Extracto
El conocimiento sobre el papel de la proteína caveolina-1 (Cav-1) sobre la adhesión del endotelio de cáncer Las células no está claro. El presente estudio reveló que Cav-1 juega un papel regulador negativo en la interacción con el cáncer endotelio. Endógeno Cav-1 se demostró que regular a la baja durante el desprendimiento de las células y el nivel de dicha proteína se asoció inversamente con la adhesión endotelial de tumor. Además, la sobreexpresión ectópica de Cav-1 atenúa la capacidad de las células de cáncer de adherirse al endotelio mientras mediada por shRNA Cav-1 knock-down exhibió el efecto contrario. Se encontró que el desprendimiento de células aumentó peróxido de hidrógeno celular y la generación de radicales hidroxilo y dichas especies reactivas de oxígeno (ROS) fueron responsables de la creciente interacción entre las células cancerosas y las células endoteliales vasculares a través de la molécula 1 de adhesión celular endotelial (VCAM-1). Es importante destacar que, Cav-1 se demostró para suprimir peróxido de hidrógeno y la formación de radicales hidroxilo mediante el mantenimiento del nivel de Akt activado que era crítica para el papel de Cav-1 en la atenuación de la adhesión celular. En conjunto, el presente estudio reveló que el nuevo papel de Cav-1 y el mecanismo subyacente en la adhesión tumoral que explicar y poner de relieve un importante papel de Cav-1 en la metástasis de las células del cáncer de pulmón
Visto:. Chanvorachote P, P Chunhacha ( 2013) caveolina-1 regula la adhesión endoteliales de las células del cáncer de pulmón a través de oxígeno reactivo Mecanismo dependiente de la especie. PLoS ONE 8 (2): e57466. doi: 10.1371 /journal.pone.0057466
Editor: Chih-Hsin Tang, de la Universidad Médica de China, Taiwán
Recibido: 18 Octubre, 2012; Aceptado: January 21, 2013; Publicado: 27 Febrero, 2013
Derechos de Autor © 2013 Chanvorachote, Chunhacha. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo con el apoyo de subvenciones del Fondo de Investigación de Tailandia (P. Chanvorachote) y post-doctorado (Fondo de Dotación Ratchadaphiseksompot, Universidad de Chulalongkorn). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Recientemente, los papeles de la caveolina-1 (Cav-1) en la regulación de la progresión del cáncer y la metástasis en varios tipos de cáncer se han puesto de manifiesto [1] - [4] y una proteína tal quizá recibido la mayor atención en cáncer relacionado con la investigación. Aunque algunos estudios sugirieron que Cav-1 puede jugar un papel en la inhibición de la progresión del cáncer en ciertos tipos de cáncer [5], en el cáncer de pulmón, Cav-1 potencia la agresividad del cáncer, así como metástasis [6]. Junto con el hecho de que Cav-1 de expresión en el cáncer de pulmón se demostró que se relacionan con mal pronóstico [2], y la mayoría de la muerte por cáncer en este tipo de cáncer se demostró que enlazar con la metástasis, es de gran interés para investigar la totalidad papel regulador de esta proteína en la metástasis del cáncer [7]. La metástasis es un proceso de múltiples pasos de las células cancerosas se diseminan desde sus lugares de origen a los sitios secundarios distantes. A partir de la retirada de las células del cáncer de su tumor primario, las células invaden la pared vascular, viajan en el sistema circulatorio, y se adhieren al endotelio para formar los tumores secundarios. Aunque las funciones de Cav-1 en los comportamientos celulares de cáncer de pulmón se han explorado intensamente, el papel de una proteína tal sobre la adhesión celular de cáncer de pulmón a la superficie del endotelio es en gran parte desconocida. Nosotros y otros han sugerido la importancia del papel de Cav-1 en la prestación de las células cancerosas resistentes a la anoikis después de la separación de células [6], [8], [9], [10], la mejora de la invasión y la migración [11], y facilitar el crecimiento de independiente de anclaje de manera [12]. Endógeno nivel Cav-1 se muestra en los estudios previos para ser controlado por las especies reactivas de oxígeno (ROS). En condición de la celda individual, se demostró peróxido de hidrógeno para aumentar el nivel celular de Cav-1 mediante la inhibición de su degradación [6]. Mientras que en las células adherentes, el radical hidroxilo ha demostrado ser un jugador clave en la regulación de arriba Cav-1 de expresión y el aumento de la migración de células [11]. Estos resultados resaltan el papel regulador de ROS en Cav-1 de expresión y sus papeles en acompañar a la metástasis del cáncer.
En la biología, existen reglamentos de retroalimentación negativa para evitar que las estimulaciones excesivas. Del mismo modo, la proteína Cav-1 se demostró para suprimir el estrés oxidativo causado por la exposición de peróxido de hidrógeno [13]. Sin embargo, aún se desconoce si Cav-1 regula el nivel de ROS en células desprendidas y tal regulación es fundamental para la propiedad adhesiva cáncer. Utilizando enfoques farmacológicos y genéticos, el presente estudio reveló que Cav-1 juega un papel clave en la inhibición de la adhesión cáncer-endotelio mediante la atenuación de peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo generaciones después de la separación celular. El presente estudio también encontró que Cav-1 suprime la formación de ROS por ejemplo a través del mecanismo de Akt-dependiente. Junto con la observación de que Cav-1 disminuyó de una manera dependiente del tiempo después de la separación de células, se encontró que en más tarde en tiempo puntos, adhesión cáncer-endotelio aumentó significativamente el concomitante de que Cav-1 agotamiento. Por lo tanto, nuestro estudio reveló la existencia de un nuevo mecanismo de adhesión celular de cáncer en relación con Cav-1 que puede ser explotado en la metástasis y drogas de diseño.
Materiales y Métodos
Células y Reactivos
de células no pequeñas de cáncer de pulmón (NSCLC) -H460 y las células vasculares del endotelio humano (HUV-EC-C) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). células H460 se cultivaron en RPMI 1640 mientras que las células HUV-EC-C se cultivaron en medio M199. RPMI 1640 se complementó con 5% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, y 100 unidades /ml de penicilina /estreptomicina. M199 fue suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 10 mM de L-glutamina, y 100 unidades /ml de penicilina /estreptomicina, 0,1 mg /ml de heparina, 0,05 mg /ml de suplemento de crecimiento de células endoteliales (ECG). Todo el cultivo se incubó en un 5% de CO
2 entorno a 37 ° C. 2 ', 7'-diclorofluoresceína diacetato (DCFH
2-DA), dimetilsulfóxido (DMSO), kit de aislamiento de caveolae, calceína AM, heparina de sodio se obtuvieron de Sigma Chemical, Inc. (St. Louis, MO); Conejo caveolina-1 y anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de Abcam (Cambridge, MA); Hydrophenyl fluoresceína (HPF), LY294002, Amplex Red, Lipofectamine 2000 eran de Invitrogen (Carlsbad, CA); De anticuerpos para β-actina de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); Anticuerpo para pan-Akt, P473-Akt, PTEN, EGFR, fosfo-PTEN (Ser380 /Thr382 /383) eran de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA); Endotelial suplemento de crecimiento celular fue de Millipore Corporation (Billerica, MA)
plásmido y transfección
El plásmido de expresión de Cav-1 pEX_Cav-1 y su vector de control.; pDS_XB-YFP fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y Cav-1 desmontables plásmido shRNA-Cav-1 y su vector de control; control de shRNA plásmido A se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). transfecciones estables de Cav-1 plásmido de expresión o de Cav-1 plásmido caída se generaron mediante el cultivo de células H460 en una placa de 6 pocillos hasta que alcanzaron el 60% de confluencia. se utilizaron 15 l de reactivo Lipofectamine y 2 g de Cav-1, y shRNA-Cav-1 plásmido para transfectar las células en ausencia de suero. Después de 12 h el medio fue reemplazado con medio de cultivo que contenía suero bovino fetal al 5%. Aproximadamente 36 h después del comienzo de la transfección, las células se digirieron con 0,03% de tripsina, y las suspensiones celulares se sembraron en matraces de cultivo de 75 ml y se cultivaron durante 24 a 28 días con G418 o puromicina para la selección de Hcav-1 y shCav- 1, respectivamente. Los transfectantes estables se agruparon y la expresión de la proteína Cav-1 en los transfectantes se confirmó por transferencia de Western. Las células se cultivaron en medio libre de antibiótico RPMI 1640 durante al menos dos pasajes antes utilizados en cada experimento.
Detección ROS
intracelular de ROS se determinaron por citometría de flujo utilizando DCFH
2-DA como una sonda fluorescente. Brevemente, las células fueron incubadas con 10 mM DCFH-DA, HPF durante 30 min a 37 ° C, después de lo cual se lavaron, se trataron con tripsina, se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato, y se analizaron inmediatamente para la intensidad de fluorescencia por FACScan citómetro de flujo (Beckton Dickinson, Rutherford, NJ) utilizando un haz de excitación 488 nm y un filtro de paso de banda 538-nm. La mediana de la intensidad de fluorescencia se cuantificó mediante el software (Becton Dickinson) el análisis de los histogramas registrados CellQuest.
H
2O
2 se determinó por el reactivo Amplex Red (Invitrogen). Brevemente, se añadió la mezcla de reacción que contiene 50 mM de reactivo Amplex Red y 0,1 U /ml de HRP en fosfato de Krebs-Ringer (KRPG) en cada pocillo de la microplaca. Posteriormente, 20 l de 1,5 × 10
se añadió 4 H460 células suspendidas en KRPG a la mezcla de reacción. Después de 30 min de incubación, la señal de fluorescencia obtenida de la lector de microplacas de fluorescencia equipado para la excitación en el intervalo de 530 a 560 nm y detección de emisión a 590 nm se controló y se mide sobre el 3 h post-separación.
Monocapa ensayo de adhesión celular
HUV-EC-C se estimularon con 10 ng /ml de IL-1
β Opiniones de 0-4 h. células H460 (2,5 x 10
4 células /ml) fueron teñidas con 15 mM de calceína AM (Sigma) durante 45 minutos a 37 ° C y 5% de CO
2, entonces agregado a un cultivo en monocapa semi-confluentes de HUV-EC-C, se incubaron durante 20 min a 37 ° C con rotación a 120 rpm, y se lavaron extensivamente para excluir la unión celular no específica. El número de células unidas se contó directamente bajo un microscopio de fluorescencia como se informó anteriormente [14]. Para el bloqueo mediado por anticuerpos de la adhesión celular, la IL-1β estimulada HUV-EC-C se incubaron con el anticuerpo a VCAM-1, ICAM-1 y E-selectina (a una dilución final de 1:400 por cada anticuerpos) para la 3 h a 37 ° C en una incubadora de CO2 humidificado, y después se añadieron células H460.
caveolae aislamiento
caveolae fueron aisladas de shCav-1, H460 y células 1 Hcav-mediante el uso de un aislamiento caveolae kit (Sigma). células Hcav-1 ShCav-1, H460 y se recogieron y se lisaron con tampón de lisis que contiene 1% de Triton X-100. Los lisados se centrifugaron a 10,000
g
durante 15 minutos. fracciones de membrana de detergente resistentes fueron aislados en OptiPrep Gradiente de Densidad Media (0, 20, 25, 30, y 35%). Caveolas se recogieron fracciones de caveolina-1-enriquecido, que se ha utilizado para la investigación de Cav-1 y PTEN expresión.
Transferencia Western
Después de los tratamientos específicos, las células se incubaron en tampón de lisis que contiene 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1% de Triton X-100, cloruro de sodio 150 mM, 10% de glicerol, ortovanadato sódico 1 mM, fluoruro de sodio 50 mM, 100 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, y un cóctel inhibidor de la proteasa comercial (Roche Molecular Biochemicals) durante 30 min en hielo. Los lisados celulares se recogieron y se determinó el contenido de proteína utilizando el método de Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). La misma cantidad de proteínas de cada muestra (40 g) se desnaturalizaron por calentamiento a 95 ° C durante 5 min con tampón de carga de Laemmli, y posteriormente cargado en la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 10%. Después de la separación, las proteínas se transfirieron a 0,45 micras membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad). Las membranas transferidas se bloquearon durante 1 hora en leche descremada en polvo 5% en TBST (25 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 125 mM, 0,05% de Tween 20) y se incubaron con los anticuerpos primarios apropiados a 4 ° C durante la noche. Las membranas se lavaron dos veces con TBST durante 10 min y se incubaron con anticuerpos secundarios de rábano picante específicos de isotipo acoplado a peroxidasa durante 1 hora a temperatura ambiente. Los complejos inmunes se detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada con sustrato. (Supersignal West Pico; Pierce) y se cuantificaron utilizando el software analista /PC densitometría (Bio-Rad)
Análisis estadístico
media de los datos de experimentos independientes se normalizaron a resultar de células en el control. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces. Un análisis estadístico entre los dos grupos fue verificada por la prueba t de Student, en comparación con múltiples grupos, se realizó un análisis de la variante (ANOVA) con la prueba post hoc. La fuerza de las relaciones, el coeficiente de correlación (
r
), entre cada nivel de proteína después de la separación se determinó con el programa SPSS versión 16 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Un valor de p inferior a 0,05 se consideró como estadísticamente significativo.
Resultados
caveolina-1 agotamiento después de la célula Desprendimiento Mejora de tumores de células endoteliales de adhesión
Cav-1 fue demostrado asociarse con los potenciales metastáticos de células de cáncer de pulmón [6], [12], mientras que su papel en la adhesión de células de cáncer todavía no está claro. Para estudiar el papel de la proteína Cav-1 sobre la adhesión de células de cáncer, que primero desprendidos de las células cancerosas para imitar la etapa temprana de la metástasis, y se evaluó el perfil de expresión de Cav-1 después de la separación celular sobre veces. Se analizaron las células H460 de cáncer de pulmón cultivadas en placas de fijación ultra bajas de Cav-1 en la expresión de proteínas por Western Blot en los puntos de tiempo indicados. La Figura 1A muestra que después de la separación celular, Cav-1 disminuyó gradualmente de una manera dependiente del tiempo y se detectó la disminución significativa tan pronto como 6 h después de la separación celular. A continuación, las células suspendidas en puntos de tiempo concurrentes se sometieron al ensayo de adhesión celular monocapa como se describe en
Materiales y Métodos
. Las figuras 1A y B muestran que después de la separación celular, Cav-1 expresión disminuyó gradualmente con el concomitante tiempo con el aumento de la adhesión de células de cáncer en las superficies endoteliales, lo que sugiere el papel potencial de Cav-1 en la regulación de adhesivo cáncer. Hemos apoyado además una correlación tal, mediante la generación de una gráfica de correlación entre Cav-1 expresión y la adhesión de células del cáncer (Fig. 1 C). No sólo la reducción de estas proteínas se correlaciona bien con la mayor capacidad de las células cancerosas a adherirse en las superficies de endotelio, pero la trama también reveló un perfil altamente correlacionado con el coeficiente de correlación de 0,922
A.:
células H460 se suspendieron en placas de poli-HEMA revestida de varias veces (0-12 h) y Cav-1 de expresión fue analizada por Western Blot. Las columnas son las medias ± SD (
n = página 5). *
P Hotel & lt; 0,05 frente a
el tiempo 0. B:
Independiente células H460 se sometieron a un cultivo en monocapa de HUV-EC-C. La interacción de las células H460 y HUV-EC-C se examinó en presencia de IL-1
β gratis (10 ng /ml). se muestran contraste de fase imágenes microscópicas de los experimentos representativos.
C: Análisis de correlación Red de nivel celular Cav-1 H460-HUV-EC-C adherencia en relación con (
n
= 5).
D: células shCav-1 transfectadas-Cav-1 | Cav-1 sobreexpresado Hcav-1 o corto horquilla se construyeron y se analizó la Cav-1 de expresión por Western Blot. Las transferencias se volvieron a sondar con el anticuerpo β-actina para confirmar la igualdad de carga de las muestras. Las señales de inmunotransferencia se cuantificaron por densitometría, y datos de la media de experimentos independientes se normalizaron a los resultados. Las columnas son las medias ± SD (
n = página 3), *
P Hotel & lt; 0,05 frente a células H460.
E:
Hcav-1, se separaron las células H460 y shCav-1 durante 3 horas y se añadió a una cultura del HUV-EC-C. Las columnas son las medias ± SD (
n = página 3), *
P
. & Lt; 0,05 frente a células H460
Para confirmar que Cav-1 atenúa el cáncer la adhesión celular a las células endoteliales, hemos explorado el efecto de diferentes ectópicos Cav-1 los niveles de expresión en las células H460 adhesión al endotelio. Establecimos Cav-1 que sobreexpresan (Hcav-1) las células, a corto horquilla (sh) mediada Cav-1 desmontables células (shCav-1) mediante transfección estable. Los clones transfectantes se analizaron para Cav-1 de expresión en comparación con sus células H460 parentales a través de Western Blot (Fig. 1D). Es de destacar que las células de control transfectadas generados a partir de plásmidos de control, pDS_XB-YFP y control de shRNA plásmido A, también se evaluaron para Cav-1 de expresión, sin embargo; el nivel de la proteína era comparable a la de células H460 (datos no mostrados). Cav-1 sobreexpresado, Cav-1 desmontables, y las células H460 se separaron y se sometió a ensayo de adhesión endoteliales y las células cancerosas se adhieren a las células endoteliales HUV-EC-C fueron observadas. Como era de esperar, el análisis de la adhesión celular demostró que Cav-1 células sobreexpresados exhibido la capacidad más baja para adherirse a las células HUV-EC-C, mientras que las células shCav-1 tenían la capacidad más alta. Además, las células transfectadas del vector se evaluaron de manera similar para la capacidad adhesiva y no se encontraron alteración significativa en comparación con la de las células parentales (datos no mostrados). Esto indica que Cav-1 regula negativamente la adhesión de células de cáncer al endotelio vascular.
caveolina-1 suprime el peróxido de hidrógeno y la generación de radicales hidroxilo después de la célula Desprendimiento
Nuestro estudio anterior ha demostrado que en la condición de adherido , Cav-1 en función de atenuar el estrés oxidativo causado por el tratamiento con peróxido de hidrógeno [13]. Por lo tanto, es posible que la proteína de Cav-1 puede funcionar para regular el estado redox de las células cancerosas durante la metástasis. Para estudiar el efecto de Cav-1 de proteína en la generación de ROS desprendimiento inducido, Cav-1 sobreexpresado (Hcav-1), se separaron y se incubaron en la adhesión Cav-1 knock-down células (shCav-1), y de control (H460) placas resistentes hasta puntos específicos de tiempo. Las células suspendidas se analizaron a continuación para los niveles de ROS intracelulares mediante citometría de flujo usando DCFH
2-DA como una sonda fluorescente. La figura 2A muestra que el desprendimiento de células inducida por un aumento en ROS celular de una manera dependiente del tiempo, que se suman con nuestro informe anterior [6]. El presente estudio reveló por primera vez que Cav-1 funcionó en la atenuación del desprendimiento de ROS inducida en estas células. ShCav-1 en las células que poseen la Cav-1 de expresión más bajo se demostró que presentan la mayor inducción de ROS y una inducción tal podría ser detectado tan pronto como 1 hora después de la separación (Fig. 2A), mientras que ROS celular en Cav-1 sobreexpresado (Hcav- 1) las células no fue alterada en respuesta a la retirada de las células
a:.
nivel celular ROS de H460 individual, shCav-1, y las células Hcav-1 se determinó mediante citometría de flujo utilizando H
2DCF-DA como una sonda de fluorescencia. Las columnas son las medias ± SD (
n = página 3), *
P Hotel & lt; 0,05 frente a
el tiempo 0. B:
H460, shCav-1, y Hcav- 1 células fueron tratadas con Mn (III) tetrakis (ácido 4-benzoico) de cloruro de porfirina (MnTBAP, 50 mM), catalasa (CAT, 7500 u /ml), formiato de sodio (NaF, 2,5 mM), o deferoxamina (DFO, 1 mM). El nivel de ROS intracelular de estas células se determinó mediante H
sonda 2DCF-DA. Las columnas son las medias ± SD (
n = página 5), *
P Hotel & lt; 0,05 frente unido de control (
Hora de 0
), y#
P
& lt; 0,05 frente al control no tratado en el momento correspondiente.
C:
nivel de peróxido de hidrógeno de las células se determinó mediante el uso de lector de microplacas Amplex Red. Las columnas son las medias ± SD (
n = página 3), *
P Hotel & lt; 0,05 frente a células de control a
hora 0. D:
inducción El radical hidroxilo se determinó por HPF. Las columnas son las medias ± SD (
n = página 3), *
P Hotel & lt; 0,05 frente a células de control a
el tiempo 0.
Además, los inhibidores específicos de ROS se utilizaron para evaluar ROS específica que eran hasta reguladas en estas células. CAV-1 sobreexpresado, CAV-1 derribar, y las células H460 fueron pretratados con inhibidores de ROS específicas que eran MnTBAP (un inhibidor de anión superóxido), catalasa (un inhibidor de peróxido de hidrógeno), deferoxamina (un inhibidor de radicales hidroxilo), y formato de sodio ( se determinaron un eliminador de radicales hidroxilo), y los niveles de ROS después de la separación por 0-3 h. La Figura 2B indica que el tratamiento con catalasa, formiato de sodio, y la deferoxamina podría bloquear la inducción de ROS en estas células, lo que sugiere que el peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo primario específico eran ROS hasta reguladas después de la separación celular.
El efecto de se evaluó el próximo CAV-1 en peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo producidos por estas células. Amplex rojo, una sonda de detección específica para el peróxido de hidrógeno, y HPF, una sonda de detección específica para el radical hidroxilo, se utilizaron para determinar tales específico ROS en las células separadas. Figuras 2C y D indican que el desprendimiento de células aumentó las señales de peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo sondas específicas de una manera dependiente del tiempo. Es importante destacar que la señal de peróxido de hidrógeno o radical hidroxilo era apenas detectable en Cav-1 células sobreexpresados, mientras que dichas señales de ROS se potenciaron en las células que expresan un bajo nivel de Cav-1. Estos resultados indicaron que Cav-1 atenuado peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo generaciones en células de cáncer de pulmón en suspensión.
peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo Regular la adhesión celular del cáncer a las células endoteliales a través del mecanismo VCAM-1 dependiente de
ROS se demostró en muchos estudios para desempeñar un papel clave en la regulación de los comportamientos celulares de cáncer [11]. Junto con el hallazgo anterior que indica que Cav-1 atenuado peróxido de hidrógeno y formaciones radicales hidroxilo durante el desprendimiento de células, se investigó si el peróxido de hidrógeno y el juego radical hidroxilo un papel en la regulación de la adhesión de células de cáncer. células de cáncer de pulmón se incubaron con diversas conocida específica ROS agentes moduladores como se describen y las células se sometieron a los ensayos de adhesión. La Figura 3A indica que el tratamiento de las células con un inhibidor de la superóxido MnTBAP sólo tuvo un efecto mínimo e insignificante sobre la actividad adhesiva de células de cáncer, mientras que la adición de catalasa, formiato de deferoxamina, y sodio inhibió significativamente la adhesión de células H460 al endotelio superficie. Estos resultados sugieren que el peróxido de hidrógeno y el anión radical superóxido hidroxilo pero no son los ROS que potencian la capacidad de adherencia de estas células cancerosas a las células endoteliales vasculares
A:. Células H460
se dejaron sin tratar o tratados previamente con Mn (III) tetrakis (ácido 4-benzoico) de cloruro de porfirina (MnTBAP, 50 mM), catalasa (CAT, 7500 u /ml), formiato de sodio (NaF, 2,5 mM), o deferoxamina (DFO, 1 mM) y luego individual por 3 h antes del ensayo de adherencia. Las columnas son las medias ± SD (
n = página 3), *
P Hotel & lt; 0,05 frente al control no tratado.
B: células H460
fueron tratados con 100 M H
2O
2 o 100 M H
2O
2 y 50 mM de FeSO
4 y se somete a la HUV- EC-C superficie que fue bloqueada por los anticuerpos E-selectina VCAM-1, ICAM-1, o. se muestran contraste de fase imágenes microscópicas de los experimentos representativos. Las columnas son las medias ± SD (
n = página 3), *
P
. & Lt; 0,05 frente al control no tratado
Las evidencias han sugerido que las células endoteliales moléculas de adhesión (ECAMs) juegan un papel importante en la interacción de células de cáncer-endotelial [15]. La activación de las células endoteliales por la IL-1
β
indujo la expresión de ECAMs saber, VCAM-1, ICAM-1 y E-selectina en las superficies celulares endoteliales, y estas proteínas facilita la unión de las células del cáncer [15]. Para confirmar el papel de peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo en la interacción de células de cáncer-endotelial y para definir las moléculas de adhesión afectados, se bloquearon las superficies endoteliales con anticuerpos específicos frente a VCAM-1, ICAM-1 y E-selectina, antes de la adhesión de células de cáncer . Además, las células de cáncer se trataron con peróxido de hidrógeno exógeno en ausencia o en presencia de sulfato ferroso para confirmar el papel de peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo, respectivamente.
Figura 3B indica que el peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo cáncer significativamente mayor la adhesión celular a las células endoteliales, lo que confirma el papel de la mencionada ROS en la adhesión de células de cáncer. Curiosamente, el bloqueo de endotelio con los anticuerpos VCAM-1 podría suprimir el efecto de peróxido de hidrógeno y sulfato ferroso en la propiedad adhesiva de estas células cancerosas mientras que los anticuerpos contra ICAM-1 y E-selectina no tuvieron efectos significativos. Estos resultados indican que el peróxido de hidrógeno y de mayo de radical hidroxilo, al menos en parte, regulan la interacción de las células cancerosas a través de la superficie endotelial mecanismo VCAM-1-dependiente. Además, Cav-1 puede disminuir la propiedad de adherencia de las células cancerosas mediante la atenuación de peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo.
Cav-1 Suprime ROS Generación tras celular Desprendimiento través de PI3K /Akt
Después de haber demostrado que Cav-1 capacidad cáncer atenuada para adherirse a un endotelio por la disminución de peróxido de hidrógeno y radicales celular up-regulaciones hidroxilo, y la evidencia indica que Cav-1 regula varios comportamientos de células durante el desprendimiento de células a través de PI3K /Akt vía [11]. Para confirmar aún más el papel de Cav-1 en la señalización Akt, que supervisó la activación de Akt fosforilada en términos de (serina 473) Akt. De acuerdo con la conclusión anterior [16], encontramos que el aumento del nivel de activación de Akt en las células Hcav-1 en comparación con la de las células H460 y shCav-1 (Fig. 4A). Además, se encontró que el desprendimiento de células disminuyó significativamente el nivel de Akt activado en casi todas las células. Mientras fosforilada (serina 473) Akt en células shCav-1 resultó ser más afectado por un desprendimiento de tales células, el nivel de Akt activado en Hcav-1 apenas se alteró (Fig. 4A).
a:
H460, shCav-1, y las células Hcav-1 se separaron y se suspendieron en placas de poli-HEMA recubierto para 0-3 h. P473-Akt y nivel pan-Akt en estas células se determinó mediante anticuerpos específicos para P473-Akt y pan-Akt. Las columnas son las medias ± SD (
n = página 3), *
P Hotel & lt; 0,05 frente a células H460 a
Hora de 0
,
#P Hotel & lt; 0,05 frente a células de control que corresponde a
hora de 0
.
B:
lisado de H460, shCav-1, y Hcav-1 células fueron utilizados para la investigación de PTEN, PTEN fosfo-(/Thr382 /383 Ser380) expresión. fracción microsomal Caveolae (M) se preparó como se describe en materiales y métodos y se utiliza para la investigación de PTEN (M). EGFR se utilizó como un marcador para la fracción caveolae. Las columnas son las medias ± SD (n = 3), *
P
& lt; 0,05 vs. células H460.
C: células H460
se dejaron sin tratar o tratadas previamente durante 2 h con 10 y 50 mu M LY294002 a continuación se separaron las células durante 3 h y se analizaron para los niveles de P473-Akt y Akt. Las columnas son las medias ± SD (
n = página 3), *
P Hotel & lt; 0,05 frente al control no tratado.
D: células
H460 se trataron con LY294002 y determinaron para ROS, el radical hidroxilo, y la producción de peróxido de hidrógeno por DCFH
2-DA, HPF, Amplex Red, respectivamente. Las columnas son las medias ± SD (
n = página 4), *
P Hotel & lt; 0,05 frente al control no tratado a
Hora de 0
,#
P
& lt; 0,05 frente al control no tratado a
3 h. E:
células ShCav-1 y Hcav-1 se trataron con LY294002 y análisis de ROS celular utilizando DCFH
2-DA. Las columnas son las medias ± SD (
n = página 3), *
P
. & Lt; 0,05 frente al control no tratado
Desde la fosfatasa y tensina homólogo eliminan en el cromosoma diez (PTEN) es un regulador negativo importante de la vía PI3K señalización /Akt, también se realizó el experimento para dilucidar el papel de Cav-1 en PTEN. Nuestros resultados indican que el PTEN fue hasta reguladas en la porción citoplasmática (C), pero las células (Hcav-1) en comparación con los de las células H460 (Fig las reguladas en la fracción caveolas microsomal (M) en Cav-1 sobreexpresado. 4B ). Por el contrario, Cav-1-derribar las células expuestas a los perfiles opuestos, lo que sugiere que Cav-1 regula la compartimentación de PTEN. Con el fin de evaluar la actividad de PTEN, el análisis de transferencia Western de la PTEN fosforilada C-terminal en Ser380, Thr382 y Thr383 que promuevan la estabilidad PTEN pero disminuir las actividades PTEN [17], se realizó. La Figura 4B muestra que activaron PTEN se redujo significativamente en las células Hcav 1 con las observaciones que el PTEN fosforilada (en Ser380, Thr382 y Thr383) se incrementaron significativamente. Junto con el hallazgo que indica que la fosforilación de una proteína tal en las células ShCav-1 se redujo, Cav-1 se demostró en el estudio presencia que regula negativamente la condición de activado de PTEN y dicha regulación puede, al menos en parte, sostenido el nivel de Akt fosforilada.
para probar si la alteración en Akt fosforilada afecta el estrés oxidativo celular, un inhibidor de PI3K LY294002 se utiliza para suprimir la activación de Akt. células H460 se incubaron con un inhibidor de PI3K LY294002 a las concentraciones de 10 y 50 m, y Akt fosforilada y los niveles-Akt se determinó por transferencia de western (Fig. 4C). LY294002 a los 10 y 50 micras fueron capaces de reducir P473-Akt (Fig. 4C). El efecto de LY294002 sobre ROS inducida por el desprendimiento de células se controló por DCFH
2-DA, HPF y Amplex rojo. Aparentemente, PI3K inhibidor fue capaz de aumentar el estrés oxidativo celular como se indica por el aumento significativo de la señal de fluorescencia DCF. Por otra parte, el ROS específico, a saber hidroxilo peróxido de radical y el hidrógeno, se encontraron para ser aumentado significativamente en respuesta al tratamiento de inhibidor de PI3K en células H460 (Fig. 4D).
Curiosamente, el tratamiento de LY294002 a 10 y 50 mM podrían revertir a efecto de Cav-1 en la supresión de la reducción de ROS en células Hcav-1. La figura 4E muestra que la señal de ROS en células Hcav-1 tratados con LY294002 se incrementó notablemente, en comparación con la de las células Hcav-1 no tratados. En contraste, el nivel de ROS en células shCav-1 fueron apenas afectada por el tratamiento de LY294002. Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que Cav-1 regula la formación de ROS después de la separación celular mediante el mantenimiento de la activación de la vía PI3K /Akt.
Discusión
Hasta ahora, una serie de proteínas relacionadas con el cáncer tiene han identificado y utilizado para aplicaciones específicas, incluyendo los biomarcadores para la detección precoz, el pronóstico y dianas moleculares para el diseño contra el cáncer [18]. Según la hipótesis ampliamente aceptada de que no todos los tumores primarios son capaces de adherirse en las superficies endoteliales, pero ciertas células cancerosas que poseen una capacidad innata o adaptativa son capaces de adherirse en la superficie de las células endoteliales vasculares y para formar metástasis [19]. Muchas proteínas reguladoras fueron identificados como supresor de tumores o proteínas promotoras tumor; sin embargo, en el caso de Cav-1, se informó de ambas funciones. CAV-1 fue descrita por primera vez como una proteína supresora de tumores ya que la baja regulación de la CAV-1 se encontró durante la transformación celular [7]. Por el contrario, Cav-1 ha demostrado potenciar la progresión del cáncer y el aumento de la evidencia ha indicado su papel como promotor del cáncer [20]. CAV-1 ha demostrado funcionar como un importante mediador de múltiples vías de señalización pro-supervivencia [21] - [23]. Además, se demostró Cav-1 expresión a aumentar en varios tipos de cánceres humanos, incluyendo de pulmón, mama, próstata, y cánceres de páncreas, y esta regulación se asoció con un alto grado de metástasis [20], [24] - [28]. A pesar de que Cav-1 ha demostrado potenciar la metástasis del cáncer de pulmón mediante la mejora de la resistencia a la anoikis [9] y la invasión y la migración [11], el presente estudio proporcionan el efecto inhibidor de Cav-1 sobre la adhesión de cáncer-endotelio que no ha sido demostrado. <