Extracto
calicreınas de tejido humano (KLKs) son miembros de una familia de múltiples genes de proteasas de serina expresado de forma aberrante en muchos tipos de cáncer. En el cáncer de ovario, 12 KLKs están regulados por incremento, y de los que KLK5, 6 y 10 han sido el foco de la investigación de nuevos biomarcadores de diagnóstico y pronóstico. Sin embargo, poco se sabe acerca de las contribuciones de KLK5, 6 y 10 a la fisiopatología del cáncer de ovario.
En este estudio, un panel de 13 líneas celulares de cáncer de ovario humanos se proyectó por ELISA para la secreción de KLK5, 6, 8 , 10, 13, y 14. La línea celular ES-2, desprovisto de estas calicreínas, se transfectó con vectores de expresión de KLK5, 6 y 10 individualmente o en pares. Co-expresión de KLK5, 6 y 10 se correlaciona con la agresividad disminuido de líneas celulares de cáncer de ovario tal como se define por la formación de colonias reducido en agar blando y la tumorigenicidad en ratones desnudos. ES-2 clones que sobreexpresan KLK5, 10/5, 10/6, 5/6 hecho significativamente menos colonias en agar blando. Cuando se compara con los ratones de control, la supervivencia de los ratones inyectados con ES-2 clones que sobreexpresan KLK10, 10/5, 10/6, 5/6 fue significativamente más largo, mientras que KLK6 fue más corto. Todos los grupos que muestran una ventaja de supervivencia también difieren cuantitativa y cualitativamente en su presentación de la ascitis, tanto con una menor incidencia de la ascitis y la ausencia de agregados celulares dentro de esas ascitis. La ventaja de supervivencia conferida por KLK10 sobreexpresión podría recapitula con la administración exógena de un KLK10 recombinante. En conclusión, estos resultados indican que KLK5, 6 y 10 puede modular la progresión del cáncer de ovario, e interactuar juntos para alterar fisiopatología tumor. Además, los resultados apoyan el papel putativo de KLK10 como un supresor de tumores y sugieren que podría tener un potencial terapéutico en el cáncer de ovario
Visto:. Pépin D, Shao ZQ, HUPPE G, Wakefield A, Chu CW, Sharif Z, et al. (2011) calicreínas 5, 6 y 10 diferencialmente Alter Fisiopatología y la supervivencia global en un modelo de xenoinjerto de cáncer de ovario. PLoS ONE 6 (11): e26075. doi: 10.1371 /journal.pone.0026075
Editor: Rakesh K. Srivastava, de la Universidad de Kansas Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de mayo de 2011; Aceptado: 19 de septiembre de 2011; Publicado: 15 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Pépin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por una beca de la beca Ontario Licenciado en Ciencia y Tecnología de D. Pépin. Esta fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. financiación principal de la investigación fue proporcionada por IBEX Pharmaceuticals, Inc., que emplea a algunos de los autores que han contribuido al diseño de los estudios y la recopilación y análisis de datos. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio
Conflicto de intereses:. Z.-Q. Shao, G. HUPPE, A. Wakefield y C.-W. Chu eran empleados del IBEX Pharmaceuticals, Inc., en el momento de la recogida de datos. D. Pépin, Z. Sharif y A.C. Vanderhyden están actualmente empleado por IBEX Pharmaceuticals, Inc. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados que declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Los calicreınas tejido recientemente descubiertos son una familia de serina proteasas secretadas que abarcan 15 miembros (KLK1- 15) cuyos genes (KLK1-15) son agrupados en tándem en una región 300 kb en el cromosoma 19q13.4 [1]. proteínas KLK se detectan en muchos fluidos biológicos como la sangre, plasma seminal, sudor, saliva, líquido cefalorraquídeo, leche, y los espacios intersticiales en el que se pueden activar y /o inactivados por escisión enzimática [2]. KLKs escinden una amplia gama de sustratos que incluyen proteínas de la matriz extracelular (ECM), proteínas de unión a factor de crecimiento similar a la insulina, los receptores activados por proteasa (PAR), otras calicreínas y incluso a sí mismos [2]. Por otra parte, KLKs se expresan a menudo en grupos, tales como KLK3, 4, 5, 6, 8, 10, 13 y 14 en la mama o KLK2, 3, 4, 5, 11, y 15 en la [2] de próstata. Estas observaciones han llevado a la hipótesis de que calicreínas pueden actuar en una cascada para mediar sus efectos biológicos, también conocido como el activome KLK [3]. Por ejemplo, la evidencia preliminar sugiere que KLK5 puede ser un iniciador de cascadas KLK, capaz de activar pro-KLK2, 3, 6, 7, 11, 12, 14, lo que resulta en la degradación de componentes de la MEC de semen, y licuefacción [4] .
calicreínas han sido implicados en una serie de enfermedades tales como la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis múltiple [5], [6], la enfermedad inflamatoria intestinal [7], la artritis [8], sepsis [9], diabetes [10 ], enfermedades de la piel [11] y el cáncer [12]. Debido KLKs se secretan y fácilmente detectable en los fluidos biológicos, que han surgido como biomarcadores potencialmente valiosos, en particular en el cáncer, donde KLK3 (también conocido como antígeno específico de la próstata) ha demostrado ser útil para el seguimiento del cáncer de próstata. La mayor expresión KLK está bajo control hormonal, y la capacidad de respuesta de KLK2 y 3 a los andrógenos en líneas celulares de cáncer de próstata [13], y KLK6 y 10 a los estrógenos en las líneas celulares de cáncer de mama está bien documentado [14], [15]. El patrón de expresión de KLKs, así como su regulación hormonal, sugiere que pueden estar involucradas en adenocarcinomas endocrinas del tracto reproductivo como el de próstata, testículos, mama, cervical, y cáncer de ovario.
Evidencia
La acumulación sugiere que al menos 12 de los 15 calicreınas están regulados positivamente en el cáncer de ovario. De ellos, KLK4, 5, 6, 7, 10, y 15 están asociados con pronóstico desfavorable, mientras que la expresión de KLK8, 9, 11, 13, y 14 está asociada con un pronóstico favorable [12]. Este estudio se centra en KLK5, 6 y 10, que se sobreexpresa frecuentemente en el cáncer de ovario y se encuentra en niveles elevados en la ascitis y el suero de los pacientes [16] - [18]. En particular, KLK6 suero y KLK10 son indicadores de mal pronóstico [19], [20], y la alta KLK6 se asocia con menor supervivencia libre de recurrencia y una menor supervivencia global [21]. Los altos niveles de KLK10 en el suero se asocian con tumores serosos etapa avanzada con gran enfermedad residual y la mala respuesta a la quimioterapia [22], mientras que los niveles bajos de KLK10 en el tumor predicen mala supervivencia global [23]. Los subtipos histológicos de cáncer de ovario epitelial, como serosa, mucinoso, endometrioide, de células claras y tumores no diferenciados pueden reflejar ontogenias distintos y se están convirtiendo cada vez más importante en la adaptación de tratamiento [24]. La expresión de KLKs es notablemente similar en todos los subtipos histológicos. Por ejemplo, todos los subtipos expresan KLK6, tal vez con una proporción ligeramente más alta de tumores de células claras que muestran fuerte inmunomarcación para KLK6 [21], [25]. Del mismo modo, los pacientes con tumores de cada subtipo tienen niveles detectables de KLK10 en sus citosol, con una proporción ligera pero significativamente mayor de pacientes de alto KLK10 ser del subtipo seroso [26]. Por último, la expresión KLK5 parece ser más frecuente en los tumores serosos y no diferenciadas [27], [28].
Si bien se sabe poco sobre las bases biológicas de la contribución de KLK5, 6 y 10 del cáncer de ovario, el la capacidad de KLK5 y 6 para escindir proteínas ECM [4], [29], y activar PAR señalización [30], sugieren que están directamente implicados en diversos aspectos de la carcinogénesis. La degradación de los componentes de ECM puede facilitar la separación de las células malignas del tumor y la invasión de los tejidos normales, mientras que algunos de los péptidos liberados ECM pueden tener ambos pro y anti-angiogénicos cualidades [29], [31]. Por otra parte, la señalización de PAR tiene un papel importante en vasoregulación, el crecimiento celular y la inflamación [32], [32,33]. KLK10 fue identificado como un supresor tumoral putativo de mama [34] y el cáncer gástrico [35], y es a menudo silenciado en líneas celulares de cáncer de ovario y tumores [36], a pesar de su expresión en el suero es un marcador pronóstico desfavorable. Esta aparente paradoja es un ejemplo de la dicotomía de calicreınas como ambos reguladores positivos y negativos de los procesos implicados en la carcinogénesis como la angiogénesis, el crecimiento, invasión y metástasis [37].
Mientras que la evidencia de la expresión aberrante de múltiples calicreınas en cáncer de ovario es el montaje, se sabe poco sobre su contribución a la fisiopatología de la enfermedad. Aquí nos presenta el primer intento de desentrañar las contribuciones de KLK5, 6 y 10 en un modelo de xenoinjerto de cáncer de ovario, y el primer uso terapéutico de una proteína de KLK10 recombinante
in vivo.
Materiales Métodos y
cultivo de células
el origen [38], y el tipo de tumores formados en xenoinjertos [39] para las líneas celulares de cáncer de ovario Caov-3 (adenocacinoma [40]), OVCAR -3 (ligeramente diferenciado adenocarcinoma seroso [41]), OVCAR-4 (adenocarcinoma [42]), OV2008 (adenocarcinoma endometreoid con diferenciación escamosa [39]), C13 (adenocarcinoma endometreoid con diferenciación escamosa [39]), OVCA433 (adenocarcinoma [ ,,,0],43]), Skov-3 (adenocarcinoma de células claras [39]), OVCA429 (adenocarcinoma de células claras [39]), Hey (indiferenciado [39]), ES-2 (indiferenciado [39]), OCC-1 (indiferenciadas [ ,,,0],39]), A2780cp (indiferenciado [39]), y A2780s (indiferenciado [39]) utilizados en este estudio, así como sus condiciones de cultivo fueron descritos en una publicación anterior [39]. Las líneas de células HT1080 y NIH3T3, utilizadas como controles, se adquirieron de ATCC (Manassas, VA, EE.UU.) y se cultivaron de acuerdo con sus recomendaciones.
Construcción de líneas de células ES-2 transfectadas de forma estable sobre-expresión de calicreınas
Los plásmidos pcDNA3.1D /V5-His /lacZ (Invitrogen, Mississauga, ON, Canadá) con resistencia a geneticina, y pIRESpuro-2 (Clonetech, VWR, Mississauga, ON, Canadá) con resistencia a la puromicina fueron utilizados como cadenas principales y transfectadas de forma estable en la línea celular ES-2 para proporcionar controles de vectores. En resumen, múltiples clones transfectadas de forma estable con pIRESpuro-2 se utilizaron como controles solo vector, y múltiples clones sucesivamente transfectadas por pcDNA3.1.1D /V5-His /lacZ y pIRESpuro-2 se utilizaron como control doble vector. Los ADNc para KLK5, KLK6 y KLK10, así como la expresión pcDNA-KLK5 construyen en un esqueleto pcDNA3.1D /V5-His-TOPO, fueron amablemente proporcionados por el Dr. E.P. Diamandis (Toronto, ON, Canadá). El vector de expresión KLK10 en pCMV-neo fue proporcionado por Goyal et al. y se ha descrito anteriormente [44]. Brevemente, la amplificación por PCR, digestión de restricción y la ligadura de fragmentos de ADN que representan el ADNc de KLK5, 6, y 10 en los vectores de expresión-2 pIRESpuro se realizaron, y las construcciones resultantes se transfectaron de forma estable en ES-2 células. Un mínimo de 3 clones de cada uno se seleccionaron y se eligió al azar para derivar las respectivas líneas celulares ES-2-KLK5, ES-2-KLK6, y ES-2-KLK10 para
in vivo
experimentos. Para los transfectantes dobles, un mínimo de 3 clones independientes de pCMV-neo que expresan KLK10 se transfectaron adicionalmente con el pIRES-puro-2 expresando KLK5 o KLK6 y uno de cada uno fue elegido al azar para generar, respectivamente, la ES-2-KLK5 /10 y ES líneas-KLK6 -2/10 celulares. La línea celular ES-2-KLK5 /6 se genera a partir de uno de los 3 clones por establemente transfectar la línea celular ES-2-KLK6 con el pcDNA-KLK5 construir. La transfección de células ES-2 se realizó utilizando Lipofectomine ™ 2000 (Invitrogen, Mississauga, ON, Canadá) según el protocolo proporcionado por el fabricante. Se seleccionaron los clones descritos anteriormente y se mantuvieron en medio DMEM (Thermo Scientific, Waltham MA, EE.UU.) que contiene geneticina (400 mg /ml) y /o puromicina (10 mg /ml) (Gibco BRL, Carlsbad, CA, EE.UU.).
Ensayo de proliferación celular
para evaluar la proliferación, el crecimiento celular se analizó en el ES-2 parentales líneas celulares y 3 o más clones establemente transfectadas con construcciones de KLK5, KLK6, KLK10, KLK5 /6, KLK5 /10, KLK6 /10 o el control de vectores usando placas de 12 pocillos con una densidad de cultivo inicial de 10.000 células /pocillo. Después de 96 horas, las células se trataron con tripsina y posteriormente se contaron con un contador Coulter (Beckman Coulter Inc., Fullerton CA, EE.UU.).
Anchorage crecimiento independiente
El protocolo utilizado fue descrito previamente por M. Pace et al [45]. Brevemente, 5 × 10
3 Las células se suspendieron en 3 ml de medio completo que contiene 3,5% de agarosa de bajo punto de fusión y se vierte en la parte superior de la capa inferior de 7% de agarosa en el mismo medio en pocillos de una placa de 6 pocillos. se añadió medio (0,5 ml) a cada pocillo y se cambió cada 2-3 días. Una solución de
p
-iodonitrotetrazolium violeta (1 ml) se añadió a cada pocillo en el día 7 y las colonias se tiñeron durante 24 horas, se contaron y se fotografiaron.
ensayo de invasión
Para el ensayo de invasión en la calicreína sobreexpresión de los clones, que utiliza el sistema de cine transwell 96 System® (Corning, Lowell, MA). Brevemente, el transwells se recubrieron con extractos de membrana de base según las instrucciones del fabricante, y 5 × 10
4 células en medio libre de suero 50 l después se añadieron a la cámara superior, mientras que 150 ml de medios con 10% de suero eran añadido al depósito. La placa se incubó a 37 ° C en 5% de CO
2 ambiente durante 24 horas. Las células que migraron a la parte inferior del inserto se tiñeron con hematoxilina de acuerdo con el protocolo del fabricante, y las membranas se montaron en portaobjetos, analizar con la ScanScope (Aperio, Vista, CA), y la cantidad de píxeles azules se cuantificó usando el aperio de software (aperio, Vista, CA). Los datos se representan como% invasión, cuando se compara con la cantidad de células en una membrana transwell control no revestida con extractos de la membrana basal.
xenoinjerto
Todos los experimentos con animales llevados a cabo en este estudio estaban en el cumplimiento de las
Guía para el Cuidado y uso de Animales
establecido por el Consejo canadiense de los Animales, y fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Ottawa (Protocolo de ME-196). /nu ratones hembra CD-1 nu (Charles River Laboratory, Wilmington, MA, EE.UU.) de 5-6 semanas fueron alojados con los alimentos y el agua
ad libitum
, en un ciclo de luz de 12 h. El método de xenoinjerto de tumor de células IP se describió anteriormente [39]. En pocas palabras, después de una semana de aclimatación, los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal (IP) con 10
7 ES-2 células, o una de sus clones derivados elegido al azar de entre las líneas celulares transfectadas de forma estable con KLK5, KLK6, KLK10, KLK5 /6, KLK5 /10, KLK6 /10, el control de un solo vector, o doble control de vectores, se resuspendieron en 0,8 ml de solución salina tamponada con fosfato. Grupos fueron cegados a ionvestigators hasta el final del experimento en el día 56. Progresión de la enfermedad se controló diariamente, basado en un conjunto de criterios de bienestar generales establecidos por el comité de cuidado de los animales, y la masa corporal se registró dos veces a la semana hasta un punto final predeterminado era alcanzado. Se registró el tiempo en el que los síntomas de la enfermedad apareció por primera vez, como distensión abdominal leve o pequeña masa palpable. Los puntos finales fueron: la deshidratación y /o pérdida de peso de más del 15% a pesar de la terapia de fluidos, cualquier evidencia de dificultad respiratoria, incremento de peso corporal de más de 5 g del peso corporal medio de los ratones de control a la misma edad en la misma población, la presencia de una masa abdominal palpable que afecta la movilidad, la alimentación o afecta a la salud y, finalmente, la presencia de distensión abdominal que perjudica la movilidad o afecta la salud o causa la decoloración significativa evidente en la piel dorsal o ventral.
Tras la necropsia, las muestras de tumores se pesaron y se divide para ser inmediatamente congelado instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenan a -20 ° C, o fija en 10% de formalina tamponada (VWR, Mississauga, ON, Canadá) durante 24 horas y se almacenaron en etanol al 70% antes de la transformación en embebido en parafina bloques, que se cortaron en 5 micras secciones para hematoxilina y eosina (H & amp; e) tinción. se midió el volumen de ascitis, y se evaluaron las muestras al microscopio para determinar la presencia de agregados celulares. Las muestras se centrifugaron a 2500 xg durante 10 minutos para recoger el sobrenadante para el almacenamiento a -20 ° C para las mediciones posteriores de los niveles de KLK por ELISA.
Las muestras de sangre
Para el experimento de supervivencia, las muestras de sangre se tomaron una semana antes de la inyección y semanalmente hasta que el animal alcanzó punto final o el período experimental terminaron en el día 56. la sangre también se tomó antes de la necropsia siempre que sea posible. Para la depuración de la sangre y la toxicidad experimento recombinante KLK10, cada grupo de dosis (0, 0,2, 1, y 5 mg) tenía un animal por punto de tiempo (-1 h, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 12 h, y 24 h). Para recuperar el plasma, 100-200 l de sangre fue adquirida por punción de la vena safena con una aguja de 25G5 /8 gauge (BD, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) y se recoge en microvettes® CB300LH (Sarstedt, Alemania), recubierta con heparina, se centrifuga 5 min a 2000 g, y la capa de plasma se separó a ser almacenado a -20 ° C hasta que se realizaron las pruebas ELISA.
ELISA de calicreínas
para el panel de líneas celulares de cáncer de ovario, las células se cultivaron en placas de 24 pocillos con 5 x 10
4 células y 1 ml de medio por pocillo. muestras del medio fueron recogidas después de incubación a 37 ° C durante 3 días. ELISAs para KLK5 [46], KLK6 [47], KLK8 [48], KLK10 [49], KLK13 [50], y KLK14 [51] se realizaron de acuerdo con los protocolos publicados anteriormente. ELISA para la KLK5, 6 y 10 se realizaron en medios de ES-2 clones después de 24 horas de cultivo en el día de la implantación de xenoinjertos. Del mismo modo, ELISA se realizaron en ambas muestras humanas ascitis y suero de ratón y muestras de ascitis diluidas de 5 veces a 8000 veces, dependiendo de la concentración KLK, en un tampón de dilución (Tris-Cl 50 mM pH 7,8, con 60 mg /ml de BSA y 0,5 mg /ml de azida de sodio).
recombinante KLK10 producción
KLK10 cDNA se amplificó por PCR usando oligos KLK10FP (TATACGTAGCGCTGCTCCCCCAAAACGACAC) y KLK10RP (GTCCTAGGATCGATTGGAGCGTATGAC) [44] a partir de una vector pCMV-neo llevar KLK10 cDNA. Después de la doble digestión con
SnaB
I y
Avr II
, se insertó el fragmento de ADN amplificado en pPIC-9, previamente digerido con
SnaB
I y
Avr
II. El plásmido resultante, PPIC-KLK10, a continuación, se transforma en el
Pichia pastoris KM71
cepa huésped mediante electroporación (
Pichia
kit de Expresión, tecnologías de la vida Invitrogen).
La fermentación de 15 litros de KLK10 recombinante se llevó a cabo utilizando un fermentador BIOSTAT ® ED (B. Braun Biotech International, Allentown, PA, EE.UU.) y un proceso basado en Pichia Directrices proceso de fermentación de Invitrogen. En pocas palabras, fermentador se inoculó con la levadura preparada en un agitador de 2.800 ml en matraz para un OD a partir
600 de ~ 0,3. Después de una fase de glicerol lote 20-horas, se siguió una fase de alimentación de glicerol 4 horas. La inducción se inició mediante la alimentación a partir de glicerol y duró alrededor de 40 horas. Las células se separaron por centrifugación y se recogió el sobrenadante.
Purificación de KLK10 a partir del sobrenadante se llevó a cabo usando una columna de CM-Sepharose (Amersham Biosciences, ON, Canadá) como se ha descrito anteriormente [49].
el tratamiento con KLK10 recombinante
Para el experimento de depuración de la sangre, primero a prueba dosis en bolo IP únicas de KLK10 recombinante (0, 0,2, 1 y 5 mg en 1 ml) con 5 nu /nu ratones por dosis y se tomaron muestras de la sangre en varios puntos de tiempo como se describe anteriormente. Los animales fueron monitoreados de cerca durante las primeras 12 h, y luego periódicamente durante 15 días antes de ser sacrificado.
Para el experimento de toxicidad que probaron dosis de 0, 50, 200, y 800 mg en 1 ml de KLK10, administrado IP diaria en 3 animales por grupo durante 7 días, seguido por 7 días de seguimiento diario con ningún tratamiento antes de ser sacrificado. En la necropsia, el hígado, pulmón, corazón y riñón se retiraron y se dividen a ser inmediatamente congelado instantáneamente y se almacenaron a -20 ° C o se fijaron en 10% de formalina tamponada (VWR, Mississauga, ON, Canadá) durante 24 horas y se almacenaron en 70% de etanol antes de su procesamiento en bloques incluidos en parafina, que se cortaron en 5 micras secciones para H & amp; E de tinción. Las secciones se analizaron en busca de signos de inflamación y el daño.
Para el experimento terapéutico, los ratones desnudos fueron divididos aleatoriamente en los grupos de control y uno 2 de tratamiento (8 animales /grupo). La duración del tratamiento fue de 14 días y el estudio terminó a las 8 semanas después de xenoinjerto. Animales aún vivos al final del estudio fueron sacrificados. En el día 1, los animales fueron inyectados IP con 0,2 ml de tampón PBS, o 0,2 ml de PBS que contiene 5 mg de KLK10 seguido inmediatamente por una inyección de 10
7 ES-2 células se resuspendieron en 0,8 ml de tampón PBS. A partir de entonces, 1 ml de tampón PBS o 1 ml de PBS que contenía 5 mg de KLK10 fueron inyectados IP a cada animal ya sea diariamente o dos veces al día (como se indica) desde el día 2 hasta el día 14.
En el
in vitro
experimento de tratamiento, 10
5 ES-2 células por pocillo se sembraron en una placa de 12 pocillos que contenía DMEM libre de suero o DMEM con suero bovino fetal al 10%, y se complementarán con 4 dosis o KLK10 recombinante (0, 300 ng /ml, 3,000 ng /ml y 30.000 ng /ml) durante 96 h. La viabilidad celular se determinó por exclusión con azul de tripano y las células se contaron utilizando un contador ViCell (Beckman Coulter, Fullerton, CA).
Las curvas de supervivencia y análisis estadísticos
curvas de supervivencia de Kaplan-Meier se representaron usando GraphPad Prism 4.0 (GraphPad software, San Diego, CA, EE.UU.) y se compararon mediante una prueba de rango logarítmico. parámetros fisiopatológicos tales como volumen de ascitis y la carga tumoral (masa total del tumor extirpado) y los resultados de
in vitro
en experimentos se compararon mediante ANOVA de un factor seguido por el test de Tukey posterior. Proporciones como la incidencia de los agregados o ascitis se compararon mediante Chi cuadrado. La significación estadística se infiere en p. & lt; 0,05
Resultados
La secreción de calicreınas 5, 6 y 10 se correlaciona con la agresividad reducida en un panel de líneas celulares de cáncer de ovario, pero es detectable en el líquido ascítico de pacientes con cáncer de ovario
Expresión de la agrupación calicreína incluyendo KLK4 a KLK14 ha sido previamente informado en el cáncer de ovario [37]. Sin embargo, también se ha informado de que diferentes calicreínas pueden tener efectos sobre el pronóstico del paciente diametralmente opuestos en una variedad de tipos de cáncer [37]. Para verificar que la expresión de la calicreína se recapitula en líneas celulares de cáncer de ovario, un panel de trece líneas celulares de cáncer de ovario (Caov-3, OVCAR-3, OVCAR-4, OV2008, C13, OVCA433, Skov-3, OVCA429, Hey, ES- 2, OCC-1, A2780cp, A2780s) se cribó para la secreción de KLK 5, 6, 8, 10, 13 y 14 en los medios de cultivo por ELISA (Tabla S1). Sobre la base de la expresión de la calicreína, las líneas celulares pueden ser segregados en los no expressors (Skov-3, OVCA429, Hey, ES-2, OCC-1, A2780cp, A2780s) y expressors (Caov-3, OVCAR-3, OVCAR -4, OV2008, C13, OVCA433). En este último grupo, todos compartían la expresión común de KLK5 /6, y 5 de 6 expresaron KLK10, 4 de 6 KLK8, 3 de 6 KLK13 y ninguno expresa KLK14. Para investigar cualquier vínculo entre la expresión de la calicreína y la agresividad de las líneas celulares, estos dos grupos se compararon por su capacidad para invadir en matrigel, forman colonias en agar blando y el desarrollo de tumores por vía intraperitoneal en ratones desnudos (datos no mostrados). Se observó una correlación floja, aunque con algunas excepciones, que a diferencia de los no expressors, las células que expresan calicreınas no invadir Matrigel, no se formaron colonias en agar blando, y como se informó anteriormente por nosotros [39], eran muy pobres en la formación de tumores en ratones desnudos (Tabla 1).
sobreexpresión estable de KLK 5, 6 y 10, solo o en pares, en los clones de la línea celular ES-2 calicreína deficientes, resultados en alterado el crecimiento independiente de anclaje, pero no afecta a la proliferación celular o invasoras potenciales
KLK5, 6 y 10 fueron los calicreınas más comúnmente expresado en las líneas celulares de cáncer de ovario menos agresivos que sugieren una correlación entre la expresión de esos calicreınas y carcinogénico potencial. De separar las funciones de cada uno de calicreína y sus interacciones en tumourigenicity, ES-2 células que no expresan ninguna de las calicreınas analizadas (Tabla 1) fueron transfectadas establemente con vectores de expresión para KLK5, 6, 10, solos o en parejas. 3 o más clones de KLK5, 6, 10, 5/6, 5/10, 6/10, junto con el control de plásmido vacío y las células no modificadas ES-2 se compararon para anclaje independiente de crecimiento, la proliferación y la invasión (Fig. 1). Expresión de KLK5, 5/6, 5/10, 6/10 y fue suficiente para reducir significativamente la capacidad de las células ES-2 para formar colonias en agar blando en comparación con el control de vectores de sólo, pero no alteró la tasa de proliferación más de 96 h o modular la capacidad de los clones para invadir en un ensayo transwell.
tres o más clones de la línea celular ES-2 que sobreexpresan KLK5, 6 o 10 o pares de KLK5 /6, KLK5 /10 y KLK6 /10 se compararon con ES-2 células de los padres o los controles transfectados con vector
in vitro
por su potencial carcinogénico. A) Los clones se hicieron crecer en agar blando y se contó el número de colonias y se representa como porcentaje de las células que formaron colonias. B) Los clones se cultivaron durante 96 h en medio que contenía suero y el número de células se contaron. C) células clonales se resuspendieron en medio libre de suero fueron depositados en un inserto revestido con extracto de membrana basal y se dejaron invadir el baño transwell en medios con 10% de suero durante 24 h y las células que migran se cuantificó. Los resultados se muestran como la media de 3 o más clones +/- SEM, y la significación se infiere por ANOVA de una vía con la prueba post si p & lt; 0,05. Diferentes letras minúsculas por encima de cada barra indican diferencias estadísticamente significativas entre los valores (P & lt; 0,05). En C, los datos se normalizan para el control de los padres.
sobreexpresión estable de KLK 5, 6 y 10, solos o en parejas, en los clones de la línea celular ES-2-calicreína deficiente, los resultados en la supervivencia alterada de un xenoinjerto de ratón modelo
Para investigar si la expresión diferencial calicreína podría regular la agresividad de las células del cáncer de ovario
in vivo
, se empleó un modelo de xenoinjerto (IP) intra-peritoneal. Para ello, la línea celular de cáncer de ovario ES-2 es ideal, ya que no expresa calicreínas 5, 6 y 10 (Tabla 1) y forma fácilmente tumores de rápido-progresan IP en ratones desnudos que se acompañan de ascitis, imitando así la progresión de la enfermedad en los seres humanos [39]. Los clones derivados de esta línea celular, de forma estable que secretan KLK5, 6, 10, 5/6, 5/10 y 6/10 en los medios de cultivo junto con los controles de vectores vacíos apropiados (Tabla 2) se inyectaron IP en nu /nu ratones inmunodeficientes . Los ratones fueron inyectados con 10
7 células de cada clon por animal, en grupos de 8, que luego fueron cegados, y estrechamente monitorizados para los puntos finales. Las medianas de supervivencia para la línea parental fue 16d mientras que el control expressor single fue 19.5d y el control doble expressor era 15d. La supervivencia del grupo que expresa KLK5 (24.5d) no difería de la del grupo de control (Fig. 2), mientras que la supervivencia de los grupos que expresa KLK10 (32.5d), KLK5 /6 (25,5), KLK5 /10 (23,5), y KLK6 /10 (23,5) fue significativamente más largo que sus controles apropiados mediante la prueba de rango logarítmico (Fig. 2). La supervivencia del grupo que sobreexpresan KLK6 (15d) por sí sola fue significativamente más corta que la línea celular de control, pero no la línea parental. Los grupos KLK5, KLK10, KLK5 /6 y KLK5 /10 cada uno tenía un ratón sobreviviente libre de la enfermedad, mientras que el grupo KLK6 /10 tenía dos, a la terminación del estudio en el día 56, mientras que todos los ratones de los grupos de control desarrollaron la enfermedad.
a) los clones de la línea celular ES-2 que sobreexpresan KLK5, 6 o 10 o B) pares de KLK5 /6, KLK5 /10 y KLK6 /10 se inyectaron IP en ratones desnudos y la supervivencia se comparó con los ratones control xenoinjertados con los clones del esqueleto del vector apropiadas. Los resultados se muestran como un gráfico de Kaplan-Meier, y la significación utilizando una prueba de rango logarítmico en comparación con un control adecuado es deducido en p & lt; 0,05. * Indica p & lt; 0,05, ** indica p & lt; 0,01 y *** p & lt;. 0.001
Ratones con xenotransplantes de tumores que secretan calicreína muestran los cambios en la fisiopatología
para aclarar la relación entre la secreción de KLK y la supervivencia, varias métricas relacionadas con la enfermedad se compararon todos los grupos de la necropsia (Tabla 3). El criterio de valoración más prevalente fue distensión abdominal (82%) como resultado de la acumulación de ascitis, seguido de dificultad respiratoria (8%) causada por los derrames pleurales, deshidratación y pérdida de peso (7%), y movilidad finalmente deteriorado (3%). Algunos animales no se midieron en las estadísticas de punto final debido a la ausencia de enfermedad después de la terminación del estudio (N = 8), o porque murieron de la enfermedad antes de ser endpointed (N = 6). la histología del tumor, la propagación y los sitios de metástasis fueron similares entre los grupos, con una preferencia por el omento, la membrana peritoneal, el diafragma, los órganos reproductores, el hígado y los intestinos. Tanto el volumen de la carga tumoral y la ascitis se registraron en animales que llegaron a punto final, y los valores distintos de cero se utilizaron para calcular la media (Tabla 3). volumen de ascitis media no difirió entre los grupos con la notable excepción de control de doble que progresó más allá de su punto final distensión antes de ser sacrificado debido a su rápida tasa de progresión de la enfermedad. Se observó una incidencia estadísticamente significativa rebajado de la ascitis en la necropsia en los animales de los grupos KLK5 /10 (p & lt; 0,01) y KLK6 /10 (p & lt; 0,01), con sólo tasa de ocurrencia 37,5% en comparación con grupos de control que todo ascitis desarrollados. Paradójicamente, el grupo KLK6 /10 también tuvo en promedio una mayor carga tumoral (p & lt; 0,01), probablemente debido a la mayor supervivencia-ascitis libres. Entre registraron los animales que desarrollan ascitis dentro de los grupos de KLK5, KLK10, KLK5 /6, KLK5 /10, KLK6 /10, una incidencia significativamente menor de agregados multicelulares que flotan libremente en el líquido ascítico (Tabla 3). Los agregados presentes en la ascitis fueron esferas compactas de células de tamaño uniforme (~ 1 mm
3) visible a simple vista. Las concentraciones de calicreína medidos por ELISA en la ascitis mostraron niveles de KLK6 (Tabla 3) para ser comparables a los niveles observados en la ascitis de pacientes, mientras que los niveles tanto de KLK10 y KLK5 fueron elevados en comparación con las muestras del paciente, especialmente en los grupos de combinación.
El tiempo de supervivencia de cada grupo de ratones se puede dividir en un período anterior al inicio de los síntomas, seguido de un período sintomático que culmina en el punto final. La variabilidad entre los grupos ya está presente cuando se mira en el inicio de los síntomas (Tabla 3), lo que sugiere calicreínas pueden afectar a la progresión de la enfermedad temprana. Para seguir la progresión de la enfermedad temprana, los niveles de la calicreína plasmática se midieron por ELISA en cada semanal de los animales y la necropsia, para servir como un marcador sustituto de la carga tumoral. Calicreínas fueron detectables en el plasma mucho antes de la aparición de los primeros síntomas en todos los ratones, lo que sugiere que la enfermedad traza asintomática es detectable midiendo calicreínas circulantes.