Extracto
Cabozantinib es un inhibidor de múltiples receptores tirosina quinasas, incluyendo MET y VEGFR2. En un ensayo clínico de fase II en cáncer de próstata avanzado (CaP), cabozantinib tratamiento mejoró la gammagrafía ósea en el 68% de los pacientes evaluables. Nuestros estudios dirigidos a determinar la expresión de objetivos cabozantinib durante la progresión del CaP y para evaluar su eficacia en la hormona sensible y resistente a la castración CaP en modelos preclínicos, mientras que la delimitación de sus efectos sobre el tumor y el hueso. El uso de inmunohistoquímica y de microarrays de tejidos que contienen próstata normal, CaP primario y metástasis de tejidos blandos y óseos, nuestros datos muestran que los niveles de MET, P-MET, y VEGFR2 están aumentando durante la progresión del CaP. Nuestros datos también demuestran que la expresión de los objetivos cabozantinib son particularmente pronunciados en las metástasis óseas. Para evaluar la eficacia cabozantinib en el crecimiento del CP en el entorno de los huesos y en los tejidos blandos que utilizamos andrógeno-sensibles LuCaP 23.1 y tumores C4-2B CaP resistentes a la castración.
In vivo
, cabozantinib inhibió el crecimiento de CaP en los huesos, así como el crecimiento de los tumores subcutáneos. Además, el tratamiento cabozantinib atenúa la respuesta ósea al tumor y produjo un aumento de volumen de hueso normal. En resumen, el patrón de expresión de los objetivos cabozantinib en CaP metastásico primario y resistente a la castración, y su eficacia en dos modelos diferentes de CaP sugerir que este agente tiene un gran potencial para el tratamiento eficaz de PCa en diferentes etapas de la enfermedad.
Visto: Nguyen HM, Ruppender N, Zhang X, Brown LG, TS bruto, Morrissey C, et al. (2013) Cabozantinib inhibe el crecimiento del cáncer de próstata andrógeno-sensibles y resistente a la castración y afecta a la remodelación ósea. PLoS ONE 8 (10): e78881. doi: 10.1371 /journal.pone.0078881
Editor: Daotai Nie, Escuela de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: 15 de mayo de 2013; Aceptado: September 16, 2013; Publicado: 25 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Nguyen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los estudios en este manuscrito fueron parcialmente financiado por Exelixis Inc. Dos de los co-autores (DTA) y FS son empleados de Exelixis. Ellos estuvieron involucrados en el diseño del estudio, análisis de datos y en la preparación manuscrito
Conflicto de intereses:. Este estudio fue financiado en parte por Exelixis Inc., el empresario de Frauke Schimmoller y Dana T. Aftab. Eva Corey ha recibido fondos de investigación de Exelixis, Inc., a través de un acuerdo de investigación patrocinados con la Universidad de Washington. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
Las metástasis siguen siendo la principal causa de morbilidad y la mortalidad en los hombres que sufren de cáncer de próstata avanzado (PCA). A pesar de los agentes existentes que son eficaces contra el CaP avanzado, la supervivencia después del desarrollo de la resistencia a la castración queda muy corto. Por lo tanto, se necesitan nuevos tratamientos eficaces contra la enfermedad metastásica y resistente a la castración con urgencia.
Cabozantinib es un potente inhibidor de tirosina quinasas receptoras, incluyendo MET y VEGF receptor 2 (VEGFR2). Otros objetivos incluyen cabozantinib inhibidas por AXL, FLT-3, KIT, y RET [1,2]. Los efectos de cabozantinib han sido evaluadas en el entorno preclínico en múltiples tipos de cáncer, incluyendo glioma, de mama, de pulmón, y cáncer de páncreas. En estos estudios, cabozantinib reduce la invasividad tumoral, la proliferación y la angiogénesis y aumentar la apoptosis [1,2]. Los estudios preclínicos en un modelo de cáncer de páncreas neuroendocrino han proporcionado alguna información sobre los mecanismos de acción cabozantinib, lo que sugiere un equilibrio funcional entre MET y VEGFR2 mediante la participación de HIF1A [2-5]. Sin embargo, los mecanismos que involucran a otros objetivos de cabozantinib, como RET, un objetivo importante en el carcinoma medular de tiroides [6,7], y Axl o kit, no se han examinado o informado ampliamente. Dadas las funciones de estas quinasas en la biología del tumor, la inhibición cabozantinib de cualquier o todos estos objetivos puede ser beneficioso para el tratamiento de CaP al atacar las células tumorales en múltiples frentes. Este tipo de ataque podría potencialmente dirigir con eficacia las poblaciones de células heterogéneas, tales como los de CaP.
Cabozantinib fue aprobado recientemente por la FDA para el tratamiento clínico de cáncer progresivo, metastásico medular de tiroides. Esta aprobación siguió a las primeras observaciones de la actividad cabozantinib contra esta enfermedad en la fase inicial I estudio clínico [5]. Cabozantinib también ha demostrado resultados alentadores en pacientes con carcinoma metastásico, resistente a la castración CaP (CRPC) en una II interrupción del ensayo aleatorizado de fase adaptativa. Se observaron mejoras sustanciales en la gammagrafía ósea en el 68% de los pacientes evaluables. Por otra parte, el 72% mostró regresión de las lesiones de tejidos blandos, y el 67% experimentó una mejoría del dolor óseo [3]. Sin embargo, es importante señalar que a las 12 semanas de la tasa de respuesta objetiva fue del 5%, y 75% de los pacientes mostraron enfermedad estable [3]. Sin embargo, ningún otro agente ha demostrado que esta constelación de efectos en hombres con CRPC, lo que indica un mecanismo potencialmente único de acción para cabozantinib en este entorno de enfermedad.
MET y su ligando, el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), han sido implicados en la progresión de muchos tipos de cáncer. la señalización de MET promueve la supervivencia celular, la proliferación, invasión, metástasis y angiogénesis
in vivo
y
in vitro
[8]. En el CP, MET se expresa en el CaP primario, y se detectan niveles altos de expresión en las metástasis en los huesos CaP [9-11]. Además, la expresión de MET se asoció con el grado de CaP, la puntuación de Gleason y mal pronóstico [9], y los niveles plasmáticos elevados de HGF resultaron ser un indicador de mal pronóstico en pacientes con CaP [12]. Además, los resultados preclínicos han demostrado la diafonía entre el receptor de andrógenos (AR) y la señalización de MET, con la señalización de AR que resulta en la inhibición directa de MET expresión [13,14]. Por lo tanto, la regulación positiva de la señalización de MET puede estar asociada con la progresión de la PCa a la resistencia a la castración. En consecuencia, varios nuevos inhibidores de MET se están desarrollando contra diversos tipos de cáncer, incluyendo CaP [15]. Sin embargo, una revisión de la literatura actual mostró resultados mixtos de inhibición MET en el CaP. Los inhibidores de la MET PHA-665752 y PF2341066 inhibieron el crecimiento de células de CaP [16], y desmontables expresión de MET por un adenovirus inhibe el crecimiento del CP y de los ganglios linfáticos (LN) metástasis [17]. En contraste BMS-777607, otro inhibidor de MET, no afectó significativamente la proliferación de células de CaP, pero inhibido su capacidad de invasión y la migración [18]. En la clínica, una serie de agentes que se dirigen selectivamente MET no han demostrado un beneficio clínico sustancial en pacientes con CRPC [19,20].
VEGFR2 también juega un papel importante en varios tipos de cáncer, incluyendo el CaP. la señalización de VEGFR es central en la regulación de la angiogénesis y se incrementa en las lesiones metastásicas CRPC [21]. Además, los niveles de plasma y orina elevados de VEGF están asociados con un mal pronóstico en el CaP [22,23]. Por lo tanto, la señalización /VEGFR2 VEGF ha sido un objetivo para nuevas terapias contra el cáncer. La inhibición de la vía de VEGF se redujo el crecimiento del tumor y la vasculatura en un modelo de cáncer de los islotes pancreáticos, aunque este efecto no se mantuvo y los tumores con el tiempo se repitió [24]. Un ensayo clínico de bevacizumab, un anticuerpo monoclonal anti-VEGF recombinante, en combinación con quimioterapia mostraron aumento de la supervivencia libre de progresión en comparación con el placebo más quimioterapia. Sin embargo, esta combinación de tratamiento no mejoró significativamente la supervivencia global en comparación con el grupo de control [25]. Las respuestas limitadas y la resistencia adquirida a la terapia anti-VEGF sugieren que, si bien la angiogénesis a través VEGF es un importante objetivo para terapias contra el cáncer, el desarrollo de nuevos fármacos en forma exitosa se requiere una comprensión más profunda de los factores que facilitan el escape de la terapia anti-angiogénico y permitir la continuación de la supervivencia del tumor y vascularización. Con esto en mente, los aumentos en la actividad de MET se han detectado en respuesta a la terapia anti-angiogénica y la hipoxia [26,27]. administración continuada de la sunitinib inhibidor de VEGF aumentó la expresión de HGF en un modelo de tumor murino, y sunitinib fue ineficaz cuando HGF se coadministró [28,29]. Además, el VEGF se ha demostrado que activar directamente MET señalización a través de la neuropilina-1 en el CaP independiente de HGF [11]. Estos resultados demuestran una acción sinérgica entre las vías de señalización de VEGF y MET y sugieren que una terapia dirigida tanto de estas vías, tales como cabozantinib, podría ser de gran importancia en el CaP avanzado.
El objetivo fue determinar los niveles de expresión de los objetivos primarios de cabozantinib en el CaP avanzado y evaluar sus efectos sobre los tumores subcutáneos ACC y las que crecen en el hueso, específicamente en lo que respecta a la carga tumoral y el recambio óseo. Nuestros resultados muestran que los objetivos de cabozantinib se expresan en las metástasis CaP y que cabozantinib inhibe el crecimiento del tumor en el hueso y los tejidos blandos y presenta efectos beneficiosos sobre el hueso tanto en ratones machos enteros y castrados.
Materiales y Métodos
Todos los tejidos humanos se obtuvieron de pacientes que firmaron el consentimiento informado y sobre la aprobación de la Universidad de Washington IRB. Todos los estudios con animales descritos en este manuscrito fueron aprobados por y realizado de acuerdo con la Universidad de Washington Institucional Cuidado de Animales y empleo directrices del Comité y de los NIH.
La inmunohistoquímica (IHC)
microarrays de tejidos (TMA) se utilizaron para determinar MET, P-MET, y inmunorreactividad VEGFR2 en la próstata normal (NP) y CP: 1) UWTMA48: NP y la hiperplasia benigna de próstata (60 tejidos, dos núcleos por tejido) y CaP primario (61 tejidos, dos núcleos por tejido); 2) UWTMA52: emparejado NP y PCA de pacientes recurrentes y no recurrentes (63 recurrente y 64 pacientes no recurrentes, dos núcleos para cada NP y PCA); 3) UWTMA21: CP metástasis de 44 pacientes (metástasis óseas 40; metástasis hepáticas 19; 27; metástasis LN y otros 7 metástasis de tejidos blandos, dos núcleos por los tejidos); y 4) UWTMA48: 24 modelos de xenoinjertos LuCaP de PCA de animales tratados con docetaxel intactos, y castrados (tres núcleos por el tejido). IHC se realizó usando procedimientos estándar con la recuperación de antígenos [30]. Un anticuerpo monoclonal de ratón anti-MET anticuerpo (donación del Dr. Knudsen [31]), un (Cell Signaling, Boston, MA) de anticuerpos anti-P-MET monoclonal de conejo y un anticuerpo policlonal de conejo anti-VEGFR2 anticuerpo (Señalización Celular, 55B11, se han usado Boston, MA). inmunotinción específica fue evaluada por un patólogo (XZ) utilizando una escala de tres puntos: 2 = intenso, 1 = débil, y 0 = ausente, y se estimó el porcentaje de células en cada intensidad.
El análisis estadístico de IHC
Para cada núcleo en cada TMA, un índice de tinción fue construido como una combinación ponderada de las intensidades de tinción de 3 puntos, con pesos dados por el porcentaje de tinción de tejidos en cada intensidad; ver Métodos S1. El índice de tinción calculado es un valor en el intervalo [0, 1], donde 1 significa 100% de células teñidas intensamente. modelos lineales mixtos eran aptos para el índice de tinción condicionada a la ubicación de la metástasis con efectos aleatorios para cada paciente o animal. Tras la evaluación de los supuestos del modelo y la transformación de datos según sea necesario, los modelos ajustados fueron utilizados para cuantificar las diferencias en la inmunorreactividad entre las localizaciones metastásicas y probar la significación estadística. perfiles gráficos que ilustran las distribuciones de intensidad de la tinción se construyeron mediante el cálculo de promedios simples para todos los tramos que no faltan en cada categoría de tinción. Se evaluaron las asociaciones entre la expresión de las proteínas y los parámetros clínicos usando modelos de regresión lineal, y las asociaciones con el tiempo hasta la recurrencia de PSA fueron evaluados utilizando la fragilidad (efectos aleatorios riesgos proporcionales de Cox) modelos.
Las líneas celulares
células C4-2B (Urocor, Inc., Oklahoma City, OK) y células MC3T3 (ATCC, Manassas, VA) se mantuvieron bajo condiciones de cultivo de tejidos estándar. células C4-2B se cultivaron en RPMI 1640 y 10% de suero bovino fetal (FBS), y se cultivaron las células MC3T3 en DMEM con 10% de FBS. El LuCaP 23.1 CaP xenoinjerto se mantuvo y pases seriados en ratones CB17 SCID [32]
Los estudios en animales
Estudio 1:.. Intratibial LuCaP 23.1, 60 mg /kg cabozantinib
de seis semanas de edad, los ratones SCID de color beige macho intacto (Charles River, Wilmington, MA) fueron inyectados con una suspensión de una sola célula LuCaP 23.1 en la tibia proximal derecha tal como se publicó anteriormente [33]. Se inyectaron 200.000 LuCaP 23.1 células en 20 l de RPMI 1640 en la tibia proximal derecha. Los animales fueron asignados al azar en un grupo de control (n = 5) o cabozantinib grupo (n = 5), cuando los niveles de PSA en suero alcanzaron niveles detectables (0,6 ng /ml, el ensayo AxSYM total PSA, Abbott Laboratories, Abbot Park, IL). Cabozantinib se disolvió en H
2O y se administró por sonda oral a 60 mg /kg, cinco veces a la semana durante seis semanas. Los animales de control recibieron alimentación forzada con H
2O solamente. los niveles séricos de PSA y los pesos corporales se midieron semanalmente. Después del sacrificio, tibias y portadores de tumor contralateral normal de las tibias fueron recogidos y procesados para análisis
Estudio 2:.. Intratibial C4-2B, 60 mg /kg cabozantinib
El diseño del estudio fue el mismo que para estudiar 1, excepto que los animales fueron castrados y se inyectaron células C4-2B en tibias dos semanas post-castración [34]. células C4-2B se cosecharon cuando ~ 50% de confluencia, y se inyectaron 200.000 células en cada tibia. Los animales fueron asignados al azar en un grupo de control (n = 11) o un grupo cabozantinib (n = 10).
Estudio 3: C4-2B subcutánea, 60 mg /kg cabozantinib
C4-2B. (2x10
6, 1: 1 con Matrigel) células se inyectaron por vía subcutánea en ratones macho castrado . Los animales fueron asignados al azar en un grupo de control (n = 8) o un grupo cabozantinib (n = 12) cuando el volumen del tumor alcanzó 100 mm
3. 60 mg /kg cabozantinib se administró por sonda oral cinco veces a la semana durante un máximo de nueve semanas. Los animales fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron 1.000 mm
3 o cuando los animales se vean comprometidos.
Estudio 4:. intratibial LuCaP 23.1, 30 mg /kg cabozantinib
El diseño del estudio fue el mismo que en el estudio 1, excepto que una dosis más baja de cabozantinib (30 mg /kg) fue utilizado y el tratamiento duró hasta 15 semanas. Los animales fueron distribuidos aleatoriamente en un grupo control (n = 10) o un grupo cabozantinib (n = 10).
Micro-CT
A 40 escáner de alta resolución μCT Scanco vivaCT se utilizó para analizar una sección de 0,85 mm que abarca la metáfisis proximal de la tibia de la tibia contralateral portadores de tumor y no portadores de tumor (LuCaP 23,1: n = 3-5; C4-2B: n = 5 a 10 por grupo). Se determinaron el volumen de hueso (BV), volumen de tejido (TV), la separación trabecular (Tb.Sp), espesor trabecular (Tb.Th), y el número trabecular (Tb.N) y se calculó el BV /TV. analiza
estadístico de los estudios en animales
mediciones tumorales longitudinales y los niveles séricos de PSA se log-transformado y modelaron usando modelos lineales mixtos condicionales en el grupo de tratamiento con efectos aleatorios para cada animal; ver Métodos S1. Tras una evaluación de diagnóstico estándar de ajuste del modelo, simulamos 1000 conjuntos de datos de cada modelo tted fi, calculó la media empírica y los límites de confianza del 95% en cada momento, y re fi cio a los modelos de estos conjuntos de datos. Los resultados finales representan medios y 95% límites de con fi anza de 1000 repeticiones de arranque. A raíz de los controles estándar de los supuestos del modelo, se aplicaron 2 caras pruebas t para probar las diferencias en niveles séricos de PSA, volumen tumoral, el peso corporal y los niveles de índice de tinción IHC. La significación estadística de las diferencias en los parámetros de hueso se determinó usando un ensayo t de 2 caras.
análisis RT-PCR
extracción de ARN, síntesis de ADNc, y qPCR se realizaron como se describe anteriormente [ ,,,0],35]. Los cebadores y condiciones de recocido se enumeran en la Tabla S1. Se extrajo ARN de tumores subcutáneos. Expresión relativa de los mensajes de destino se determina en base a la dilución de cuatro veces de los ADNc de calibrador. Utilizamos LNCaP ADNc para RET; PC-3 ADNc para MET, AXL y KIT, y LuCaP 23,1 ADNc de VEGFR2 murino (VEGFR2m). señales específicas se normalizaron a los niveles Rpl13a.
Los experimentos in vitro
Se evaluaron los efectos de cabozantinib sobre la proliferación, la mineralización, la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP), y Ar actividad transcripcional
in vitro
como se describe anteriormente [36]; ver Métodos S1.
Resultados
Los niveles de MET, P-MET y VEGFR2 durante la progresión del CaP
Para determinar si los objetivos se expresan en cabozantinib CaP, se evaluaron los niveles de MET, P-MET, y VEGFR2 en los tejidos de la próstata normal y que representan diferentes etapas de la progresión del CaP.
NP vs CaP primaria
MET y P-MET:. Nuestros resultados mostraron que el MET está presente en altos niveles en el PN y células de CaP primarias, pero sólo había evidencia marginal de las diferencias entre estos tejidos (media del índice de tinción NP: 0,96; IC del 95%: 0,93 a 0,98; CP: 0,92; IC del 95%: 0,88 a 0,96; P = 0,06); véase la figura S1. A pesar de los altos niveles de MET en NP y CaP, se detectó inmunorreactividad mínima de P-MET en estos tejidos, y no hubo pruebas de diferencias entre estos tejidos (media tinción índice NP: CI 0,16, 95% 0,00-0,32; PCa: IC del 95% 0,00 hasta 0,27;; 0,11 P = 0,49); véase la figura S1. No hubo evidencia de que el TEM o P-MET inmunoreactividad se asoció con el riesgo de recurrencia bioquímica después de controlar por edad, grado de Gleason, y el volumen del tumor
VEGFR2:. Normal las células epiteliales de la próstata y células de CaP ambos mostraron una baja inmunorreactividad VEGFR2 , y no había evidencia marginal de la más alta VEGFR2 en el CaP vs NP (media del índice de tinción NP: 0,03; IC del 95% ,00-,05; CP: 0,07; IC del 95%: 0,03 hasta 0,11; P = 0,02); véase la figura S1. tinción fuerte estaba presente en el estroma y la vasculatura tanto de NP y CaP. Al igual que en el trato de economía, no había pruebas de que la expresión de VEGFR2 se asoció con el riesgo de recurrencia de PSA después de controlar por edad, grado de Gleason, y el volumen del tumor.
Primaria del CP vs metástasis
.
Debido a los aumentos registrados en las metástasis de MET CaP [12], nos propusimos evaluar si este aumento puede detectarse en los tejidos de nuestra cohorte de pacientes. Para esta comparación, se utilizaron los resultados de las metástasis en TMA 21 y los resultados combinados de los tejidos de PCA de UWTMA48 y UWTMA52 (127 pacientes). MET se detectó en las metástasis CaP con una fuerte evidencia de una mayor tinción inmunoreactividad en las metástasis óseas (BM) en comparación con el CP primaria (media tinción primaria índice CP: 0,83; IC del 95%: 0,82-0,87; BM: 0,94; IC del 95%: 0,89 a 0,98 ; P = 0,0002); véase la Figura 1. Por el contrario, los niveles de MET fueron significativamente inferiores en todas las metástasis de tejido blando en comparación con CaP primaria (media tinción índice de hígado: 0,70; IC del 95% desde 0,62 hasta 0,77, P & lt; 0,0001; LN: 0,78; IC del 95%: 0,71 a 0,83 , P & lt; 0,0001; otro suave:. 0,79, IC del 95% 0,67-0,93, P = 0,01)
IHC y los análisis se realizaron como se describe en la sección Métodos. perfiles gráficos que ilustran las distribuciones de intensidad de la tinción se construyeron mediante el cálculo de promedios simples para todos los tramos que no faltan en cada categoría de tinción. En cada sitio, la media del índice de tinción está marcado por un círculo de color naranja lleno y barras de color naranja representan el 95% IC. Los ejemplos representativos de tinción se muestran para cada proteína. A. MET se expresa fuertemente en tanto primario y metastásico CaP, aunque se aumentó significativamente en BM y la disminución en las metástasis de los tejidos blandos en comparación con CaP primario. B. niveles de P-MET son más altos en el BM, LN y otras metástasis de tejidos blandos, mientras que ninguna alteración se detectó en las metástasis hepáticas en comparación con CaP primario. C. expresión de VEGFR2 se incrementa significativamente a través de las lesiones metastásicas CaP en comparación con CaP primario. Las imágenes fueron tomadas a 400 aumentos
P-MET se detectó en el CaP metástasis con una fuerte evidencia de una mayor inmunoreactividad en comparación con BM CaP primaria (media tinción primaria índice de CaP:. 0,22, IC del 95%: 0,17 -0,26; BM: CI 0,37, 95% 0,30-0,45; p = 0,003); ver Figura 1. Los niveles de P-MET también fueron más altos en todas las metástasis de tejido blando en comparación con CaP primario, aunque no todas las diferencias fueron significativas (media tinción de hígado índice: 0.28, IC 95% 0,13-0,38; p = 0,35; LN: 0,46; 95% IC 0,35 hasta 0,56, P = 0,0001; otra blanda:. 0,51; IC del 95%: 0,27 a 0,70; p = 0,006)
VEGFR2 se detectó en el CaP con metástasis muy fuerte evidencia de una mayor inmunoreactividad en comparación BM de CaP primaria (media tinción primaria índice CP: 0,10; IC del 95%: 0,07-0,14; BM: 0,25; IC del 95%: 0,19-0,31; p = 0,0001); véase la Figura 1. Los niveles de VEGFR2 también fueron más altos en todas las metástasis de tejido blando en comparación con CaP primario, aunque no todas las diferencias fueron significativas (media tinción de hígado índice: 0.29, IC 95% 0,17-0,38; p = 0,0005; LN: 0,40; 95% CI 0,29 a 0,46, P & lt; 0,0001; otro suave: CI 0,19, 95% 0,04 a 0,38, P = 0,28)
metástasis CaP
Desde el microambiente influye en la expresión génica.. los perfiles de las células tumorales, también analizaron los niveles de expresión de MET por el sitio metastásico. Los niveles de MET fueron significativamente mayores en comparación con BM en el hígado, LN, y otras metástasis de tejidos blandos (media tinción índice BM: 0,94, IC 95%: 0,91-0,98, con una media de tinción de hígado índice: 0.59, IC 95% 0,52-0,66, P & lt; 0,0001; LN: 0,67, 95% CI 0,61-0,73, P & lt; 0,0001; otra blanda:. 0,68, IC 95% 0,57 a 0,83; p & lt; 0,0001)
Los niveles de P-MET eran débilmente o no significativamente diferente en el BM en comparación con el hígado, LN, y otras metástasis de tejidos blandos (media tinción índice BM: 0.37, IC 95%: 0,32 a 0,44; hígado: 0,28; IC del 95%: 0,13 a 0,36; p = 0,10; LN : 0,46; IC del 95%: 0,34 a 0,53; p = 0,05; blandos otro: 51%, 95% IC 0,27 a 0,69); véase la Figura 1. Sin embargo, debido al diferente tratamiento de BM y metástasis de tejidos blandos (BM procesamiento requiere descalcificación) y la baja estabilidad de la fosforilación en condiciones ácidas, los niveles reales de P-MET en realidad podría ser mayor en el BM que nuestros datos indican.
Los niveles de VEGFR2 fueron significativamente diferentes en el BM en comparación con metástasis LN (media tinción índice BM: CI 0,25, 95% desde 0,21 hasta 0,31; LN: 0.40, IC 95% 0,30-0,45, P & lt; 0,0001), pero no el hígado u otras metástasis de tejido blando.
Las asociaciones entre el MET, P-MET, y el índice de tinción VEGFR2 y AR, PSA y PSMA.
diafonía entre AR, MET y la señalización de VEGFR2 se ha informado en CRPC
(13,14 ). Por lo tanto, se evaluaron las asociaciones entre MET, P-MET y tinción VEGFR2 (determinada en este estudio) y AR, PSA, y la tinción PSMA (a partir de datos históricos) en las metástasis. Nuestro análisis, que se basa en un modelo mixto lineal (ver Métodos S1), no detectó ninguna asociación significativa entre cualquiera de los pares de las proteínas seleccionadas en BM o metástasis de tejidos blandos (datos no mostrados).
objetivos cabozantinib en xenoinjertos de CaP
qPCR.
Para determinar la expresión de objetivos cabozantinib seleccionados en el CP, se evaluaron los niveles de MET, VEGFR2 murino, AXL, KIT, y ARNm RET en 24 diferentes xenoinjertos LuCaP CaP que modelan de cerca la heterogeneidad de CaP en los seres humanos [37]. Nuestros resultados muestran que qPCR todos los objetivos cabozantinib se expresan en estos modelos a diferentes niveles; véase la Figura S2A. La estratificación de los modelos de tumores neuroendocrinos (NE) y el adenocarcinoma (AD) reveló alta a moderada evidencia de niveles más altos de todos los objetivos en modelos NE Lucap (n = 4), en comparación con los modelos de AD (n = 20) Véase la Figura S2 B. Dado que la diafonía entre AR, MET, y la señalización de VEGFR2 se ha informado, que también examinó si la expresión de objetivos cabozantinib se correlaciona con la expresión de AR o respuestas a la castración. Con este fin, se clasificaron los xenoinjertos como "muy sensible a la castración" si la castración resultó en un beneficio de supervivencia más de 3 veces. Nuestros análisis no revelaron asociaciones significativas entre los niveles de AR y los objetivos cabozantinib. Por otra parte, mientras que los niveles medios de mRNA de los objetivos cabozantinib fueron mayores en los modelos que no responden bien a la castración, estas diferencias no alcanzaron significación.
IHC.
Para obtener una mejor comprensión de la cabozantinib efectos potenciales en pacientes con CRPC avanzada que están en ADT y /o tratadas con docetaxel, se examinaron los niveles de MET, P-MET, y VEGFR2 en tumores Lucap de animales intactos, castrados y tratados con docetaxel. Nuestros análisis muestran pruebas moderadas de que MET y P-MET niveles de expresión tienen una correlación negativa entre los tipos de tumor (r = 0,29; p = 0,02), y la evidencia marginal de que la media MET y P-MET índices de tinción son 5-6% mayor en los tumores después de tratamiento con docetaxel que en los tumores de los animales intactos (P = 0,08 y P = 0,05, respectivamente). Nuestros análisis no revelaron ninguna evidencia de que los niveles de expresión de cualquier otro par de proteínas están correlacionados a través o dentro de los tipos de tumores (todos p & gt; 0,14), que significa índices de tinción MET y P-MET son diferentes entre los tumores recogidos a partir intacto y castrar a los animales, ni que decir índices de tinción MET y P-MET difieren significativamente entre los xenoinjertos Lucap que muestran una respuesta alta y baja a la castración; véase la Figura S2C. VEGFR2 no mostró ninguna inmunorreactividad significativa en las células tumorales en nuestros modelos.
Eficacia preclínica Estudios
Para aumentar nuestra comprensión de los efectos de cabozantinib en las metástasis óseas CaP, se examinaron sus efectos sobre el PSA sérico, el peso corporal y el recambio óseo en los modelos de crecimiento de CaP en el hueso. Del mismo modo, se evaluó los cambios en el PSA sérico, el volumen del tumor, y el peso corporal en respuesta al tratamiento en los animales con tumores subcutáneos.
Cabozantinib inhibe el crecimiento del tumor en el hueso.
Para evaluar la eficacia de cabozantinib en el crecimiento del CP en el hueso, se trataron intacta o castran animales teniendo intratibial LuCaP 23.1 o tumores C4-2B, respectivamente. Se seleccionaron estos dos modelos, ya LuCaP 23,1 provoca una reacción osteoblástica pronunciada y C4-2B provoca una respuesta osteoblástica /osteolítica mixta. Por otra parte, el 23,1 LuCaP representa andrógeno-sensibles, mientras que el CP C4-2B representa la enfermedad resistente a la castración. Nuestros resultados muestran que la qPCR MET, VEGFR2m, KIT, RET y Axl se expresan en LuCaP 23.1. En los tumores C4-2B detectamos VEGFR2m, AXL y RET, niveles muy bajos de MET y no hay señal de KIT (los resultados se muestran en la Figura 2A). La expresión de estos receptores en Lucap 23.1 y C4-2B tumores apoyan la hipótesis de que cabozantinib alterará la biología de estos tumores. Cabozantinib (60 mg /kg) inhibió el crecimiento de los tumores en el hueso como se demostró por las disminuciones en los niveles de PSA en suero; véase la Figura 2B. cambios semanales del PSA sérico fueron significativamente diferentes entre los grupos de control y cabozantinib en el modelo LuCaP 23,1 (P & lt; 0,0001), donde el PSA aumentó en un 76% por semana en el grupo de control, pero un 0,2% por semana en el grupo cabozantinib. cambios de PSA también fueron significativamente diferentes entre los grupos de control y cabozantinib en el modelo C4-2B (P = 0,0066), donde PSA aumentó en un 35% por semana en el grupo de control, pero disminuyó un 2,9% por semana en el grupo cabozantinib. Cabozantinib proliferación también inhibió de las células viables restantes en los tumores en base a la tinción de BrdU; véase la Figura 2C. La inhibición de la progresión del tumor fue también evidente cuando se evaluó AR y PSA inmunorreactividad; Lucap 23.1 y C4-2B tumores de animales tratados con cabozantinib mostraron tinción menos intensa AR y PSA en las células tumorales restantes, así como grandes áreas necróticas; véase la figura 2D & amp; células de E. C4-2B expresan niveles bajos de PSA como se ve en la figura 2B y que también se refleja en mucho menor inmunorreactividad de PSA en estas células tumorales.
A. Los niveles de receptores cabozantinib en LuCaP 23.1 y tumores subcutáneos C4-2B. qPCR se utiliza en ARN aislado de tumores subcutáneos para determinar los niveles de expresión de MET, VEGFR2m, AXL, RET y KIT. Para calibrar la señal se utilizó la dilución de cuatro veces de LNCaP ADNc (RET), PC-3 ADNc (MET, AXL, KIT) y LuCaP 23.1 (VEGFR2m). Selección del cDNA calibrador se basa en la señal para cada mensaje específico. La señal se normalizó a Rpl13a limpieza de genes. Nuestros resultados indican que LuCaP 23.1 tumores expresan todos los objetivos cabozantinib y los tumores expresan C4-2B VEGFR2m, AXL y RET, los bajos niveles de MET, y ningún KIT. En estos experimentos qPCR, que mide los niveles relativos de las transcripciones de destino y no sus números reales, por lo tanto, no podemos comparar los niveles de expresión de los diferentes objetivos entre sí, y comenta si RET, que dio la señal más alta, podría expresarse en mayor copia número vs MET, y por lo tanto es más importante en estos modelos.
B. Los modelos lineales de crecimiento muestran PSA que cabozantinib disminuye los niveles de PSA en ambos LuCaP 23.1 y resistentes a la castración modelos C4-2B sensibles a los andrógenos. C. BrdU tinción de tibias muestra que cabozantinib disminuye la proliferación de las células tumorales sensibles a los andrógenos y resistentes a la castración en el hueso, se utilizó la prueba t de 2 caras para determinar la significación de las diferencias. Húmedo; E. AR y PSA inmunoreactividad está presente en los tumores de control. tratamiento Cabozantinib dio lugar a disminuciones en la inmunorreactividad AR y PSA en ambos modelos (LuCaP 23,1 (D) y C4-2B (E)). células C4-2B expresan niveles más bajos de PSA en comparación con LuCaP 23,1, y la tinción es más débil en estos tumores. Además, grandes áreas de necrosis de tumor están presentes en la tibia tratada (marcado por asterics rojos). F. 60 mg /kg cabozantinib es bien tolerado hasta 4 semanas en 23.1 animales sensibles a los andrógenos LuCaP. Después de este periodo significativo BW disminuye vs. fueron detectados de control (hasta 17%), pero debido a la variación y el número de animales, estas disminuciones no alcanzó significación. 60 mg /kg cabozantinib es bien tolerado hasta 5 semanas en el modelo C4-2B resistente a la castración, con una disminución significativa del 12% en la semana 6. La significancia se determinó mediante la comparación BW inscripción a BW en cada semana usando 2-sided t- prueba. La media ± SEM de los grupos se representa gráficamente.
Cabozantinib altera la remodelación ósea en el hueso portadores de tumor.
Se realizó un análisis detallado de los efectos de cabozantinib en el microambiente óseo /tumor mediante μCT. Hemos elegido este tipo de análisis en lugar de análisis de histomorfometría porque μCT evalúa toda la tibia en 3D mientras histomorfometría análisis se realizan por lo general en una sola sección longitudal 2D de la tibia. El análisis de hueso trabecular mostró que LuCaP 23.1 resultados de crecimiento en un aumento significativo en el volumen de hueso (tibias portadores de tumor: 0,42 ± 0,06 (media ± SEM); tibias normales: 0,09 ± 0,01; aumento de 5 veces en la BV /TV, P = 0,02) . Estos aumentos fueron atenuadas por cabozantinib, resultando en una disminución de 52% en BV /TV, en comparación con el control LuCaP 23,1 tibias. Esta disminución se reflejó en el número trabecular alterada (Tb.N), el grosor trabecular (Tb.Th), y la separación trabecular (Tb.Sp); véase la Tabla 1. El crecimiento en el hueso C4-2B también dio lugar a pruebas moderadas de BV aumenta /TV (40% de aumento, P = 0,06).