celulares resistentes a TRAIL Panc-1 y Capan-2 tenían niveles basales más elevados de c-FLIP que la línea de células sensibles a TRAIL (BxPC-3) (Fig. 3A). Al igual que otros inhibidores de HDAC, LBH589 disminuyó líneas de células c-FLIP en estas tres líneas celulares de la prueba; esta regulación a la baja de c-FLIP es un evento rápido porque se ha detectado la reducción de c-FLIP incluso a las 3 h de tratamiento post LBH589 (Fig. 3). Es importante destacar que, la expresión de c-FLIP ectópico forzada (es decir, FLIP
L) abolió la capacidad de LBH589 para mejorar la apoptosis inducida por TRAIL (. Figs 4 y 5). En conjunto, estos resultados indican que la regulación a la baja de c-FLIP es crítica para la sensibilización LBH589 mediada por células de cáncer pancreático a la apoptosis inducida por TRAIL
.
c-FLIP se sabe que está regulada por la ubiquitina /proteasoma mediada por la degradación [ ,,,0],23], [24]. Estudios anteriores han demostrado que la regulación a la baja c-FLIP inducida por ciertos inhibidores de HDAC se produce a nivel de ARNm [39], [51]. Como inhibidores de HDAC regulan negativamente los niveles de c-FLIP no ha sido completamente dilucidado. En nuestro estudio, encontramos que LBH589 facilita la degradación de c-FLIP como se demuestra en el ensayo de CHX persecución. La presencia del inhibidor del proteasoma MG132 impedido c-FLIP de la reducción inducida por LBH589. Por otra parte, LBH589 incrementó los niveles de ubiquitinada c-FLIP (Fig. 6). Por lo tanto, estos resultados indican que LBH589 facilita ubqitin /degradación de c-FLIP proteasoma mediada, lo que resulta en la regulación por disminución de c-FLIP. A lo mejor de nuestro conocimiento, el hallazgo sobre la degradación de c-FLIP o regulación a la baja por LBH589 es novedosa y de nuevas investigaciones sobre cómo la inhibición de la histona deacetilasa conduce a la degradación de c-FLIP.
Las concentraciones plasmáticas máximas de LBH589 en pacientes humanos con cáncer van de 200 nM a 1.300 nM en función de las dosis probadas [53]. Las concentraciones de LBH589 utilizados en nuestro estudio que regulan negativamente c-FLIP y potenciar la apoptosis inducida por TRAIL son entre 12,5 nM y 100 nM y por lo tanto dentro del rango clínicamente alcanzables. Por lo tanto, se justifica el futuro de ensayo clínico de la combinación.
Reconocimientos
F.R. Khuri y S-Y. Sun son Georgia Cancer Coalition Distinguido cáncer estudiosos.