Extracto
Antecedentes
rango gliomas malignos entre los cánceres más letales. Los gliomas muestran una heterogeneidad celular llamativa con una jerarquía de estados de diferenciación. Estudios recientes apoyan la existencia de células madre de cáncer en gliomas que son funcionalmente definidos por su capacidad para extensa auto-renovación y formación de tumores secundarios que phenocopy los tumores originales. A medida que la oncoproteína c-Myc ha reconocido papel en la biología de células madre normales, la hipótesis de que c-Myc puede contribuir a la biología de células madre del cáncer ya que estas células comparten características con las células madre normales.
Metodología /Principales conclusiones
sobre la base de los métodos anteriores que nosotros y otros hemos empleado, las poblaciones de células tumorales fueron enriquecido o empobrecido para las células madre del cáncer utilizando el marcador de células madre CD133 (Prominin-1). Nos caracteriza la expresión de c-Myc en las poblaciones de células tumorales coincidentes por PCR en tiempo real, inmunotransferencia, inmunofluorescencia y citometría de flujo. Aquí mostramos que c-Myc es altamente expresado en las células madre del cáncer de glioma relación con las células de glioma no madre. Para interrogar a la significación de la expresión de c-Myc en las células madre del cáncer de glioma, nos centramos en su expresión usando lentivirally transducidas corto horquilla RNA (shRNA). Desmontables de c-Myc en las células madre del cáncer de glioma redujo la proliferación con la detención del ciclo celular concomitante en el G
0 /G
1 y la fase de aumento de la apoptosis. células de glioma madre no muestran la dependencia limitada sobre la expresión de c-Myc para la supervivencia y la proliferación. Además, las células madre del cáncer de glioma con disminución de los niveles de c-Myc no lograron formar neuroesferas
in vitro
o tumores cuando xwnotransplantado en los cerebros de los ratones inmunodeprimidos.
Conclusiones /Importancia
estos resultados apoyan un papel central de c-Myc en la regulación de la proliferación y supervivencia de células madre de cáncer de glioma. Dirigidas a las vías celulares núcleo madre pueden ofrecer mejores enfoques terapéuticos para el cáncer avanzado
Visto:. Wang J, Wang H, Li Z, Q Wu, Lathia JD, McLendon RE, et al. (2008) c-Myc se requiere para el mantenimiento de las células madre del cáncer de glioma. PLoS ONE 3 (11): e3769. doi: 10.1371 /journal.pone.0003769
Editor: Juha Klefstrom, Universidad de Helsinki, Finlandia
Recibido: 11 Julio, 2008; Aceptado: 2 de noviembre de 2008; Publicado: noviembre 20, 2008
Derechos de Autor © 2008 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Jialiang Wang es un receptor de la Asociación Americana del tumor cerebral básica beca de investigación. Otro tipo de apoyo financiero fue proporcionado por la Fundación del tumor encefálico infantil, la Fundación del tumor cerebral pediátrico de los Estados Unidos, acelerar el cáncer de cerebro de la curación, Alexander y Margaret Stewart Trust, Sociedad de Tumores Cerebrales, Fundación Goldhirsh, Iniciativa de Duke Centro Integral del Cáncer de Células Madre Grant (JR ), NIH subvenciones NS047409, NS054276, y CA116659 (JR). J. R. es un investigador clínico Damon Runyon-Lilly con el apoyo de la Fundación de Investigación del Cáncer Damon Runyon y una Fundación Sidney Kimmel para la Investigación del Cáncer Académico. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El modelo de célula madre del cáncer emergente sugiere que los tumores se organizan en una jerarquía con una subpoblación de células madre del cáncer, responsables del mantenimiento y progresión del tumor. Las células madre del cáncer son altamente tumorigénicas y phenocopy los tumores originales en modelos de roedores de xenoinjertos. El agotamiento de la población de células madre de cáncer afecta en gran medida el potencial de iniciar la formación de tumor de xenoinjerto de los tumores a granel [1], [2]. La población de células madre de cáncer también contribuye a la angiogénesis de tumores sólidos [3], metástasis [4], y la resistencia a la quimioterapia y la radioterapia [3], [5], [6], [7], [8], [9]. Si bien este modelo ha sido validado en una lista creciente de hematopoyético y tumores sólidos, las vías de señalización moleculares que orquestan la biología de las células madre del cáncer aún no se han dilucidado.
La oncoproteína c-Myc ha sido ampliamente estudiado por su papel decisivo papel en la proliferación y el crecimiento de las células normales y neoplásicas. Desregulado c-Myc se encuentra en diversos tumores humanos y con frecuencia se asocia con enfermedad maligna avanzada y mal pronóstico [10]. Como c-Myc ha sido recientemente reconocido como un importante regulador de la biología de células madre, puede servir como un enlace de conexión malignidad y "stemness" [11]. En las células normales, ya sea o transformadas, c-Myc solo se activa un módulo transcripcional de células madre como embrionarias, que firmemente se correlaciona con la metástasis tumoral y la mortalidad [12]. Ectópico expresión de c-Myc en queratinocitos humanos transformados aumenta dramáticamente la fracción de células madre de cáncer y aumenta la tumorigenicidad [12]. Introducción de c-Myc con otros factores de transcripción (incluyendo Oct3 /4, Sox2 y Klf4) genera células madre pluripotentes inducidas (iPS) a partir de células diferenciadas [13]. Excluyendo c-Myc de esta combinación sin eliminar endógeno expresión de c-Myc, reduce drásticamente la eficiencia de la producción de células iPS [13], [14], [15], [16]. Mientras que todos estos datos sugieren un papel de c-Myc en el mantenimiento de células madre, también se han descrito otras funciones de c-Myc en la regulación de la biología de células madre. knockout condicional de c-Myc en médula ósea de ratón no impide la proliferación o la auto-renovación de las células madre hematopoyéticas [17]. Más bien resulta en la acumulación de células madre hematopoyéticas en la médula ósea, lo que sugiere que c-Myc controla específicamente la interacción entre las células madre hematopoyéticas y sus nichos. Además, la sobre-expresión de la proteína de fusión del receptor c-Myc-estrógeno en las células madre epidérmicas humanas impulsa la diferenciación en lugar de la proliferación [18], [19].
Debido a las funciones reconocidas de c-Myc en tanto normales biología celular y los tumores malignos madre neuronales, se investigó el papel de c-Myc en las células madre del cáncer de glioma humano. Los gliomas son el tipo de tumor intrínseca primario más frecuente del sistema nervioso central. gliomas de alto grado (grado Organización Mundial de la Salud III y IV) se encuentran entre los tumores malignos humanos más letales [20]. En glioma, la expresión de c-Myc se correlaciona con el grado de malignidad [21]. La expresión de c-Myc impulsado por el -promoter proteína ácida fibrilar glial (GFAP) en el desarrollo de astroglia de ratón induce tumores que se asemejan a glioblastoma multiforme humano [22]. En este modelo de ratón, la masa tumoral contiene rápido subpoblación divisoria que expresan células tumorales relativamente quiescentes que carecen de c-Myc expresión [22] c-Myc y. Hemos determinado ahora que las células madre de cáncer de glioma expresan mayores niveles de c-Myc relación con las células tumorales no emparejados madre y la actividad de c-Myc se requiere para la proliferación, crecimiento y supervivencia de las células madre de cáncer de glioma. La pérdida de c-Myc abolió la formación de xenoinjertos de células madre del cáncer de glioma, lo que subraya un papel clave de c-Myc en el cáncer de glioma mantenimiento de células madre.
Resultados
células madre cancerosas del glioma expresan altos niveles de c-Myc
Para investigar las funciones biológicas de c-Myc en la regulación de las células madre del cáncer de glioma, primero se determinó la expresión de c-Myc en estas células. cultivos a corto plazo enriquecido o empobrecido para las células madre del cáncer se obtuvieron a partir de muestras de tumores cerebrales humanos utilizando la selección de CD133 y caracterizados como hemos demostrado anteriormente [9]. Quantitative PCR en tiempo real reveló que las células de glioma CD133 + expresaron niveles más altos de ARNm de c-Myc que las células de glioma CD133- emparejados (Figura 1A). Los niveles de mRNA diferencial traducen en mayores niveles de proteína c-myc en células de glioma CD133 + que las células CD133- emparejados (Figura 1B). De acuerdo con informes anteriores [23], [24], las fracciones enriquecidas en células madre cancerosas también expresaron altos niveles de Olig2, un marcador de células progenitoras multipotentes neurales adultas (Figura 1B). Para medir directamente la expresión de c-Myc en tumores cerebrales humanos, se evaluó adicionalmente la expresión de c-Myc mediante citometría de flujo en ambas fracciones CD133 + y CD133- de células de glioma agudamente aisladas a partir de muestras de biopsia quirúrgica humanos sin
in vitro
de cultivo (Figura 1C). Aproximadamente la mitad de las células CD133 + eran altos en la expresión de c-Myc, mientras que casi el 90% de células CD133- expresan niveles bajos de c-Myc (Figura 1D). Además, examinó la expresión de c-Myc en las células madre del cáncer de glioma usando secciones generados a partir de muestras quirúrgicas de glioma humano de forma aguda congelados. Debido a que co-tinción con CD133 no era compatible con el método de recuperación de antígeno requerida para la tinción de c-Myc, que co-manchados de c-Myc con otro marcador de células madre neurales nestina. Mayor que 90% de las células de glioma positivo Nestin fueron también c-Myc positivo (Figura 1E). Estos datos sugieren que el c-Myc es altamente expresado en las células madre del cáncer de glioma.
Se aislaron células (A) y CD133 + CD133- de glioma especímenes de biopsia quirúrgica a pases de corto plazo en ratones inmunodeficientes y brevemente cultivadas. ARN total fue aislado de ambos CD133- y las células CD133 +. Se preparó ADNc por transcripción inversa. La expresión de c-Myc se determinó a continuación por cuantitativa en tiempo real PCR y normalizado a ß-actina y HPRT1. los niveles de ARNm relativos de c-myc en células CD133- se les asignó un valor de 1. Los datos se representan como media ± S.E.M. en este y en todos los gráficos posteriores (#: p & lt; 0,001). (B) Total de los lisados celulares se resolvieron mediante SDS-PAGE. Los niveles de proteína de c-Myc y Olig2 se determinaron por inmunotransferencia. Actina se borró como el control de carga. Se aislaron células de glioma (C) directamente a partir de muestras de biopsia quirúrgica humanos, se fijaron en paraformaldehído al 4% después de la disociación, marcado con anti-CD133-APC y anti-c-Myc-FITC, y se sometieron a análisis FACS. se demostró (D) Porcentaje de células que expresan altos niveles de c-Myc dentro de ya sea la fracción CD133- o la fracción CD133 + (#: p & lt; 0,001). (E) Las secciones de muestras de biopsia quirúrgica de glioma humano recién congelados se fijaron y tiñeron para co-c-Myc (verde) y nestina (rojo). Los núcleos se counterstained con Hoechst 33342. Las imágenes representativas (630 ×) se demostraron.
c-Myc regula la progresión y la proliferación de las células madre del cáncer de glioma ciclo celular
c-Myc desempeña una papel clave en la regulación de la proliferación celular mediante el control de la expresión de proteínas del ciclo celular. Para interrogar el papel de c-Myc en el ciclo celular de las células madre de cáncer glioma, nos centramos en la expresión de c-Myc por la infección con lentivirus que expresan shRNA específico para c-Myc. Dos shRNAs diferentes disminuyeron de manera eficiente la expresión de c-Myc tanto en las células de glioma CD133- y CD133 + como se muestra por cuantitativa en tiempo real PCR e inmunotransferencia (Figura 2A y 2B). Resultados similares fueron encontrados en otra muestra del tumor (T4597, los datos no presentados). El agotamiento de c-Myc redujo significativamente la población de células en fase S con el aumento concomitante de la G
0 /G población de células
1 en las células CD133 + (p & lt; 0,001, Figura 3). En contraste, las células CD133- muestran una menor tasa de proliferación con una población más pequeña de fase S que las células CD133 + emparejados (Figura 3 y datos no mostrados), y la progresión del ciclo celular en las células CD133- no fue significativamente alterada por desmontables de c-Myc . La regulación del ciclo celular por c-Myc es mediada comúnmente a través de la regulación transcripcional de las ciclinas y los inhibidores de quinasas dependientes de ciclina, incluyendo ciclinas D
1, D
2, y E y p21
WAF1 /CIP1 [26], [27] (http://www.myc-cancer-gene.org). Atenuando la expresión de c-Myc reduce específicamente la ciclina D niveles
1 de proteínas, pero no las ciclinas D
2 o E, en las células CD133 + (Figura 2B). Además, p21
WAF1 /CIP1 los niveles de proteína se upregulated en las células madre del cáncer con reducción de c-Myc, mientras que p53 niveles fueron sólo moderadamente alterada (Figura 2B). Cuantitativa en tiempo real PCR mostró un patrón similar de la ciclina D
1 y p21
regulación WAF1 /CIP1 en los niveles de ARNm de c-Myc en CD133 + células, lo que sugiere c-Myc regula estos dos genes a nivel de la transcripción. En marcado contraste, la ciclina D
1 y p21
WAF1 /CIP1 fueron mínimamente alterada por derribar c-Myc, ya sea en el nivel de proteínas en las células CD133- ARNm o. En particular, la ciclina D basal
1 los niveles fueron más altos en las células CD133 + que las células CD133- coincidentes, mientras que la ciclina D
2 y los niveles de ciclina E eran más altas en las células CD133-, lo que sugiere que la ciclina D
1, pero no ciclinas D
2 o E, es fundamental para el G
1 /S transición en las células de glioma CD133 +. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que c-Myc regula la progresión del ciclo celular en las células madre de cáncer de glioma, al menos parcialmente, a través de control de la expresión de la ciclina D
1 y p21
WAF1 /CIP1.
( pasaje temprana (& lt a); células P5) de glioblastoma T3359 CD133- o CD133 + se infectaron por la expresión de dirección lentivirus de o bien no la orientación shRNA (NT) o c-Myc shRNAs específico (sh-1 y SH-2). Los niveles de ARNm de c-Myc, p21
WAF1 /CIP1, ciclina D
1 (cycD1) y ciclina D
2 (cycD2) se determinaron por cuantitativa en tiempo real PCR 3 días después de la infección. (B) Los niveles de proteína de c-Myc, p53, ciclina D
1, ciclina D
2, ciclina E y p21
WAF1 /CIP1 se determinó por inmunotransferencia.
pasaje temprana (& lt; P5) (A, B) células de glioblastoma T3359 CD133- o CD133 + se infectaron por la expresión de dirección lentivirus de o bien no la orientación shRNA (NT) o c-Myc shRNAs específico (sh-1 y SH-2). Tres días después de la infección, las células fueron fijadas en etanol al 75% y se marcaron con 10 mg /ml de yoduro de propidio. la distribución del ciclo celular se determinó por citometría de flujo. (A) Los datos se generaron a partir de tres experimentos independientes. *, P & lt; 0,05; #, P & lt; 0,001 con una sola vía de comparación ANOVA de los grupos de control a los correspondientes grupos desmontables c-Myc. Se presentan gráficos (B) Representitive FACS. M1-sub G
0 fase; M2-G
0 /G
1 fase; fase M3-S; M4-G2 /M fase.
informes previos han demostrado que las células madre tumorales cerebrales aisladas a partir de muestras de biopsias quirúrgicas humanos eran activamente proliferativa
in vitro
[28], [29], pero el número de células tumorales CD133- emparejados apenas aumentaron después de una semana de cultivo. Nuestros datos que la relativamente alta expresión de c-Myc en las células madre de cáncer de glioma es esencial para su regulación del ciclo celular sugieren que el crecimiento de estas células también puede requerir la actividad de c-Myc. Como se ha demostrado mediante ensayos de curva de crecimiento, el número total de CD133 de control + células aumentó aproximadamente seis o siete veces más de cinco días, mientras que las células CD133 + empobrecido de c-Myc no aumentó o disminuyó en número (Figura 4). Por el contrario, el crecimiento de la población CD133- fue atenuada sólo moderadamente con c-Myc desmontables (Figura 4). Estos resultados sugieren que c-Myc contribuye preferentemente a un crecimiento sostenido de las células iniciadoras de tumores.
(A) T3359, (B) T3832, y (C) T4597 CD133- y se aislaron y se infectaron como se describe células CD133 +. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos por triplicado a 5.000 células por pocillo para CD133- células o 1000 células por pocillo para las células CD133 +. el número de células viables totales se determinaron luego por la célula CellTiter-Glo luminiscentes Viabilidad de ensayo (Promega) al día. *, P & lt; 0,05; #, P & lt;. 0.001 con una sola vía de comparación ANOVA de los grupos de control a los correspondientes grupos desmontables c-myc en el mismo día
Pérdida de c-Myc induce la apoptosis en las células madre de cáncer de glioma
c-Myc regula no sólo la proliferación celular, sino también la supervivencia celular. En concordancia con un papel en la supervivencia, se observó una acumulación de células muertas en la fracción CD133 + agotado de la expresión de c-Myc durante los experimentos de curva de crecimiento que no estaba presente en los controles (datos no mostrados). Por el contrario, las indicaciones de la muerte celular estaban limitados en células CD133- coincidentes, independientemente del estado de c-Myc, lo que sugiere que la pérdida de c-Myc podría inducir específicamente la apoptosis en las células CD133 +. El papel de c-Myc en la regulación de la apoptosis sigue siendo controvertido. Los informes anteriores han demostrado que c-Myc promueve la apoptosis en líneas celulares de cáncer y varios tipos de células normales, mientras que la regulación por disminución de c-Myc también conduce a la apoptosis en ciertas circunstancias [30], [31], [32], [33]. Para distinguir el papel anti-apoptótica o pro-apoptótica de c-Myc en las células madre del cáncer de glioma, cuantificamos las poblaciones de células apoptóticas siguientes desmontables de c-Myc. Anexina V tinción reveló que el agotamiento de la apoptosis inducida por c-Myc en células de glioma CD133 +, mientras que los CD133 Control + células contenían una población apoptótica mínima (Figura 5A, C). En contraste, la población CD133- sólo tenía la tinción de fondo de Anexina V, independientemente de los niveles de c-Myc. De acuerdo con estos datos, la actividad combinada de la caspasa 3/7 fue elevado en las células CD133 + siguiente c-Myc caída, pero no en células CD133- emparejados (Figura 5B, D). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que el c-Myc es un factor de supervivencia para las células madre del cáncer de glioma.
(A, B) y las células T3359 (C, D) T4597 CD133- y CD133 + fueron aisladas e infectadas como se ha descrito . (A, C) Seis días después de la infección, las células se tripsinizaron y se cuantificó la apoptosis utilizando el kit de V-FITC de detección de apoptosis con anexina (Calbiochem). El porcentaje de células positivas FITC se determinó mediante análisis FACS, y las células muertas se excluyeron por tinción con yoduro de propidio. (B, D) Estas células también se sembraron en placas de 96 pocillos a 5000 células por pocillo para CD133- células y 1000 células por pocillo para las células CD133 + después de la infección y selección. Seis días después de la infección, las actividades combinadas de la caspasa 3 y caspasa 7 se determinaron mediante la caspasa 3/7 luminescencia ensayo kit (Promega), y se normalizaron por el número de células viables determinadas por los ensayos CellTiter-Glo como se describe en la figura 4. * , p & lt;. 0.05 con una sola vía de comparación ANOVA de los grupos de control a los correspondientes grupos desmontables c-Myc
Pérdida de c-Myc perjudica la formación de neuroesferas por las células madre de cáncer de glioma
Intercambio de ciertas características clave de las células madre normales, las células madre del cáncer son capaces de auto-renovación, lo que permite un mantenimiento sostenido de esta subpoblación y la expansión de todo el tumor. ensayo de formación de neuroesferas de serie ha sido utilizado como un sustituto de la capacidad de auto-renovación de las células madre neuronales [34], y recientemente se ha empleado en las células madre tumorales del cerebro [9], [28]. En ensayos de formación de neuroesferas primarias, aproximadamente el 15% de CD133 de control + células neuroesferas formadas, mientras que muy pocas esferas se formaron por las células agotadas de c-Myc (Figura 6A). Neuroesferas desarrollan en 100% de los pozos en el grupo de control cuando se colocan en placas a una densidad de 100 células /pocillo y en el 80-85% pozos cuando se siembran en 10 células /pocillo (Figura 6B). Por el contrario, las neuroesferas se formaron por las células agotadas de la expresión de c-Myc en sólo el 10% (shRNA-1) o 30% (shRNA-2) de los pozos cuando se siembran a una densidad de 100 células /pocillo, mientras que no hay esferas se encontraron cuando estas células se sembraron a 10 células /pocillo. De nota, neuroesferas formados por células con expresión reducida c-Myc fueron notablemente más pequeña que las esferas formadas por las células de control (Figura 6C) y simplemente cumplen los criterios mínimos para ser marcados en nuestros experimentos. La falta de neuroesferas formadas por las células madre del cáncer de glioma agotados de c-Myc sugiere deteriora la auto-renovación. Sin embargo, la evaluación de la formación de neuroesferas secundaria estaba vedado a muy pocas esferas se genera en los grupos de derribo en el ensayo primario y las neuroesferas tenido viabilidad limitada. Estos estudios por lo tanto no podían definitivamente determinar si se requiere la expresión de c-Myc para la auto-renovación de las células madre de cáncer de glioma. Sin embargo, se espera que la auto-renovación de las células madre de cáncer de glioma es inhibida por desmontables de c-Myc, basado en nuestras observaciones de que las células madre de cáncer de glioma no pudieron proliferar y se sometieron a apoptosis en desmontables de c-Myc.
(A) T3359 células CD133 + se infectaron con lentivirus y seleccionados como se describe. Las células se sembraron a 100 o 10 células por pocillo en placas de 24 pocillos en presencia de 1 mg /ml de puromicina. Ocho pocillos se sembraron para cada grupo. El número de neuroesferas en cada pocillo se determinó en siete días. Esferas que contenían más de 20 células se anotó. se cuantificó (B) Porcentaje de pocillos sin neuroesferas formadas. #, P & lt; 0,001 con una sola vía de comparación ANOVA de los grupos de control a los correspondientes grupos desmontables c-Myc. (C) fotografías representativas de neuroesferas formadas por células que expresan no director shRNA o c-Myc específicos shRNA (barras = 50 micras). (D, E) Resultados similares se demostró en células CD133 + T4302.
Desmontables de c-Myc inhibe el potencial tumorigénico de las células madre del cáncer de glioma
Sobre la base de la exigencia de c- myc actividad para la progresión del ciclo celular, el crecimiento y la supervivencia de las células de glioma CD133 + en cultivo, se analizó el papel de la expresión de c-myc en su potencial tumorigénico. células de glioma CD133 + fueron infectadas con lentivirus no director de control o lentivirus que expresan c-Myc shRNA. Después de la selección de puromicina, se inyectaron 5000 células de cada grupo en el cerebro de ratón desnudo por cuadruplicado. 100% de los ratones portadores de células de control se desarrollaron rápidamente signos neurológicos y mostradas grandes tumores en la histopatología compuestos por células pleomórficas que ofrecen alta relación entre núcleo y citoplásmicos, nucleolos prominentes con citoplasma mínimo, la actividad mitótica enérgica y necrosis geográfica central, en consonancia con una neoplasia glial de alto grado ( la Figura 7). En contraste, no hay ratones inyectados con células agotadas de c-Myc expresión desarrollado signos y después de 100 días no mostraron evidencia de células neoplásicas (Figura 7). Por lo tanto, c-Myc parece ser esencial para las células madre de cáncer para formar tumores.
células (A) T3359 CD133 + se infectaron y seleccionados como se describe. Después de la selección, se inyectaron células en cerebros de ratones nu /nu Balb /c atímicos (5000 células por ratón). Se inyectaron cuatro ratones para cada grupo. Los ratones del grupo de control fueron sacrificados en el desarrollo de signos neurológicos. Todos los ratones portadores de células de glioma caída c-Myc no desarrollaron signos neurológicos y fueron sacrificados después de 100 días, sin evidencia de tumor. Se muestran las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier. (B) fotografías representativas de hematoxilina y eosina de xenoinjertos de tumores intracraneales (10 ×). (C) El tejido de xenoinjerto del grupo de control compuesto por células pleomórficas con alta relación entre núcleo y citoplásmicos, con nucleolos prominentes mínimo citoplasma, la actividad mitótica enérgica y necrosis geográfica central (asterisco, 600 ×). (D) El xenotrasplante de glioma exhibido áreas focales de células tumorales diferenciadas mejor con citoplasma eosinófilo y relativamente más células con perfiles excéntricos citoplasmáticos sugestivos de una apariencia gemistocítico (flechas, 400 ×). (E) xenoinjerto de tumor del grupo de control exhibe infiltración de células tumorales en el tejido cerebral circundante a lo largo del margen. La actividad mitótica (punta de flecha) la infiltración de células tumorales presentan una alta relación entre núcleo y citoplasma alargado citoplasmáticos fibrilar (flecha) (600 ×). (F) de cerebro de ratón inyectado con células que expresan T3359 c-Myc shRNA no mostró evidencia de tumor en el sitio de inyección de la aguja (flechas, 200 ×).
Discusión
La madre del cáncer hipótesis de las células ha engendrado controversia significativa, pero la presencia de la heterogeneidad de las células tumorales en algunos tipos de cáncer es bien reconocido. Las células tumorales que muestran contener características similares a las células e iniciar los tumores de xenoinjertos se han purificado a partir de un número creciente de tipos de cáncer, incluyendo leucemia [35], [36], el cerebro [28], [29], de mama [37], de colon [38 ], [39], [cánceres pancreáticos 40], y de cabeza y cuello [41]. Estas células madre del cáncer se definen funcionalmente a través de ensayos de los ensayos de auto-renovación y de xenotrasplantes de serie en modelos de roedores. Los experimentos demuestran que el potencial tumorigénico de las células madre del cáncer es por lo menos varias magnitudes más alta que los tumores a granel. Por ejemplo, las células madre del cáncer de glioma enriquecidos por la selección de la forma antígeno de tumores de xenoinjertos ortotópico de superficie CD133 con 500 células en ratones desnudos atímicos, mientras que 2 × 10
6 CD133- células no pueden [9]. En línea con el potente tumorigenicidad de las células madre tumorales del cerebro, hemos demostrado aquí que las células madre del cáncer de glioma CD133 + altamente expresado la oncoproteína c-Myc. El análisis FACS demostró que al menos la mitad de las células CD133 + agudamente disociado a partir de muestras de biopsia quirúrgica humanos tenían altos niveles de c-Myc, mientras que la mayoría (& gt; 85%) de las células CD133- eran c-Myc-bajo (Figura 1D). Similar co-expresión de c-Myc y un marcador de células madre, nestina, se identificó directamente en las secciones de muestra de biopsia quirúrgicos humanos (Figura 1E). En particular, las células madre del cáncer de glioma que expresan c-Myc shRNA aún conservaban los niveles residuales de la proteína c-Myc (Figura 2B, carriles 5 y 6) que eran más altos que los niveles de c-Myc se encuentran en las células que expresan CD133- no director shRNA (Figura 2B, carril 1). Sin embargo, los niveles reducidos de c-Myc eran incapaces de proliferación de soporte, el crecimiento, la supervivencia, y la tumorigénesis de las células madre de cáncer de glioma. Un modelo reciente ratón de linfoma de células T utilizando condicionalmente expresa c-Myc también sugieren que se requiere cierto nivel de umbral de c-Myc para mantener el fenotipo del tumor [42]. En conjunto, nuestros resultados ponen de manifiesto un requisito necesario de la alta expresión de c-Myc en las células madre del cáncer de glioma.
Se han propuesto las células madre del cáncer como lentamente ciclo de las células, al igual que sus homólogos de células madre somáticas [43]. La rápida expansión de los tumores es entonces dependiente de las células progenitoras se dividen rápidamente. El ciclo celular lento puede proporcionar células madre del cáncer de un mecanismo de protección contra ciertos enfoques terapéuticos que se dirigen a las células en proliferación rápida. Por ejemplo, en la leucemia mielógena aguda humana, las células madre de la leucemia quiescentes son resistentes a la quimio-fármacos que depende del ciclo celular [44]. Sin embargo, las características de las células madre de cáncer pueden no ser necesariamente uniforme a través de diferentes tipos de cáncer, y la biología de las células madre de cáncer pueden cambiar a lo largo diferentes etapas de desarrollo del tumor. En los tumores cerebrales, Singh y compañeros de trabajo demostró por primera vez que sólo la población de células madre cancerosas proliferan CD133 +
in vitro
cuando agudamente aislado de muestras de biopsias quirúrgicas humanos [28], [29]. Estos resultados fueron similares a las células madre de cáncer de proliferación que se caracterizaron en un rabdomiosarcoma embrionario de pez cebra inducida por RAS [45]. En el presente estudio, se determinó que las células de glioma CD133 + contenían un mayor porcentaje de células en fase S y crecieron más rápido
in vitro que las células
CD133- emparejados (Figuras 3 y 4). También se encontró que la proliferación y el crecimiento de las células madre de cáncer de glioma fueron severamente deteriorados en desmontables de c-Myc, pero importante, la progresión del ciclo celular de las células de glioma CD133- eran relativamente insensible a la pérdida de c-Myc. Los programas de transcripción regulados por c-Myc aún bien definidos y dependiente de estado celular [26], [46], sino que incluyen la inducción de la ciclina D
1 [47] y la represión de la p21
WAF1 /CIP1 ciclina dependiente inhibidor de quinasa [48], [49]. Consistentemente, la expresión de reguladores del ciclo celular aguas abajo de c-Myc, incluyendo p21
WAF1 /CIP1 y ciclina D
1, se modificó en las células madre de cáncer de glioma siguiente c-Myc caída, pero no en las células CD133-. Estos datos descubren un papel específico de c-Myc y sus genes diana aguas abajo en la regulación de la proliferación y el crecimiento de las células madre de cáncer de glioma CD133 +.
La apoptosis puede ser inducida por la expresión aberrante de ciertos oncogenes, tales como c-Myc y E2F1, que puede actuar como un mecanismo "a prueba de fallos" para erradicar el potencial de transformación celular [33], [50]. La apoptosis inducida por c-Myc puede ser mediada por la activación de la vía de ARF-MDM2-p53, o por la activación de receptores de muerte, tales como CD95 /Fas [33]. Sin embargo, la desregulación de c-Myc es común en los tumores humanos y es un indicador de mal pronóstico porque los tumores están bien equipadas con diversos mecanismos anti-apoptosis que pueden neutralizar la presión de apoptosis introducido por c-Myc. Tumorigénesis en c-Myc modelos de ratón transgénico se acelera si se combina con otras alteraciones genéticas anti-apoptosis, tales como la sobreexpresión de Bcl-2 [51] o Bmi1 [52], o interrumpir la vía de ARF-MDM2-p53 [53]. Además, se ha demostrado directamente que se requiere una actividad sostenida c-Myc para el mantenimiento de tumores en una variedad de modelos de ratones transgénicos condicionales. Estos modelos muestran que la inactivación de c-Myc, casi inevitablemente, da como resultado la regresión del tumor independientemente del tipo de tumor con la inhibición concomitante de crecimiento, la diferenciación y la apoptosis (revisado en [54]). En algunos casos, tales como osteosarcoma [55] y tumores de la piel [56], breve inactivación de c-Myc es suficiente para inducir la regresión del tumor sostenida. Sin embargo, la dependencia de c-Myc puede ser de tipo específico de tumor. En ciertos modelos transgénicos condicionales, la reactivación de c-Myc después de la interrupción transitoria restaura el crecimiento del tumor [57], que puede implicar la activación de las células madre de cáncer latentes. Alternativamente, los tumores pueden recaer en una parte de los animales, incluso en ausencia de la actividad de c-Myc, lo que sugiere que las células madre de cáncer pueden haber acumulado mutaciones adicionales para compensar la pérdida de c-Myc [58], [59], [60]. La regresión del tumor sostenida puede estar asociada con la erradicación completa de las células madre del cáncer después de la inactivación de c-Myc, mientras que las células madre de cáncer pueden sobrevivir y /o escapar de c-Myc dependencia en los tumores recurrentes. Nuestro estudio demostró una inducción marcada de la apoptosis después de c-Myc caída en la población de células madre de cáncer (Figura 4), y las células madre de cáncer empobrecido de la expresión de c-Myc no desarrolló tumores de xenoinjertos ortotópico en ratones desnudos (Figura 6). De particular interés, la supervivencia de las células de glioma no madre no era dependiente de la expresión sostenida de c-Myc. En una serie de estudios recientes en otros modelos de cáncer, apuntando a la expresión de c-Myc deteriorado la proliferación celular y la senescencia inducida por [61], [62], [63]. Estos modelos pueden representar el resultado de la pérdida de c-Myc en las poblaciones celulares de cáncer más homogéneos, en particular los modelos de ingeniería genética impulsados por la sobreexpresión de c-Myc. Nuestro estudio tiene implicaciones importantes como la orientación de c-Myc tiene ventajas únicas específicas en los diferentes compartimentos celulares en los modelos que representan la heterogeneidad celular. Aunque la orientación c-Myc era suficiente para prevenir el crecimiento tumoral en nuestros estudios, los efectos dicotómicas de inhibición de c-Myc que hemos detectado puede apoyar la necesidad de orientar simultáneamente las poblaciones tumorales de células no madre para lograr la eficacia clínica. Por lo tanto, c-Myc como un objetivo molecular debe ser abordado con la sofisticación ya que la mayoría de las células tumorales pueden demostrar respuestas terapéuticas limitadas pero una población tumoral crítico - las células madre del cáncer - se puede inhibir o muerto para mejorar el control global del tumor y disminuir la resistencia a la otras terapias.