Extracto
bacterias individuales y los cambios en la composición del microbioma se han asociado con enfermedades humanas, incluyendo el cáncer. Para investigar los cambios en el microbioma asociados con el cáncer oral, perfilamos cánceres y anatómicamente se correspondía con el tejido normal contralateral del mismo paciente mediante la secuenciación de 16S rDNA amplificados región hipervariable. En las muestras de cáncer, tanto desde el descubrimiento y la posterior confirmación de cohortes, la abundancia de
Firmicutes gratis (especialmente
Streptococcus
) y
Actinobacteria gratis (especialmente
Rothia
) se redujo significativamente con respecto a las muestras normales contralaterales del mismo paciente. Se observaron disminuciones significativas en la abundancia de estos filos para los pre-cánceres, pero no cuando la comparación de muestras de sitios contralaterales (lengua y piso de la boca) de individuos sanos. Ponderada director UniFrac análisis de coordenadas basado en 12 taxones separó la mayoría de los cánceres de otras muestras con mayor separación de los casos con ganglios positivos. Estos estudios empiezan a desarrollar un marco para la explotación de la microbiota oral para el seguimiento del desarrollo del cáncer oral, la progresión y recurrencia
Visto:. Schmidt BL, J Kuczynski, Bhattacharya A, B Huey, Corby PM, Queiroz ELS, et al . Muy-Teck Teh (2014) cambios en la abundancia de Oral microbiota asociada con el cáncer oral. PLoS ONE 9 (6): e98741. doi: 10.1371 /journal.pone.0098741
Recibido: August 21, 2013; Aceptado: May 7, 2014; Publicado: June 2, 2014
Derechos de Autor © 2014 Schmidt et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por un premio de un GS junior 454 Secuenciación de ejecución de Roche, el Centro Nacional de Recursos para la investigación, el Centro Nacional para el Avance de Ciencias de transferencia, y la Oficina del director de los Institutos nacionales de Salud, a través de la Universidad de San Francisco ( UCSF) - el número de concesión CTSI UL1 RR024129 y premios individuales investigador de la subvención del Instituto Nacional del cáncer (R01 CA131286, R21 CA 941 186 215) y el Instituto Nacional de investigación Dental y Craneofacial (R01 DE019796). Su contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial de los NIH. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. La recepción de un premio para la secuenciación de Roche, una fuente de financiación comercial, no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. El Dr. Justin Kuczynski es un empleado de la Segunda Genome, Inc. Su empleo no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
Anualmente, ~ 22.000 estadounidenses son diagnosticados con cáncer oral de los cuales el 90% son carcinomas de células escamosas (SCC). La supervivencia a cinco años, en el 40% no ha mejorado en los últimos 40 años, y es uno de los más bajos de los principales sitios de cáncer, lo que resulta en más personas que mueren de cáncer oral que el melanoma, el cáncer de cuello de útero o de ovario en los EE.UU.. A nivel mundial hay 350.000-400.000 nuevos casos diagnosticados cada año. A diferencia de la mayoría de los otros sitios anatómicos, que han disminuido la incidencia de cáncer, la incidencia de cáncer oral está aumentando, especialmente entre los jóvenes y las mujeres [1], [2]. Los factores de riesgo, el tabaco y el alcohol, no puede explicar los cambios en la incidencia, ya que el cáncer oral también ocurre comúnmente en pacientes sin antecedentes de exposición al tabaco o alcohol [3]. Recientemente, el virus del papiloma humano (VPH) ha sido identificado como un agente etiológico de cáncer de orofaringe, pero la infección por VPH no es un contribuyente importante al cáncer oral, ya que el virus se encuentra raramente en estos tipos de cáncer (2-4% de los casos) [4] . Por lo tanto, las contribuciones de otros, posiblemente factores ambientales aún no se han encontrado.
El papel de la infección bacteriana en causar o promover el cáncer es bien conocida con respecto a la asociación de
Helicobacter pylori
con cáncer gástrico [5], y otros tipos de cáncer, incluyendo la vesícula biliar, colon, pulmón y próstata, se han asociado con infecciones bacterianas particulares [6], [7], [8]. Es razonable preguntarse, por lo tanto, si los cambios en la composición de la microbiota de la cavidad oral normal, compuesta por más de 600 especies diferentes de bacterias [9] y la infección bacteriana /o crónica podrían ser promotores o causas de cáncer oral. De hecho, los cambios en la comunidad microbiana están comúnmente asociadas con enfermedades dentales tales como enfermedad periodontal, que es más probable una enfermedad polimicrobiana que se caracteriza por el desarrollo de determinados organismos patológicos [10], y la periodontitis crónica se ha informado que un factor de riesgo para orales premalignas lesiones y cáncer [11]. Los niveles elevados y los cambios en la composición de la microbiota bacteriana y fúngica de la cavidad oral se han reportado en asociación con lesiones precancerosas y cánceres orales [12]. Hay, sin embargo, no hay consenso entre los informes relativos a los cambios asociados con el cáncer en el microbioma oral. Esta confusión puede haber surgido porque los primeros estudios se limitaron al análisis de los números relativamente pequeños de especies de bacterias orales conocidas y cultivables [13], [14], y los estudios posteriores utilizando métodos moleculares se centró en particular, phyla [15] o clonados y secuenciados pequeña número de clones por ejemplo [16], [17].
métodos independientes de cultivo, en particular los que utilizan la secuenciación de próxima generación de la región hipervariable de 16S subunidad ribosomal, proporcionan un medio para el perfil más exhaustiva y precisa el microbioma en la salud y la enfermedad [18]. Tales estudios sobre el microbioma oral de [16], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], [27], [28] revelan , por una parte, que el microbioma oral sana se caracteriza por un número relativamente pequeño de filos de bacterias (9-13), el más comúnmente reportados abundante filos siendo
Firmicutes
,
Proteobacteria
,
Bacteroidetes
,
Actinobacteria
, y
Fusobacterias
[16], [19], [20], [21], [22], [23], [24 ], [25], [26], [27], [28]. Por otro lado, la mayoría de la variación inter-individual se ha atribuido a la diversidad en el nivel de especie o cepa [24].
Streptococcus
más a menudo se observa que es el género dominante en el microbioma oral sana, y con menor frecuencia
Prevotella
,
veillonellas
,
Neisseria
, y
Haemophilus
dominan microbioma oral de un individuo [19], [24]. Variación se observa también en la composición de la comunidad microbiana de biofilms en cada hábitat intraoral (
por ejemplo
., Superficie de los dientes, la lengua lateral y dorsal, etc.), más probable es que refleja las diferentes propiedades de la superficie y microambientes [21], [24].
para investigar adecuadamente los posibles cambios en la composición de la microbiota oral en el cáncer oral, por lo tanto, es necesario controlar las diferencias entre los subsitios orales y la variación interindividual. Además, las altas tasas de recurrencia y la prevalencia de segundos cánceres orales primarias apoyan la propuesta de que estos cánceres se desarrollan a partir de un campo de células alteradas genéticamente, el concepto de "cancerización del campo" [29]. Tales campos se ha informado que se extienden tanto como 7 cm a partir de un tumor y que aparezca clínicamente normal [30]. Por estas razones, se investigó el cáncer asociado microbioma oral, mediante el muestreo de forma no invasiva la lesión del cáncer y una región contralateral anatómicamente emparejado de tejido normal de cada individuo. Nos ADN sometido aislado a partir de estas muestras a 16S amplificación subunidad ribosómica y secuenciación. El objetivo de estos estudios fue comenzar a establecer una base que permitiría la explotación del microbioma oral para el tratamiento y el seguimiento de la iniciación oral del cáncer, la progresión y recurrencia.
Resultados
Para investigar los cambios en el microbioma oral, asociada con el cáncer oral, de forma prospectiva recogieron muestras clínicamente normales y pacientes con cáncer anatómicamente adaptado a partir de cinco pacientes (Tabla 1, Estudio 1 Descubrimiento de cohortes, el cuadro S1). Para confirmar y ampliar nuestras observaciones iniciales, se realizó un segundo estudio (Estudio 2, Tablas S2 - S6, el número total de muestras = 83) en el que recogen de forma prospectiva un conjunto independiente de muestras clínicamente normales lesional y anatómicamente emparejados de cáncer oral (tabla 2, Estudio cohorte 2 Confirmación, el cuadro S2), carcinoma de
In situ gratis (CIS, el cuadro S3) y los pacientes pre-cancerosas (Tabla S4), así como de la izquierda y la derecha los lados del borde de lengua y piso de la boca de individuos normales sanos (Tabla S5). En el Estudio 2, que también incluyó un análisis independiente de los cinco primeros pacientes con cáncer de Estudio 1 y seis pares de muestras replicadas (tres pacientes con cáncer y tres pre-cancerosas, el cuadro S6). Este último se incluyeron para evaluar la reproducibilidad de la recogida y procesamiento de la muestra y no se incluyeron en ninguno de los análisis (véase más adelante la discusión en Métodos).
Estudio 1. Descubrimiento cohorte
limpió la lesión cáncer oral y una correspondiente área de tejido clínicamente normales anatómicamente adaptado a partir del descubrimiento de cohortes de cinco pacientes (Tabla 1). Utilizando el instrumento Roche GS Junior realizar pirosecuenciación, se obtuvo, en una sola pasada, con un total de 104,380 secuencias de amplicones que se extendió por la región hipervariable V4 del 16S bacteriano subunidad pequeña del ribosoma (Tabla S7). El número de secuencia en bruto lee variada por & gt; 10 veces a través de muestras, que van desde 1,231 hasta un máximo de 17682 en bruto lee. secuencias filtradas de calidad se realizaron búsquedas en la base de datos de referencia Greengenes de secuencias de 16S, agrupada en 97%, y las unidades taxonómicas operacionales (Otus) fueron asignados clasificación taxonómica usando clasificador bayesiano de mothur. De los 92,987 secuencias que pasaron calidad de filtrado, 81.308 eran similares a las bacterias conocidas y podrían clasificarse a nivel de género (65.037), con menos clasificada a nivel de especie (17.115). la cobertura de secuencia era variable a través de las muestras; el número de lecturas por muestra asignada a UOT (con exclusión de los filtrada debido a la mala calidad o la falta de una secuencia relacionada en la base de datos de referencia Greengenes) varió de 1,038 hasta un máximo de 14.359, y comprendía 76 a 85% de secuencias en bruto (Tabla S7 ). Se identificaron un total de 276 OTU (por rango de la muestra, 37-161, (Tabla S8). rarefacción análisis realizado a nivel familiar demostró una gama bastante amplia de la diversidad α con el número de familias que van desde detectados ~15-28 (Figura .. S1a) Tres muestras de los pacientes, normal y cáncer de paciente 117 y la muestra normal de paciente 142, estancado en familias menos que las otras muestras, indicando la diversidad algo reducida en estas muestras Todas las muestras se estabilizaron en cierta medida, aunque no del todo; además secuenciación es probable revelan familias adicionales. por otra parte, pirosecuenciación ruido y los errores de la PCR podrían aumentar erróneamente números OTU [31]. Un efecto similar se observó a nivel de género (Figura S1b).
Diversidad de microbiomas asociado con el cáncer oral anatómicamente adaptado y muestras normales
la UOT de las muestras de cáncer y clínicamente normales en la cohorte de descubrimiento se clasificaron en 12 phyla (Tabla S7). la mayoría pertenecía a uno de los cinco filos (99,2%, lo normal , 98,0% cánceres) con los filos más abundante siendo
Firmicutes
,
Bacteroidetes
,
Proteobacteria
,
Fusobacterias
, y
Actinobacteria
(Tabla 7, Figura 1). Aunque la distribución en el cáncer y muestras clínicamente normales de estos cinco filos común varió entre los individuos (Figura 1), en todos los pacientes, se observó una reducción significativa en la abundancia de
Firmicutes
y
Actinobacteria
en cáncer en comparación con la muestra anatómicamente adaptado contralateral clínicamente normales del paciente, (p = 0,004, FDR ajustado p = 0,02 y p = 0,028, FDR ajustado p = 0,07, respectivamente). También se observó que la proporción de
Fusobacterias
se incrementó en todos los pacientes, pero el cambio en la abundancia no alcanzó significación estadística (p = 0,074, Figura 2). Observamos, sin embargo, que al observar cambios consistentes en la abundancia de los tres filos en esta pequeña cohorte es altamente significativa. Haciendo caso omiso de las interacciones entre las abundancias relativas de los diferentes phyla, un rendimiento de la prueba binomial p = 0.0022 como la probabilidad (bajo la hipótesis nula) de tener tres o más filos donde (todos los cinco pacientes comparten un aumento) o (los cinco comparten una disminución).
la distribución relativa de los filos (porcentaje de secuencias) se muestra para cada muestra de paciente con muestras clínicamente normales muestran juntos en la parte superior y el cáncer de muestras en la parte inferior
(a -. e ) abundancia relativa de cada uno de los filos de cinco más abundantes en los cánceres en comparación con muestras clínicamente normales de cada uno de cinco pacientes. Tenga en cuenta, que los datos se muestran en diferentes escalas, lo que refleja la abundancia de los filos. Las magnitudes de los cambios en la abundancia son claramente mayor que el ruido de recuento estadístico, como se indica por las estimaciones de barras de error, que se basan en la raíz cuadrada del número real de lecturas. (F) Modificación de la abundancia relativa se muestra como la diferencia en la abundancia de phyla asociado con cánceres en comparación con anatómicamente corresponde contralateral clínicamente muestras normales. En los cánceres, la disminución de la abundancia relativa de
Firmicutes
y
Actinobacteria
se observó en todos los pacientes, mientras que la abundancia relativa de
Fusobacterias
fue elevada en los cánceres de todos los pacientes.
Estudio de cohortes 2. Confirmación
Para confirmar estas observaciones iniciales, se realizó un estudio 2. Como antes, tomaron muestras tanto de la lesión (cáncer o precáncer) y un anatómicamente contralateral sitio emparejado clínicamente normal. Nos limpió los lados izquierdo y derecho de la lengüeta lateral y piso de la boca de los individuos sanos. Utilizando el instrumento Illumina MiSeq, secuenciado amplicones que abarca la región hipervariable 16S rDNA V4. Se obtuvo 4.486.196 secuencia en bruto lee con un rango de 31.109 a 125.847 lecturas por muestra después de la exclusión de dos muestras que fallaron en la secuenciación (Tablas S9 - S13). Se asignó la clasificación taxonómica de la UOT como antes. De las secuencias que pasaron calidad de filtrado, 4.444.432 eran similares a las bacterias conocidas y podrían clasificarse a nivel de género (4.148.785), con menos clasificada a nivel de especie (1.650.037). Se identificaron un total de 2.107 Otus (por rango de la muestra, 90-482, Tablas S9 - S13). análisis de rarefacción demostró una gama bastante amplia de la diversidad α con casi todas las muestras plateauing en cierta medida (Figura S2). Como se discutió anteriormente, los errores de ruido secuenciación y PCR pueden aumentar el número de OTU [32].
Diversidad del microbioma asociados con muestras anatómicamente coincidentes de cáncer oral, pre-cáncer y los individuos normales sanos en el estudio 2
se determinó en primer lugar que los datos recopilados en nueve de las muestras 10 Descubrimiento de cohortes que se perfilan con éxito en el estudio 2 (Tabla S9) se correlacionaron con los datos originales obtenidos por pirosecuenciación 454 (Figura S3). A continuación, examinó la Cohorte Confirmación compuesta solamente de muestras de pacientes con cáncer que no se incluyen en el descubrimiento de cohortes,
es decir
., se excluyeron las muestras de cohortes nueve Descubrimiento (Tabla 2, Tabla S9). de nuevo, se encontró que la mayoría de las UOT (61-100%) pertenecía a uno de los cinco más abundantes filos (
Firmicutes
,
Bacteroidetes
,
Proteobacteria
,
Fusobacterias
, y
Actinobacteria
) (Figura 3a, Tabla S14). Luego preguntamos si hubo reducciones significativas en la abundancia de
Firmicutes
y
Actinobacteria Hoteles en cáncer en comparación con la muestra del paciente contralateral clínicamente normales anatómicamente compatible. De hecho, como habíamos observado en la cohorte de descubrimiento (Estudio 1), hubo una reducción significativa en la abundancia de estos dos phyla en los cánceres en comparación con las muestras anatómicamente emparejados contralateral clínicamente normales de pacientes (p = 0,042 y p = 0,004, respectivamente), confirmando nuestras observaciones iniciales (Figura 3B, la figura S4).
(a) se muestra la distribución relativa de phyla (porcentaje de secuencias). Para los cánceres, se incluyeron sólo los pacientes para los que estaban disponibles tanto el cáncer y las muestras normales clínicamente contralateral. (B) Variación de la abundancia relativa de los filos se muestra como la diferencia en la abundancia de los filos asociada con cáncer o pre-cáncer en comparación con el anatómicamente corresponde contralateral clínicamente muestras normales. Para las muestras normales sanos, se compararon los lados izquierdo y derecho del borde de lengua o en el piso de la boca.
En el Estudio 2, también se observó que la mayoría de UOT en muestras de pacientes pre-cancerosas y saludable normales (Figura 3a) pertenecía a uno de los cinco filos
Firmicutes
,
Bacteroidetes
,
Proteobacteria
,
Fusobacterias
, y
Actinobacteria
(pre-cánceres = 99-100%, normal y saludable = 87-100%). de nuevo nos preguntamos si las reducciones significativas en la abundancia de
Firmicutes
y
Actinobacteria
podrían también estar presentes al comparar los pre-cánceres y anatómicamente se correspondía con muestras de pacientes clínicamente normales contralateral. Nosotros encontramos que la abundancia de
Firmicutes
y
Actinobacteria
se redujo (p = 0,048 yp = 0,037, respectivamente), lo que sugiere que los cambios en la abundancia de estos dos filos pueden ocurrir temprano (Figura 3b ). Por el contrario, no hemos encontrado diferencias significativas en la abundancia de estos dos filos o cualquiera de los cinco filos más abundante cuando se comparan los lados izquierdo y derecho del borde de lengua y piso de la boca de individuos normales sanos (Figura 3b).
para investigar los cambios en la abundancia a nivel de género para los cinco filos más abundante, se consideraron diferentes muestras de pacientes de la confirmación de la cohorte y también se incluyeron cuatro de los casos de cinco Descubrimiento de cohortes que fueron analizadas con éxito en el estudio 2 (14 cánceres de 13 pacientes, Tabla S9). Hemos normalizado el número de UOT a un millón de cargos, (Tabla S15) y para cada phylum, determinamos cambios en la abundancia de los géneros que representa & gt; 10% de UOT en más de 20% de las muestras (Figura S5 y S6). se observó una reducción significativa en la abundancia de
Streptococcus gratis (p = 0,003) y
Rothia gratis (p = 0,021) en los cánceres con relación a las muestras clínicamente normales anatómicamente emparejados (Tabla S16). Por el contrario, se observó el aumento abundancia de
Fusobacterium gratis (p = 0,044) en relación con las muestras clínicamente normales coincidentes de los pacientes con cáncer. En pre-cánceres, que observó reducción significativa abundancia de
Streptococcus gratis (p = 0,042) (Tabla S16). No se encontraron diferencias significativas en la abundancia de estos géneros más comunes cuando se compara la abundancia en las muestras tomadas de los lados izquierdo y derecho del borde de lengua y piso de la boca de individuos sanos (Tabla S16).
También observamos que aunque no se encontraron cambios consistentes en la abundancia de
Bacteroidetes
cuando se comparan dentro de los individuos (Figura 3b), las muestras de pacientes con cáncer y pre-cáncer (tanto de la lesión y anatómicamente coincidentes tejido contralateral clínicamente normales) se asociaron con una mayor abundancia de
Bacteroidetes
en comparación con muestras de individuos normales sanos (Figura 3A).
Prevotella
especies, en particular, se diferenciaron y se incluyen, por ejemplo, OTU correspondiente a
P.
intermedia,
P. melaninogénica
,
P. nanceiensis
,
P. oris
,
P. tannerae
y las especies no clasificadas (Figura S5, S15 Tabla). Los niveles elevados de
P. melaninogénica
han sido reportados previamente como un biomarcador potencial de la saliva del cáncer oral [33] y
P. intermedia
es un patógeno periodontal [34]. serán necesarios más estudios para comprender las contribuciones de general (
Bacteroidetes
) y cambios específica de la lesión (
Actinobacteria
,
Firmicutes
) en el microbioma de cáncer oral y pre CANCER pacientes.
cáncer distintiva UOT a partir de muestras de pacientes normales contralaterales anatómicamente emparejados
para hacer frente a la necesidad de biomarcadores para predecir el comportamiento de los cánceres orales que podrían ensayarse mediante pruebas no invasivas, que pidió si las muestras de cáncer podrían ser distinguidos por la composición bacteriana. Teniendo en cuenta las muestras pareadas de cáncer /normal, se identificaron 11 UOT de los filos
Actinobacteria gratis (
Actinomyces
y
Rothia
, 2 UOT de cada género) y
Firmicutes
(
Streptococcus
, 7 UOT) que se redujo significativamente en los cánceres y una OTU del phylum
Fusobacterias gratis (
Fusobacterium
) que se incrementó en los cánceres en comparación con el anatómicamente diferentes muestras de pacientes normales contralaterales (Tabla S17). Ponderada director UniFrac análisis de coordenadas (PCoA) sobre la base de este conjunto de UOT separó la mayoría de los cánceres de muestras normales y pre-cancerosas con cinco de los casos positivos de siete de los ganglios linfáticos que forman un grupo compacto en la esquina inferior derecha de la parcela (Figura 4). Metástasis a las cervicales (cuello) ganglios linfáticos es un determinante importante de la supervivencia del paciente cáncer oral [35]. La actual falta de métodos fiables para evaluar el riesgo de los resultados de la metástasis en pacientes siendo sometidos rutinariamente a una cirugía adicional para extraer los ganglios linfáticos, a pesar de que la mayoría no se beneficiará del procedimiento. La agrupación apretada de muestras de pacientes positivos de nodo en la Figura 4 sugiere que los cambios en la composición de la microbiota oral del cáncer también pueden tener potencial como un marcador biológico asociado al tumor de riesgo de metástasis.
PCoA basado en la distancia entre UniFrac ponderado muestras dan abundancia de 12 UOT. Eje 1 (PCoA1): 54% de la variación explicada. Eje 2 (PCoA2): 24% de la variación explicada. N0 y N + indican el estado de los ganglios del paciente con cáncer, N0 = ganglios negativos, N + = ganglios positivos. el control del cáncer y el control pre-cáncer contralateral son muestras de pacientes clínicamente normales. Otros identifica muestras de individuos normales sanos
Total micrbiome -. ß diversidad
Para investigar la disimilitud de muestra a muestra, se prepararon las submuestras los datos con selección aleatoria de 31.109 secuencias de cada comunidad para ajustar la variación en la profundidad de secuenciación (Tabla S18). Al considerar los tres grupos de la muestra (cánceres, sanos Normales, y pre-cáncer), se observaron diferencias microbioma importantes para la identidad del paciente basado en ambas métricas ponderadas UniFrac (abundancia) y no ponderado UniFrac (presencia /ausencia) (Tabla S19, Figuras S7 y S8). No hay otras comparaciones, tales como izquierda versus derecha, el número de secuencias o lesión (cáncer o precáncer) frente a control los sitios normales revelaron diferencias significativas. Estas observaciones son consistentes con otros estudios que han puesto de relieve las diferencias interindividuales en el microbioma por vía oral [24]. Además, apoyan nuestro diseño del estudio, que mide los cambios en el microbioma dentro de los individuos,
es decir
., Utilizando cada paciente como su propio control.
Discusión
Para estudiar los cambios relacionados con malignidades microbioma orales, se les practicó una pantalla de Discovery cánceres (Estudio 1), en el que de forma no invasiva y probamos contralateral muestras de tejido clínicamente normales de cada individuo. La comparación de la composición de las comunidades microbianas en pacientes identificó cambios en la abundancia de
Actinobacteria
y
Firmicutes
. Se confirmó estas observaciones en una segunda cohorte de confirmación (Estudio 2) y además encontraron cambios significativos en la abundancia de la
Actinobacteria
género
Rothia
y el
Firmicutes
género
Streptococcus
cuando se consideran todos los cánceres en el Estudio 2 (Tabla S16). Aunque no hemos visto un cambio significativo en la abundancia del filo
Fusobacterias
ya sea en el descubrimiento o cohortes de confirmación, que se encontró un aumento significativo en la abundancia de la
Fusobacterias
género,
Fusobacterium
si se consideran todos los pacientes con cáncer en el estudio 2. Observamos que mientras que las cohortes de pacientes estudiados aquí son pequeños y heterogéneos, nuestras conclusiones acerca de la abundancia de los filos son similares a estudios publicados, que se centraron en el análisis exhaustivo de la microbiota oral. Por otra parte, el uso de diferentes tecnologías de secuenciación para medir la abundancia de los amplicones de 16S rDNA en Estudios 1 y 2 soporta la robustez de nuestras observaciones. Sin embargo, más estudios de mayor tamaño deben ayudar a definir mejor los cambios orales asociados con cáncer en la abundancia de estos filos y géneros. Por otra parte, hemos observado cambios en la abundancia de
Firmicutes gratis (
Streptococcus
) en asociación con los pre-cánceres orales, lo que sugiere que los cambios lesión bucal asociados en la composición de la comunidad microbiana puede ocurrir temprano en forma oral el desarrollo del cáncer y /o la progresión del cáncer Herald.
el tabaquismo es un factor de riesgo para las enfermedades orales, incluyendo el cáncer y la periodontitis. Los estudios han demostrado que los efectos de fumar la composición de las comunidades bacterianas en la cavidad oral, incluyendo, por ejemplo, el microbioma de la saliva de los fumadores sanos y no fumadores [36] y el microbioma subgingival de pacientes con enfermedad periodontal [37], así como la formación de biofilms de la placa [38]. En nuestro estudio, no se encontraron pruebas de diferencias generales en el microbioma que podrían atribuirse al consumo de tabaco, pero con sólo tres fumadores actuales y cuatro no fumadores en nuestras cohortes de pacientes con cáncer, por ejemplo, no podemos sacar ninguna conclusión en este momento. Por un lado, porque utilizamos cada paciente como su /su propio control, tendríamos que esperar para ver fumadores diferencias asociadas en la abundancia de la microbiota asociada con el cáncer, ya que fumar podría afectar tanto el sitio de control y el cáncer. Por otro lado, en los fumadores, las células en los sitios clínicamente normales y los cánceres mi responden de manera diferente a fumar cambios inducidos en la formación de biopelículas, por ejemplo, aumentando la posibilidad de que los cambios mientras que el cáncer asociado en la abundancia de la microbiota en los fumadores y no fumadores parecer similares, la formación y las consecuencias funcionales de las microbioma alteradas pueden diferir en estos grupos de pacientes. Consideraciones similares pueden aplicarse a individuos inmunodeprimidos.
La presencia de bacterias en los cánceres y /o diferencias en las comunidades bacterianas asociadas con el cáncer oral se han reportado previamente orales usando ya sea la cultura dependiente [13], [14] o molecular métodos [15], [16], [17], sin embargo, no hay observaciones consistentes han sido reportados a través de estos estudios. Es, sin embargo, difícil hacer comparaciones incluso entre dos estudios recientes informes abundancia de bacterias [16], [17] y este estudio, debido a las diferencias en (a) el tipo de muestra (hisopo, este estudio frente a muestra de tejido [16] , [17]), (b) el sitio de la cavidad oral, (c) la fuente de paciente emparejado muestras de control normales (anatómicamente adaptado contralateral clínicamente normales, este estudio, el tracto aerodigestivo superior mucosas [16], adyacente normal [17]), (d ) región amplificada del gen ribosomal 16S (V4, este estudio, V4-V5 [16] o V1-V4 [17]), (e) metodología (Sanger [16], [17] vs. pirosecuenciación o MiSeq, este estudio ), y (f) el número de clones o secuencia lee asignado a UOT por muestra (promedio 8.000 y 55.000 lecturas por muestra, Estudio 1 y 2, respectivamente, en comparación con ~ 90 ~ 250 o clones por muestra [16], [17] ). Por ejemplo, Pushalkar y colegas [16] informes sobre 10 pacientes encontraron que el 75 y el 80% de los clones (normales y el cáncer, respectivamente) fueron asignados al filo
Firmicutes
. Esta proporción no sólo es más alto que el 40-0% reportado en otros estudios de la cavidad oral de pacientes sanos o con cáncer, pero ya que sólo ~ 90 clones fueron secuenciados por muestra, hay muy pocos clones para determinar de forma fiable abundancia relativa de otros phyla para las comparaciones. Un análisis a nivel de phylum de sólo el 16 lengua, el suelo de la boca y los cánceres de la cavidad oral reportados por Bebek y colegas [17], sin embargo, reveló aumento de cáncer asociado en la abundancia del filo
Fusobacterias
, en consonancia con nuestras observaciones, pero disminuyó la abundancia de
Streptococcus
podría no ser visto, como pocos clones fueron asignados a este género.
no podemos distinguir si los cambios observados en la comunidad microbiana reflejan el hecho de que ciertas bacterias son más adecuado para adherirse y crecer en el microambiente del cáncer o si están promoviendo cáncer. Además, no está claro cómo ponderar las contribuciones potenciales de los cambios en la abundancia géneros como
Streptococcus
en comparación con el menos abundante
Actinobacteria
géneros. Tareas para las bacterias y hongos en la promoción del cáncer incluyen la generación de sustancias cancerígenas, tales como nitrosamina u otros productos químicos pro-cancerígenos, la inflamación crónica y los efectos directos en la señalización en las células epiteliales que resulta en la proliferación o la supresión de la apoptosis [6] mejorado, [7] , [12], [39]. Sólo una minoría de la comunidad microbiana oral puede adherirse a los tejidos orales duros y blandos, y el montaje del biofilm oral de complejo se logra mediante la posterior adhesión de los colonizadores secundarios.
Streptococcus
es un colonizador temprano y
Fusobacterium gratis (
por ejemplo
.,
F. Nucleatum
) tiene una propensión a la co-agregación con muchos géneros, formando un puente entre colonizadores tempranos y tardíos en el biofilm oral de [40]. De este modo, por una parte, la disminución observada en la prevalencia de
Streptococcus
y una mayor abundancia de
Fusobacterium
géneros en los pre-cánceres podrían reflejar las propiedades superficiales alteradas de las células cancerosas y estroma, que ya no podría apoyar la adhesión de
estreptococos
. Por otro lado, podemos plantear la hipótesis de que los cambios en la abundancia de estos dos géneros podrían resultar en un ambiente pro-inflamatoria mejorada, ya que
Streptococcus
especies se han reportado para atenuar
Fusobacterium nucleatum
inducida pro respuestas inflamatorias del las células epiteliales orales [41], [42]. Observamos también que
Fusobacterium nucleatum
crecido como un biofilm es capaz de invadir cultivos organotípicos [43], y en segundo lugar, que el organismo ha informado recientemente en los cánceres de colon [44], [45], más el apoyo a una papel potencial en el cáncer oral
.
la cavidad oral ofrece una oportunidad única para relativamente proyectará en individuos de riesgo para el cáncer (oral), debido a que las lesiones se pueden ver, y como mostramos aquí, el cambio en el microbioma de las lesiones cancerosas y pre-cáncer en comparación con los tejidos clínicamente normales anatómicamente emparejado del mismo individuo pueden ser detectados en muestras de frotis recogidas de forma no invasiva. La saliva es otra muestra de forma no invasiva por vía oral recopilada compuesto en gran parte de las células bacterianas, sino también eliminar las células epiteliales e inmunológico.