Extracto
El medicamento contra el cáncer activo ruxolitinib es un inhibidor de la quinasa Janus potente aprobado para el tratamiento de las neoplasias mieloproliferativas. Además, ruxolitinib tiene actividad inhibidora débil contra un panel de otras quinasas, incluyendo Src quinasa. No hay información estructural de ruxolitinib unión a cualquier quinasa. En este trabajo, se determinó la estructura cristalina del dominio quinasa c-Src en el complejo de ruxolitinib a una resolución de 2,26 Å. dominio quinasa c-Src adopta el ruxolitinib DFG-en conformación activa sobre ruxolitinib vinculante, lo que indica que es un tipo de inhibidor de c-Src. Ruxolitinib forma dos enlaces de hidrógeno con Met341, un enlace de hidrógeno mediado por agua con Thr338, y un número de contactos de van der Waals con c-Src. entonces ruxolitinib se acopló en el bolsillo de unión a ligando de una estructura JAK1 resuelto previamente. A partir del resultado de acoplamiento, también se une ruxolitinib JAK1 como tipo I inhibidor, con más interacciones y una mayor complementariedad de forma con el bolsillo de unión a ligando de JAK1 comparación con la de c-Src. Desde ruxolitinib es un inhibidor relativamente pequeño y no hay cavidad considerable entre ruxolitinib y c-Src bolsillo de unión a ligando, se propone modificar ruxolitinib para desarrollar inhibidores más potentes de c-Src
Visto:. Duan Y, Chen L, Chen Y, Ventilador Xg (2014) c-Src se une a la droga contra el cáncer ruxolitinib con una conformación activa. PLoS ONE 9 (9): e106225. doi: 10.1371 /journal.pone.0106225
Editor: Wenqing Xu, de la Universidad de Washington, Estados Unidos de América
Recibido: 11 de mayo de 2014; Aceptado: 28 Julio 2014; Publicado: 8 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Duan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. coordenadas atómicas y factores de estructura han sido depositados en el Banco de Datos de Proteínas www.rcsb.org con los números de acceso 4U5J
Financiación:. Este trabajo es apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (YC, números de proyecto y 81272971 81372904) y los Institutos nacionales de Salud (NIH) (LC, 5R01GM064642). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las proteínas quinasas catalizan la transferencia de un grupo fosforilo a partir de trifosfato de adenosina (ATP) a los residuos de serina, treonina o tirosina de sus proteínas sustrato [1]. Tales modificaciones postraduccionales sirven como un mecanismo para modular la actividad enzimática o interacciones moleculares de las proteínas sustrato en respuesta a las señales endógenas y exógenas [1]. La fosforilación desempeña un papel crítico en la transducción de la señal y regula numerosos procesos celulares, incluyendo la adhesión celular, la invasión, la proliferación, la supervivencia y la angiogénesis [2]. El exceso de expresión o mutaciones de las proteínas quinasas pueden conducir a una variedad de enfermedades humanas como el cáncer y la autoinmunidad. Las proteínas quinasas son dianas terapéuticas para el tratamiento de enfermedades humanas [3]. Un ejemplo prototípico, Imatinib, se dirige a BCR-Abl, una forma constitutivamente activa de la quinasa Abl que conduce a la leucemia mieloide crónica (CML), y es muy exitoso en el tratamiento de esta enfermedad [4].
Debido de un alto grado de conservación de la secuencia dentro del dominio de la quinasa, no es sorprendente que la mayoría de los inhibidores de quinasa tienden a tener especificidad de diana limitada. Fuera de objetivo efectos pueden ser beneficiosos en algunos casos, pero pueden dar lugar a efectos secundarios en otros casos. Cada inhibidor de quinasa tiene su espectro objetivo único y altamente impredecible [5]. La comprensión del mecanismo detrás de la especificidad objetivo es un objetivo importante que mejore el uso de inhibidores de la quinasa existentes y beneficiar el proceso de desarrollo de inhibidores. Por ejemplo, la información estructural de quinasa de unión Imatinib no sólo se estudió en complejo con su objetivo previsto quinasa Abl [6], pero también estudiado en complejo con otras quinasas, incluyendo c-Src, Lck, p38 [7] - [9] . Estos estudios ayudan enormemente a entender la base de la inhibición de la quinasa, la selectividad y los potenciales efectos fuera de la meta. Además, estos estudios proporcionan un andamiaje estructural para el desarrollo de nuevos inhibidores de la quinasa de diferentes quinasas
inhibidores de proteína quinasa se dividen típicamente en tres subtipos:. Tipo I, tipo II y tipo III inhibidores. inhibidores de tipo I ocupan la bolsa llena principalmente por ATP, y a-Phe-Gly Asp (DFG) motivo catalíticamente importante se mantiene en conformación activa (referido como DFG-en conformación). Un ejemplo típico de un inhibidor de la quinasa tipo I es la segunda generación del inhibidor de BCR-Abl, dasatinib. inhibidores de tipo II, tales como Imatinib, ocupan el bolsillo de unión a ATP y una región adicional, y el motivo DFG se hace girar por ~ 180 ° con respecto a la conformación activa (referido como DFG-cabo conformación) [10] - [12 ]. Tipo III inhibidores se unen dominios reguladores fuera del bolsillo de unión a ATP, y modulan la actividad de la quinasa de forma alostérica. Debido a que los aminoácidos fuera del bolsillo de unión del ATP son menos conservadas relación con los de la bolsa, se ha propuesto que podría ser más fácil de lograr la selectividad con inhibidores de la quinasa de tipo II o de tipo III.
Un único residuo dentro de la ATP-sitio de las proteínas quinasas, denominado el controlador de acceso, juega un papel importante en la formación del bolsillo de especificidad, y controla la sensibilidad a una variedad de inhibidores de moléculas pequeñas. El residuo gatekeeper varía entre las diferentes proteínas quinasas. Algunas quinasas tienen un pequeño residuo (por ejemplo, Thr, Ala, o Gly) en esta posición, y son fácilmente atacados por estructuralmente diversos clases de inhibidores. Otras quinasas poseen un residuo más grande (por ejemplo, Phe) en esta posición, y son más resistentes [13]. La mutación del residuo gatekeeper es un mecanismo común de resistencia a los inhibidores de la quinasa. Por ejemplo, la sustitución de BCR-Abl gatekeeper Thr-315 a Ile ha dado lugar a la resistencia a Imatinib [14] - [16].
ruxolitinib es un inhibidor potente janus quinasa para el tratamiento de las neoplasias mieloproliferativas (MPN ) [17]. Tiene una potente actividad inhibidora contra JAK1 (IC
50 = 3,3 nM) y JAK2 (IC
50 = 2,8 nM), la actividad moderada contra TYK2 (IC
50 = 19 nM) y una débil actividad frente JAK3 ( IC
50 = 428 nM) y un panel de otras quinasas, incluyendo Src quinasa [18], [19]. mutaciones JAK2 y la activación juegan un papel fundamental en la etiología de las MPN humanos. Por ejemplo, alrededor de la mitad de los pacientes con MPN llevar a una mutación de ganancia de función en el gen JAK2 (JAK2 V617F) [17], [18]. Ruxolitinib inhibe la vía de señalización desregulada JAK2, y mostró beneficios significativos en los ensayos clínicos. En 2011, ruxolitinib fue aprobado para el tratamiento del intermedio o alto riesgo mielofibrosis [20].
No hay ninguna información estructural de ruxolitinib unión a cualquier quinasa. En este trabajo, investigamos la base estructural para ruxolitinib unión a una quinasa, utilizando dominio quinasa c-Src como un sistema prototipo. Mediante la determinación de la estructura de un complejo ruxolitinib a 2,26 Å de resolución, se demostró que el dominio quinasa c-Src adopta la conformación activa DFG-in. Ruxolitinib forma dos enlaces de hidrógeno con Met341, un enlace de hidrógeno mediado por agua con Thr338, y un número de contactos de van der Waals con c-Src. A continuación, atracado ruxolitinib en el bolsillo de unión a ligando de una estructura JAK1 resuelto previamente. De nuestro resultado de acoplamiento, también se une ruxolitinib JAK1 como tipo I inhibidor, con más interacciones y mayor complementariedad de forma con el bolsillo de unión a ligando de JAK1 que la de c-Src. Dado que no hay cavidad considerable entre ruxolitinib y el bolsillo de unión de ligando-c-Src, es muy posible modificar ruxolitinib para desarrollar inhibidores más potentes de c-Src.
Métodos
Protein Expression and purificación
pollo c-Src (residuos 251-533) se prepararon como se describe anteriormente [21]. En breve, la proteína se expresó con un 6 × marcada con His en células de Escherichia coli BL21DE3, en presencia de la fosfatasa YopH. La proteína se purificó primero por perlas de Ni-NTA. El 6 × His-tag se separó por escisión TEV. Después de la escisión, la cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de exclusión por tamaño se utilizaron para purificar adicionalmente la proteína. La proteína en Tris 50 mM (pH 8,0), NaCl 100 mM, 5% de glicerol, 1 mM de DTT se concentró a 10 mg /ml y se congelaron rápidamente para su almacenamiento a -80 ° C.
cristalización
el c-Src cristales /ruxolitinib se obtuvieron a 18 ° C utilizando el método de difusión de vapor de gota colgante. El-Src c complejo /ruxolitinib se mezcló en una solución de 170 mM c-SRC, 2000 ruxolitinib mu M, DMSO al 10%, Tris 50 mM (pH 8,0), NaCl 100 mM, 5% de glicerol, 1 mM de DTT. La disolución de reserva que contenía 0,1 M de MES (pH 6,4), 2% de glicerol, 8% de PEG 4000, acetato de sodio 50 mM, MgCl2 10 mM. Los cristales se cryoprotected en solución de depósito más el 20% de glicerol y 2000 ruxolitinib M. Crystal pertenece al grupo espacial P1 con dimensiones de celda de
a
= 42,107 Å,
b
= 63,228 Å,
c
= 73,989 Å, α = 79,27 °, β = 89.27 °, γ = 90,29 °.
Recogida de datos y estructura Determinación
los datos fueron recogidos en el Centro de Shanghai de Radiación Sincrotrón (SSRF), BL17U línea de luz, y el Advanced Light Source (Lawrence Berkeley Laboratorio nacional) líneas de luz 5.0.2 y 8.2.1. Los datos se redujo usando HKL2000 [22]. Determinación de la estructura se llevó a cabo como se describe anteriormente [23], [24]. determinación de fase inicial se realizó mediante la sustitución molecular con Phaser del paquete CCP4 [25], utilizando la cadena A de una estructura de c-Src resuelto previamente (PDB código 2SRC) [26] como el modelo de búsqueda. La estructura se refinó usando Phenix.refine y Coot del paquete Phenix [27]. Las estadísticas del análisis cristalográfico se presentan en la Tabla 1. Las representaciones gráficas de la estructura se prepararon utilizando PyMOL (Delano Scientific, San Francisco, CA). Las coordenadas y factores estructurales han sido depositadas en el Protein Data Bank con 4U5J código de acceso.
acoplamiento molecular y el análisis estructural
acoplamiento molecular se llevó a cabo utilizando Molsoft ICM-Pro [28 ]. Ruxolitinib estaba atracado en el bolsillo de unión a ligando de JAK1 (código PDB: 3EYG) [29]. Volumen de la cavidad de unión a ligando se calculó utilizando POCASA [30]. Diagramas de las interacciones proteína-ligando se generó usando LIGPLOT [31].
Ensayos de quinasa
c-Src (diluido en 50 mM Tris pH 7,5, EGTA 0,1 mM, 0,1% β-mercaptoetanol, se ensayó 1 mg /ml BSA) contra KVEKIGEGTYGVVYK en un volumen final de 25,5 l que contenía Tris 50 mM pH 7,5, EGTA 0,1 mM, KVEKIGEGTYGVVYK 0,3 mM, acetato de magnesio 10 mM y 0,05 mM [33P-γ-ATP] (50-1000 cpm /pmol) y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. Los ensayos se detuvieron mediante la adición de 5 l de M (3%) de ácido ortofosfórico 0,5, cosechados en placas P81 Unifilter con un tampón de lavado de 50 mM de ácido ortofosfórico, y se secaron en aire. Las placas Unifilter secos se sellaron en la adición de MicroScint O y se contaron en contadores de centelleo Packard Topcount NXT.
Resultados y Discusión
ruxolitinib la unión al bolsillo de unión a ATP de c-Src
para ver cómo medicamento contra el cáncer ruxolitinib interactúa con una quinasa, se determinó la estructura de rayos X de c-Src en el complejo con ruxolitinib a una resolución de 2,26 Å. Las estadísticas de recolección de datos y el refinamiento del modelo se muestran en la Tabla 1. Cada unidad asimétrica contiene dos moléculas de c-Src. No es la densidad de electrones bien definido para ruxolitinib en ambas moléculas c-Src, lo que parece estar vinculado con una ocupación completa (Figura S1). La estructura de la c-Src se compone de una arquitectura bi-lobulado (N-lóbulo y C-lóbulo) que es típico de las proteínas tirosina quinasas. El sitio de unión ATP de c-Src quinasa se encuentra en la hendidura de plegado entre los lóbulos N- y C-terminales, rodeado por la región bisagra, P-loop, Helix aC, y el bucle de activación (Figura 1A). Parte del bucle de activación (aminoácidos 412-423) no muestra la densidad de electrones, lo que indica esta región es flexible. Por lo tanto esta región no está incluido en el AP.
(A) Estructura general del complejo de c-Src /ruxolitinib. (B) Los anillos de pirrolopirimidina forman dos enlaces de hidrógeno con los átomos de la cadena principal de Met341. (C) ruxolitinib forma una interacción mediada por agua con residuos de Src gatekeeper Thr338.
ruxolitinib se une en la cavidad de unión a ATP de c-Src, con densidad de electrones inequívoca la observada para el inhibidor (Figura S1) . Está orientada de tal manera que los anillos de pirrolopirimidina apuntan hacia la región bisagra, los puntos de anillo de ciclopentano hacia el C-lóbulo, mientras que los puntos del grupo propanonitrilo hacia la P-bucle (Figura 1A). Los anillos pirrolopirimidina forman dos enlaces de hidrógeno con los principales átomos de la cadena de Met341 (Figura 1B), así como una interacción mediada por agua con Src residuo gatekeeper Thr338 (Figura 1C). Además de los enlaces de hidrógeno, ruxolitinib también forma un número de van der Waals contactos con c-Src (Figura S2).
DFG motivo se localiza en el extremo N-terminal del bucle de activación, y su conformación juega un pivotal papel en la actividad de quinasa [32]. DFG-en-DFG y fuera conformaciones representan dos estados extremos de un continuo de posibilidades [32]. estados intermedios se observan en algunos casos [26]. Tres distintas conformaciones de los dominios quinasa de quinasas de la familia Src: un DFG-en conformación activa, una conformación inactiva DFG-intermedio, y una conformación inactiva DFG de salida [32]. En el DFG-en la conformación (Figura 2A y 2B, PDBs 3LCK y 3DQW), las caras de la cadena lateral Aspartato en el sitio de unión de ATP, y las caras de la cadena lateral de fenilalanina en la proteína. En la conformación DFG-out (Figura 2E, 2OIQ pdb), la columna vertebral del motivo DFG es volteado, la cadena sdie aspartato enfrenta lejos del sitio de unión a ATP, mientras que la cadena lateral de fenilalanina ocupa el sitio de unión a ATP. Por ejemplo, el dominio quinasa de c-Src adopta conformación DFG-a cabo tras la unión a Imatinib [33]. En la conformación DFG-intermedio (Figura 2D, 2SRC AP), la DFG-motivo adopta una conformación entre las dos conformaciones anteriores. Se comparó la conformación DFG-motivo en el complejo de Src /ruxolitinib con estos tres conformaciones. Al parecer, tras la unión ruxolitinib, dominio quinasa c-Src se mantiene en DFG-en la conformación (Figura 2C)
(A) activa Lck DFG-en la conformación. (PDB: 3LCK); (B) activa c-Src T338I DFG-en la conformación (PDB: 3DQW); (C) activa c-Src-DFG en la conformación de complejos Src /ruxolitinib (este trabajo); (D) inactiva c-Src en la conformación Src /CDK, DFG-intermedio (PDB: 2SRC); (E) inactiva c-Src DFG-a cabo la conformación de Src /Imatinib compleja (PDB: 2OIQ).
El dominio quinasa de c-Src adopta diferentes conformaciones tras la unión de diferentes inhibidores. En el complejo c-Src /Imatinib, Imatinib no sólo ocupa el sitio de unión del ATP, sino que también se extiende más allá de la DFG motivo y ocupa una región adicional. El motivo DFG es en el DFG-cabo conformación (Figura 3A). En el complejo c-Src /ruxolitinib, ruxolitinib sólo ocupa el sitio de unión a ATP, y c-Src adopta una conformación DFG-in. El bucle P se mueve más cerca de la C-lóbulo, lo que lleva a un sitio de unión a ATP con más fuerza. Esto podría ser debido a un ajuste inducida por mecanismo (Figura 3B). Basándose en estas observaciones, de imatinib es un inhibidor de tipo II para c-Src mientras ruxolitinib es un tipo I inhibidor para c-Src.
(A) de ocupación de bolsillo de Imatinib en el c-Src /Imatinib complejo (pdb : 2OIQ). estructura C-Src se muestra en dibujos animados, de color magenta. El imatinib se muestra en la esfera. (B) la ocupación de bolsillo de ruxolitinib en el complejo c-Src /ruxolitinib (este trabajo). estructura C-Src se muestra en dibujos animados, de color amarillo. Ruxolitinib se muestra en la esfera.
La mayoría de los inhibidores de la quinasa son competitivos con ATP y pertenecen al tipo I inhibidores. El bolsillo de unión a ATP se conserva entre los miembros de la familia de las quinasas. Además del bolsillo de unión a ATP, inhibidor de tipo II se une un bolsillo adicional menos conservada. Tipo II inhibidor actúa mediante la inducción de un cambio de conformación de tal manera que la quinasa ya no es capaz de funcionar. Se propone que inhibidor de tipo II podría lograr una mejor selectividad. No obstante, la eficacia biológica, especialmente la eficacia clínica, será el árbitro final.
Comparación de los bolsillos de unión de Src y JAK
ruxolitinib es un inhibidor de la quinasa Janus, con reportados IC
50 valores de 2,8 nM para JAK2, 3,3 nM para JAK1, 19 nM para TYK2, y 428 nM de JAK3 [18]. Lck, una quinasa de la familia Src, se inhibe por ruxolitinib con un informado IC
50 valor de 3,6 uM [19]. El uso de ensayos de quinasa, se encontró que inhibía ruxolitinib c-Src con un IC
50 de 2,92 uM (Tabla S1). Por lo tanto, las quinasas Src son inhibidas por ruxolitinib a un grado mucho menor que las quinasas JAK. La identidad de secuencia entre Src y quinasas de la familia JAK es ~34% en el dominio de la quinasa (Figura 4A & amp; 4B). Además del hecho de que las quinasas JAK tienen varios tramos adicionales de aminoácidos (Figura 4A, destacó en la caja verde), se identificaron varias otras diferencias clave entre la familia quinasa Src quinasa JAK y familiares. Thr338, el residuo guardián de c-Src, se sustituye con Met en la familia JAK; Met 341 de c-Src, el residuo que forman dos enlaces de hidrógeno con ruxolitinib, se sustituye con leucina en la familia JAK (Figura 4A)
El motivo DFG conservado se pone de relieve en la caja azul.; el residuo guardián se pone de relieve en el cuadro rojo; residuo correspondiente a Met341 en c-Src se pone de relieve en la caja púrpura; varios tramos adicionales de aminoácidos se resaltan en caja verde
A continuación, nuestra estructura superponen con una estructura JAK1 (PDB: 3EYG). [29]. Ambos dominios quinasa comparten una estructura global similar con un RMSD de 2,92 Å. El P-bucle de JAK1 está más cerca del C-lóbulo, lo que lleva a un bolsillo más estrecha, en comparación con la de C-Src (Figura 5A). A continuación, utiliza POCASA [30] para analizar los bolsillos de unión a ligando de c-Src (nuestra estructura) y JAK1 (código pdb: 3EYG). JAK1 tiene un bolsillo más pequeño con un volumen de 311 Å
3, mientras que c-Src tiene un bolsillo más grande con un volumen previsto de 450 Å
3 (Figura 5B & amp; 5C).
( A) dominio de la quinasa c-Src (este trabajo) se superpone con el dominio quinasa JAK1 (pdb: 3EYG) utilizando los átomos de Ca de dominio quinasa como referencia. c-Src se muestra amarilla, mientras que JAK1 se muestra en magenta. (B) pronosticó c-Src de unión a ligando de bolsillo se muestra en puntos grises. (C) pronosticó JAK1 de unión a ligando de bolsillo se muestra en puntos grises. bolsillo de unión a ligando se predijo usando POCASA [30]
Para entender mejor cómo ruxolitinib diferencia estas familias de quinasas, nos atracado ruxolitinib en una estructura JAK1 resuelto previamente (PDB: 3EYG). [29]. El resultado de acoplamiento muestra que ruxolitinib sólo ocupa el sitio de unión a ATP, y el motivo DFG se mantiene en DFG-en conformación activa (Figura 6A), lo que sugiere que ruxolitinib es también un tipo I inhibidor para JAK1. Esto es consistente con el hallazgo anterior utilizando ensayos de unión de competencia [5]. Ruxolitinib está orientado de tal manera que los anillos de pirrolopirimidina apuntan hacia la región bisagra. En lugar de formar dos enlaces de hidrógeno con Met341 en c-Src, los anillos de pirrolopirimidina forman dos enlaces de hidrógeno con los átomos de la cadena principal de Glu957 y Leu959 (Figura 6B). Una diferencia importante entre ruxolitinib unión a c-Src y JAK1 se encuentra en la orientación del anillo de ciclopentano. Se señala hacia a la C-lóbulo en el complejo de c-Src /ruxolitinib, mientras que los puntos hacia la N-lóbulo cuando la unión a JAK1 (Figura 6B). Otra diferencia notable es que el grupo de propanonitrilo ruxolitinib hace contactos con JAK1, mientras que no interactúa con c-Src (Figura S3).
(A) ruxolitinib estaba atracado en el bolsillo de unión a ligando de JAK1 ( AP: 3EYG). dominio quinasa JAK1 se muestra en la historieta, y coloreado en magenta. Ruxilitinib se muestra en la esfera. (B) Predicción de enlaces de hidrógeno entre ruxolitinib y JAK1 región bisagra. En base al resultado de acoplamiento, los anillos de pirrolopirimidina forma dos enlaces de hidrógeno con ruxolitinib JAK1 Glu957 y Leu959. (C) Forma complementariedad entre ruxolitinib y JAK1 bolsillo de unión a ligando. (D) Forma complementariedad entre ruxolitinib y c-Src bolsillo de unión a ligando. La bolsa de unión ligando-predicha se muestra en la malla gris.
Hay una complementariedad de forma elevado entre ruxolitinib y el bolsillo JAK1 de unión a ATP (Figura 6C), dando lugar a más contactos con los residuos que rodea el bolsillo que la de c-Src (Figura S3). En el complejo c-Src /ruxolitinib, hay una cavidad considerable adyacente a ruxolitinib en el bolsillo de unión al ligando, especialmente entre ruxolitinib y la Helix αC de c-Src (Figura 6D). Más interacciones y una mayor complementariedad forma podría ser la razón por la ruxolitinib es un inhibidor más potente de quinasas JAK quinasas Src que para.
Ruxolitiib es un inhibidor relativamente pequeño con un peso molecular de 306,37 g /mol. La adición de algunos grupos adicionales a ruxolitinib podría conducir al descubrimiento de nuevos compuestos que son inhibidores más potentes de c-Src. Por ejemplo, la adición de algunos grupos químicos para llenar la cavidad entre ruxolitinib y Helix αC de c-Src podría mejorar en gran medida la afinidad del nuevo compuesto con quinasas Src. Sin embargo, debido al aumento en el volumen de ligando, el nuevo compuesto sería probable que sea demasiado grande para llenar la JAK bolsillo de unión al ligando, por lo tanto, podría ser un inhibidor pobre para quinasas JAK.
Conclusiones
En este trabajo, se presenta una estructura cristalina de ruxolitinib unido al dominio quinasa de c-Src. Aunque ruxolitinib no es un potente inhibidor de c-Src, la estructura cristalina muestra que el dominio de la quinasa c-Src se mantiene en la conformación activa DFG-en que es característico de tipo I inhibidor. Además, nos atracado ruxolitinib en el bolsillo de unión a ligando de una estructura JAK1 resuelto previamente. De nuestro resultado de acoplamiento, también se une ruxolitinib JAK1 como tipo I inhibidor. En comparación con su unión a c-Src, ruxolitinib tiene más interacciones y una mayor complementariedad de forma con JAK1 bolsillo de unión a ligando, lo que podría ser la razón principal por la ruxolitinib es un inhibidor mucho más potente contra quinasas JAK quinasas que Src. En nuestro análisis estructural, nos dimos cuenta de que no hay cavidad considerable entre ruxolitinib y c-Src ligando vinculante de bolsillo, lo que sugiere que la modificación de ruxolitinib podría conducir al desarrollo de inhibidores de c-Src potentes.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Fo-Fc omitir mapa de ruxolitinib en el complejo c-Src /ruxolitinib. La densidad de electrones se contornea en 2σ y se superpone con el modelo final
doi:. 10.1371 /journal.pone.0106225.s001 gratis (TIFF)
figura S2.
Representación esquemática de las interacciones ptotein-ligando en el complejo de c-Src /ruxolitinib. Los enlaces de hidrógeno se indican mediante líneas de trazos entre los átomos involucrados, mientras que los contactos hidrófobos están representados por un arco con radios. El diagrama fue generada por LIGPLOT [31] (Referencia complementario)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0106225.s002 gratis (TIFF)
Figura S3.
Representación esquemática de las interacciones ligando-ptotein en JAK1 /ruxolitinib resultado de acoplamiento. Los enlaces de hidrógeno se indican mediante líneas de trazos entre los átomos involucrados, mientras que los contactos hidrófobos están representados por un arco con radios. El diagrama fue generada por LIGPLOT [31] (Referencia complementario)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0106225.s003 gratis (TIFF)
Tabla S1.
ensayos de quinasa muestran que inhibe ruxolitinib c-Src con una IC50 de 2.93 uM
doi:. 10.1371 /journal.pone.0106225.s004 gratis (DOCX)
Reconocimientos
agradecemos a Xiao Lei, Kaori Noridomi, y Shuxing Li para la asistencia experimental y discusión. Agradecemos a Chao Zhang para proporcionar el vector de expresión de c-Src. Agradecemos a Meng Xia y Stephanie Chu para obtener ayuda con la edición. Agradecemos a los miembros del personal ALS BCSB Corie Ralston y Kevin Real para ayudar con la recolección de datos. Agradecemos a los miembros del personal FRSS BL17U para ayudar con la recolección de datos. Agradecemos a Centro Internacional para la quinasa de perfiles para obtener ayuda con ensayo de quinasa.