Extracto
La desregulación del factor de crecimiento transformante-β (TGF) en la vía de señalización de ovario epitelial cáncer se ha informado, pero el mecanismo exacto subyacente perturbado señalización TGF en la enfermedad sigue siendo poco clara. Se realizó la inmunoprecipitación de la cromatina seguida de secuenciación (chip-ss) para investigar el cribado de todo el genoma de la inducida por TGF SMAD4 unión en el cáncer epitelial de ovario. Después de la estimulación TGF de la línea celular de cáncer epitelial de ovario A2780, se identificaron 2.362 loci de unión SMAD4 y 318 expresados diferencialmente los genes diana SMAD4. Examen amplio de loci con destino a SMAD4, reveló cuatro modelos de unión distintas: 1) basales; 2) Shift; 3) Sólo Estimulado; 4) Sólo no estimulada. TGF estimulada loci Smad4 unidos se clasifican principalmente como sea estimulada solamente (74%) o Shift (25%), lo que indica que TGF-estimulación altera los patrones de unión SMAD4 en células de cáncer de ovario epitelial. Además, basándose en el análisis de redes de regulación de genes, se determinó que la, red de regulación SMAD4 dependiente inducida por TGF era notablemente diferente en el cáncer de ovario en comparación con las células normales. Es importante destacar que los genes diana TGF /SMAD4 identificados en la línea celular de cáncer epitelial de ovario A2780 fueron predictivos de la supervivencia del paciente, basado en la minería in silico de las bases de datos de pacientes públicamente disponibles. En conclusión, nuestros datos ponen de relieve la utilidad de la tecnología de secuenciación de próxima generación para identificar los genes diana SMAD4 en todo el genoma en el cáncer de ovario epitelial y vincular aberrante TGF /Smad señalización a la tumorigénesis de ovario. Por otra parte, los loci de unión SMAD4 identificado, en combinación con perfiles de expresión génica in silico y la minería de datos de cohortes de pacientes, puede proporcionar un enfoque poderoso para determinar posibles firmas de genes con la investigación traslacional biológica y futuro en los cánceres de ovario y otros
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cita: Kennedy BA, Deatherage DE, Gu F, B Tang, Chan MWY, Nephew KP, et al. (2011) chip-ss Definido genoma completo mapa de los objetivos de TGF /SMAD4: Implicaciones con el resultado clínico de cáncer de ovario. PLoS ONE 6 (7): e22606. doi: 10.1371 /journal.pone.0022606
Editor: Patrick Tan, Duke-Universidad Nacional de Singapur Escuela de Medicina de Graduados, Singapur
Recibido: 22 Febrero, 2011; Aceptado: June 26, 2011; Publicado: July 25, 2011
Derechos de Autor © 2011 Kennedy et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de los Institutos nacionales de Salud U54CA113001, R01CA069065 y el Instituto Nacional del cáncer CA85289 y por los fondos del Centro Integral del cáncer de la Universidad Estatal de Ohio y la Universidad del Estado de Ohio Informática Biomédica. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el factor de crecimiento-β transformación (TGF) vía de señalización juega un papel importante en el control de la proliferación, la diferenciación y otros procesos celulares incluyendo el crecimiento de ovario de células epiteliales de la superficie (OSE) [1], [2]. Desregulación de la señalización TGF se observa con frecuencia en el cáncer de ovario epitelial (EOC) y puede ser crucial para el desarrollo de EOC [3], [4]. Los efectos del TGF son mediados por tres ligandos TGF - TGFß1, TGFβ2 y TGFβ3, actuando a través de TGF tipo 1 y tipo 2 receptores [5] - [7]. TGFBR2 es el receptor específico para ligandos TGF. El complejo receptor funcional regula la activación de Smad aguas abajo y las vías no Smad [8]. Los fosforilados tipo 1 del receptor de reclutas y fosforila regulados por el receptor Smads R-Smads). De los cinco R-Smads en los mamíferos, el complejo TGFBR2-ALK5 activa SMAD2 y SMAD3, mientras que el complejo TGFBR2-ALK1 activa Smad1, Smad5 y Smad8 [9]. Activado R-Smads forman complejos heterómeros con la pareja común Smad (co-Smad; SMAD4 en mamíferos) y translocan al núcleo [6]. Como la afinidad del complejo Smad activado para el elemento de Smad-unión es insuficiente para apoyar asociación con promotores endógenos de genes diana, los complejos de Smad debe asociar con otros de unión al ADN de factores de transcripción para regular la expresión [7]. Numerosos estudios han demostrado que varias familias de factores de transcripción, tales como el forkhead, homeobox, dedo de zinc, LEF1, Ets, y las familias hélice-bucle-hélice básico (bHLH), puede servir como proteínas asociadas SMAD4 para lograr una alta afinidad y selectividad por promotores diana con los elementos de unión apropiadas [10] - [14].
La línea epitelial de ovario humano A2780 célula de cáncer es sensible a la cis-diaminodicloroplatino (II) (cisplatino), uno de los agentes de tipo platino ( carbolatin o cisplatino) usados en el tratamiento del cáncer de ovario. Además de servir como un modelo útil para el estudio de la enfermedad sensible a los fármacos, las células A2780 muestran desregulación parcial TGF, indicado por sólo un modesto aumento en la expresión SMAD4 y la transducción de SMAD4 existente desde el citoplasma al núcleo después de TGF estimulación [15]. Por lo tanto, esta línea celular también es un sistema modelo adecuado para la realización de la cartografía de todo el genoma de los genes diana SMAD4 y la identificación de los genes diana TGF desregulados /SMAD4 y vías implicadas en pacientes con cáncer de ovario.
comparaciones recientes de CHIP- ss (inmunoprecipitación de la cromatina-secuenciación) a los enfoques basados en arreglos demostró claramente que la tecnología chip-ss produjo una resolución más alta, mayor profundidad y una mayor precisión de la cartografía de unión al factor de transcripción y modificaciones de las histonas en un genoma de gran escala [16] - [18]. En el presente estudio, hemos utilizado la tecnología chip-ss para estudiar la regulación TGF /SMAD4 en la línea celular de cáncer de ovario A2780 platino-sensible. Estamos perfiladas SMAD4 loci siguientes estimulación con TGF vinculante. El uso de métodos computacionales, hemos investigado el patrón de unión SMAD4 y lo comparó con el patrón de unión SMAD4 tanto de una célula epitheilial normal de la superficie del ovario inmortalizado (IOSE) de nuestro estudio anterior [12] y queratinocitos humanos (HaCaT) de Koinuma et al [11 ]. Además, hemos generado firmas de genes regulados por TGF SMAD4 /y se utiliza un
in silico
enfoque de la minería para correlacionar las firmas identificadas con los datos de resultados clínicos a partir de dos cohortes de pacientes con cáncer de ovario a disposición del público. Nuestro enfoque integrador reveló asociaciones significativas de las redes de regulación TGF /SMAD4 tanto con la supervivencia libre de progresión y global en pacientes con cáncer de ovario. Mediante la identificación de miles de loci de unión SMAD4 así como los genes regulados, nuestros datos proporcionan tanto un nuevo recurso para estudiar el mecanismo que subyace a desregulada de señalización en las células de cáncer de ovario TGF, así como potenciales biomarcadores pronósticos para el futuro de la investigación traslacional del cáncer de ovario.
Resultados
SMAD4 ocupación de genoma completo definido por la tecnología chip-ss
Nuestros estudios anteriores [12], [15], [19], [20] y otros [2], [ ,,,0],4], [21] - [23] han tratado de establecer y caracterizar los mecanismos moleculares de la señalización mediada por TGF dysregulated en células de cáncer de ovario y células de cáncer de ovario resistentes al cisplatino adquiridos. Con el fin de aclarar aún más los detalles de los mecanismos subyacentes, se utilizó la tecnología chip-ss para identificar los lugares del genoma vinculados por SMAD4 en las células A2780 antes y después de la estimulación TGF.
El uso de chip-ss, todas las muestras fueron inicialmente secuenciado para generar un conjunto de bajo nivel Lee (cada lectura tiene una longitud de 36 pb) del sistema de iluminación /Solexa GAII (Tabla S1) que van desde ~43 millones de ~51 millones de lecturas por muestra. Después de mapeo para el montaje de UCSC HG18 humano, un conjunto de ~26 millones y millones de ~32 asignada lee con se obtuvieron genómica lugares únicos para no estimulada A2780 y A2780 TGF-estimulado respectivamente. A continuación, aplica nuestro programa de detección de pico llamando, CORREA, [24], [25] (véase Materiales y Métodos) para identificar los loci de unión de SMAD4 en estas dos condiciones. En resumen, nuestro programa CORREA utiliza un método de puntuación percentil para determinar el valor umbral de enriquecimiento para cada uno de los percentiles superiores de todas las regiones de unión, seguido de la identificación del número de loci de unión en cada nivel percentil. Con el fin de determinar la importancia de cada percentil, un conjunto de lecturas al azar simulados se utiliza como fondo para estimar la tasa de falso descubrimiento (FDR). Nuestros datos chip-ss confirmaron múltiples loci previamente identificados en diferentes tejidos y tipos celulares, incluyendo Gadd45a, CTGF, JAG1, LEMD3 [14], MYC [26], EDN1, RYBP, el horario de verano, y BCAT1 [11] vinculante SMAD4.
ocupación basal.
Se identificaron 2.009 loci de unión SMAD4 en la condición basal (no estimulada) en la línea celular A2780 (Tabla S1). Se encontró que el 1499 (74,6%) loci se encuentra dentro de +/- 100 kb de un gen RefSeq conocido [27]. Sorprendentemente, sólo pequeña parte (267 de 1499, 13,3%) estaban dentro de la región promotora (+/- 8 kb), de un gen, mientras que la mayoría de los loci de unión eran o 10 kb aguas arriba de la 5'TSS o 10 kb aguas abajo 3 'TSS (Figura 1 A - línea roja). Este genoma completo análisis imparcial ubicación amplia sugiere que muchos otros estudios de genoma completo previos basados en la tecnología de chip-chip de promotor [11], [12], [28] sólo se pueden identificar subconjuntos de genes diana SMAD4
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) la distribución de la localización de loci de unión SMAD4 en un histograma en base a su relación con un conocido más cercano RefGene 5'TSS. B) Clasificación de los loci de unión SMAD4 en cuatro modelos de unión. Sólo estimuladas loci de unión son aquellos cuyos loci asociados RefGene sólo ha vinculante sólo en el conjunto estimulada, lo mismo para no estimulada. unión de desplazamiento loci tienen un loci de unión que aparecen en el mismo gen en ambas condiciones y que son mayores que 1000 nt aparte. Basal loci de unión aparecen en el mismo gen en ambas condiciones pero son menos de 1000 nt aparte. C) Una captura de pantalla que muestra un patrón de unión LRRC17, donde se une a SMAD4 5'TSS de LRRC17 después de la estimulación TGF, se clasifica a estimulada Sólo Encuadernación. D) La abundancia de ADN después SMAD4 chip tire hacia abajo en comparación con el ADN presente siguiente tire hacia abajo con el anticuerpo IgG no específica como se determina mediante PCR cuantitativa Syber verde. U y S usados para representar las regiones no estimulados y estimulados de unión de SLC40A1, respectivamente. * Representa una prueba t p-valor inferior a 0,05 y denota un enriquecimiento significativo en relación con el control de IgG.
TGF-estimulado unión.
Tras la estimulación con TGF, 2.362 SMAD4 vinculante loci fueron identificados (Tabla S1). En general, la distribución de la ubicación de SMAD4 loci de unión después de la estimulación TGF es muy similar a la de antes de la estimulación (Figura 1A - línea de negro para la línea estimulada y rojo para no estimulada). Sin embargo, los modelos de unión entre dos condiciones (antes y después de la estimulación TGF) son dramáticamente diferentes (Figura 1B). En primer lugar, quitamos estos loci de unión situados lejos de cualquier RefSeq genes conocidos (+/- 100 kb) y luego se clasificaron (1.723 loci para estimulado y no estimulado por 1.499 loci) en cuatro diferentes modelos de unión: 1) basales de unión - dos loci de unión están asociados a un mismo gen y dentro de 1 kb de distancia entre sí (es decir, sin cambios de unión); 2) Shift Encuadernación - dos loci de unión están asociados con un mismo gen en ambas condiciones, pero son más de 1 kb aparte una de la otra; 3) Sólo Estimulado Encuadernación - un locus de unión asociada a un gen sólo en la condición estimulada; 4) no estimulada Sólo Encuadernación - un locus de unión asociada a un gen sólo en el estado no estimulado. En base a la clasificación anterior, se determinó que el 74,2% (1.279 de 1.723) y 73,5% (1.102 de 1.499) de los loci de unión estaban en el estimulada Sólo las categorías únicamente vinculado vinculantes y no estimulados, respectivamente. Mientras que 24,8% (429 de 1723) y 25,5 (382 de 1499) loci de unión se clasifican en la categoría Encuadernación Shift para el estimulado y el estado no estimulado, respectivamente, sólo el 15 loci de unión en cada condición (0.9% y 1.0%, respectivamente) cayó en la categoría Encuadernación basal. Nuestros resultados de los mapas genómicos mostraron que la estimulación de las células TGF cáncer de ovario puede alterar el paisaje de los patrones de unión SMAD4. Una lista completa de modelos de unión clasificadas se muestra en la Tabla S2.
Además, con el fin de verificar que la estimulación TGF dio lugar a los cambios de unión que observamos en los datos de chip-ss, elegimos al azar un conjunto de 22 objetivos identificado por el análisis realizado y chip-qPCR utilizando ADN aislado de una inmunoprecipitación que era distinto del ADN utilizado para el chip-ss. Nuestros validaciones chip-qPCR no sólo confirmaron los objetivos identificados en los datos del chip-ss, pero también demostraron, además, que la señalización TGF exógeno activado es capaz de producir cambios drásticos en SMAD4 vinculante patrones (Figuras 1C, 1D y las figuras S1 A, B).
Regulación de la expresión del gen diana SMAD4 estimulada por TGF A2780 en
a continuación, se realizó la expresión de genes microarrays para determinar el estado de la expresión de genes diana SMAD4 después de la estimulación TGF. A2780 mRNA a partir de tres réplicas biológicas independientes de antes y después de 3 horas de estimulación TGF se preparó y se ensayó en Affymetrix U133 Plus 2 Plataforma. En general, 3.191 genes fueron identificados como significativamente arriba o abajo-regulada después de la estimulación con TGF al menos un cambio log2 0,5 veces en la expresión y el valor de p inferior a 0,1 (Figura 2A). Después de examinar la correlación con 1.443 genes diana SMAD4 TGF-estimulado (correspondiente a 1723 SMAD4 loci de unión en el estado estimulado), una mayoría (2873 de 3191) de los genes con expresión diferencial en A2780 sorprendentemente carecido SMAD4 loci de unión, donde 318 genes tenían al menos loci que vinculan a uno SMAD4 y mostró al menos un cambio de expresión log2 0,5 veces después de 3 horas de estimulación TGF (Figura 2B). Detalles de 3.191 genes expresados diferencialmente significativamente están disponibles en los cuadros S4 y 318 genes en el cuadro S5.
A) Un mapa de calor de la expresión de los genes veces los cambios entre la no estimulada y el TGF estado estimulado, que muestra tres grupos de genes , hasta reguladas, ningún cambio, y las reguladas. genes regulados hacia arriba y abajo se definen por tener un cambio log2 veces superior a 0,5 o inferior a -0,5, respectivamente. B) Una comparación entre los genes con loci de unión SMAD4 (1443) en el TGF condiciones, con todos los genes que muestran expresión diferencial (3193) estimuló, que muestra tres grupos diferentes, los que tienen expresión diferencial y ningún loci de unión SMAD4, aquellos con ninguna expresión diferencial y un locus de unión SMAD4 y los que tienen ambos. C) GO anotaciones para los tres genes de grupos diferentes que muestran en el diagrama de Venn (B). D) el nivel de expresión de ARN según lo determinado por QRT-PCR en relación con los niveles de expresión de GAPDH. Los experimentos se realizaron por triplicado biológica. * Representa una prueba t p-valor inferior a 0,05 y denota una diferencia significativa en la expresión entre las condiciones no estimuladas y estimuladas.
Análisis
Gene ontología mostró que los genes expresados diferencialmente con loci de unión SMAD4 fueron significativamente enriquecido para los genes implicados en la morfogénesis y la parte de la célula proteínas del desarrollo (Figura 2C-gene & amp; Loci), en línea con los estudios previos en diferentes tipos de células [12], [36]. También se encontró que SMAD4 genes asociados que carecen de la expresión diferencial se enriquecido para los genes con dominio y el polimorfismo de tipo EGF que sugieren que diferentes vías de señalización pueden mediar funciones SMAD4 distintos de señalización de TGF (sólo Figura 2C-Loci) de unión, mientras que el gran conjunto de diferencialmente expresado los genes que carecen de loci de unión SMAD4 estaban involucrados en las funciones inmunológicas y la matriz extracelular proteica. Tras examinar una mayor restricción de valor de p de 0,05 y doble cambio de 0,5 para TGF estimulado genes expresados diferencialmente, se obtuvo un conjunto de 1763 genes. De estos genes, se encuentran 184 (10,4%) genes que tienen al menos un sitio de unión a TGF estimula SMAD4 (Tabla S6). Este porcentaje es muy similar al conjunto de datos de los que 318 (10%) de 3191 genes expresados diferencialmente tienen al menos un sitio de unión a TGF estimula SMAD4 (Tabla S5). El análisis de la función GO también fue muy similar en las principales categorías (Figura S2). Para confirmar aún más diferenciales expresado SMAD4 genes específicos que resultan de la estimulación TGF, elegimos al azar un conjunto de 18 objetivos identificados por nuestro análisis y se realizó una RT-qPCR. Más de 70% (13 de 18) genes fueron validados por RT-qPCR como se muestra en la Figura 2D y la Figura S3. Una lista de los cebadores diseñados se muestra en la Tabla S7.
SMAD4 de genes dependientes de las redes de regulación de TGF-inducida por las células de cáncer de ovario
Nuestro estudio anterior [12] y un estudio de Koinuma et al [ ,,,0],11] han identificado un conjunto de 150 TGF estimulado SMAD4 genes diana en IOSE (una línea de células epiteliales de la superficie del ovario inmortalizado) y un conjunto de 92 TGF estimulada SMAD4 genes diana en HaCaT (una línea celular de queratinocitos inmortalizados). No fue sorprendente encontrar solapamiento limitado de sólo 6 de 150 en IOSE, 6 de 92 en HaCaT, y 1 para los tres estudios en común con los 318 SMAD4 genes diana en este estudio (Figura 3A) ya que sólo una, A2780, se una línea celular de cáncer y los otros dos son líneas de células normales. Otra posibilidad para tales bajas tasas de superposición es que puede ser debido a los objetivos limitados identificados utilizando array promotor (ChIP-promotor-chip). GO análisis [29] también mostró genes diana en HaCaT y IOSE eran principalmente involucrado en la regulación de la proliferación celular (o anti-apoptosis) y el proceso de desarrollo (desarrollo muscular), que eran diferentes de genes diana en A2780 (Figura 3B).
a) Un diagrama de Venn muestra la comparación de TGF /SMAD4 genes diana en tres tipos de células diferentes. B) GO anotaciones para los genes únicos para cada tipo de célula.
Para comparar aún más la diferencia del gen de información regulatoria SMAD4 dependiente estimulada por TGF entre estos tres tipos de células, se aplicó un enfoque analítico computacional hemos desarrollado previamente [30] para construir las redes reguladas SMAD4-dependientes en HaCaT, IOSE y A2780, respectivamente (Figura 4). En pocas palabras, nuestro enfoque analítico computacional comenzó con conjuntos de datos basados en chip y los datos de expresión génica. Cada SMAD4 unión wa loci coincidentes a conocer un documento de identidad RefSeq gen que fueron entonces analizada para la expresión diferencial de genes. Un conjunto de genes diana expresados diferencialmente SMAD4 después de la estimulación TGF se utiliza más para encontrar el factor de transcripción más significativo (TF) parejas de unión por ChIPMotifs [31] o ChIPModudles [32], que se utilizaron como TFS Hub. La conexión TF-gen Hub se determinó mediante el escaneo de la PWM TFS Hub 'en todos los loci de unión y se usó una permutación de prueba para probar la fiabilidad de cada conexión de la red. La red de regulación resultado fue visualizado por Cytoscape [33].
Se identificaron seis TFS Hub, GFI1, NR3C1, SOX17, STAT4, ZNF354C, y TCF8 de 318 genes diana SMAD4-dependientes en las células A2780, mientras que cuatro TFS Hub, LEF1 (TCF), ELK1, COUPTF (NR2F5), y E2F, fueron identificados en las células IOSE por nuestro estudio anterior utilizando un enfoque (modelo CART) similares [12]. Nuestro enfoque analítico computacional también identificó tres TFS Hub, E2F1, SP1 y USF, para 92 genes diana SMAD4 dependiente en células HaCaT, que era muy similar a los motivos TF identificados a partir de la Koinuma et al. estudio [11]. El motivo de la parte superior se informó en su estudio, AP1, se perdió en los resultados debido al uso de un algoritmo de clasificación avanzada en nuestros ChIPModules [32] y ser capaz de eliminar esos motivos TF que también están enriquecidos en juegos al azar. Curiosamente, también encontramos un concentrador TF E2F (E2F1) era común entre las dos células normales, pero no en común con las células A2780. Junto con el análisis de la función GO, nuestros resultados indicaron que E2F puede actuar como un factor de socio SMAD4 co-transcripción importante en la mediación de la proliferación celular en células normales, pero perdieron en células de carcinoma. Las redes reguladoras de genes resultante (GRN) para las tres células se muestran en la Figura 4. En general, nuestro análisis de la red de regulación de genes indica fuertemente que TGF estimula un mecanismo de regulación SMAD4 dependiente diferente en células de cáncer de ovario en comparación con las células normales, es decir, la SMAD4 la regulación de la red se ha convertido en "recableado" en las células de cáncer de ovario.
firmas genéticas de la selección y el resultado clínico
Una de las posibles aplicaciones prometedoras de "estudios ómicas en todo el genoma utilizando sistemas de línea celular es la identificación de firmas de genes que pueden ofrecer mejor información predictiva en comparación con los parámetros clínicos y patológicos estándar [34], [35]. Para hacer frente a la relación de TGF estimuló genes diana SMAD4 dependiente y el resultado clínico de los pacientes con cáncer de ovario, se examinaron los 307 genes diana identificados en las células A2780 en este estudio, que no fueron identificados en estudios previos de las células normales, en dos de ovario clínica diferente estudios de cohortes cáncer que habían presentado los datos de supervivencia [36], [37]. En primer lugar, se clasificaron los pacientes en subgrupos diferentes, en función de sus genes de las firmas, y luego correlacionaron los datos con la información de la supervivencia del paciente. En la minería del 153 cohorte de pacientes de Bild et al [36], hemos sido capaces de utilizar las 187 de 307 genes identificados en el conjunto de datos de expresión génica para aplicar el método de agrupación jerárquica con medidas basadas en la distancia desde la perspectiva de ensayo y error y clasificar los genes en cuatro grupos de genes (Figura 5A). Para cada uno de los cuatro grupos de genes, que agrupan aún más las 153 muestras en cuatro grupos de pacientes (PGs, la Figura 5B), y correlacionado las PGs con su información de la supervivencia. De 153 pacientes, sólo 124 tienen información completa de supervivencia, por lo que se utiliza más para las parcelas de la curva de supervivencia. Hemos encontrado que una firma de un subconjunto de 49 genes (grupo de genes G2) que fue capaz de predecir una correlación significativa de supervivencia para 62 de los pacientes con un valor de p de 0,0471 (Figura 5C, D). Específicamente PG: 4 (25 pacientes) muestran pobre supervivencia media de 31 meses en comparación con PG: 3 (37 pacientes), con una supervivencia media de 63 meses. Una parcela curva de supervivencia para los dos grupos de pacientes, PG: 3 y PG: 4 Con un 49 seleccionados al azar genes (en los que no están dentro de los 49 genes G2) mostró una prueba de log-rank p-valor de 0.1558 (Figura 5E). Debido a la información patológica limitado disponible para esta cohorte de pacientes, que no fueron capaces de correlacionar significativamente nuestras firmas genéticas con otros resultados clínicos. Sin embargo, un notable alto porcentaje de pacientes en estadio IV agrupados en PG3 mientras que todo el estadio IC y dos pacientes en estadio IIC agrupan en PG4, a pesar de un número similar de pacientes en estadio IIIC en cada uno (Tabla S8), tal vez indicando que los TGF /SMAD4 genes regulados podía ser utilizado potencialmente para clasificar un subtipo de pacientes con cáncer de ovario.
a) El resultado de la agrupación jerárquica de los 187 genes en cuatro grupos de genes, a saber, G1, G2, G3 y G4. El eje vertical representa los grupos de genes (187 genes) y el eje horizontal representa diversas muestras (153 pacientes). B) El resultado de la agrupación jerárquica de los 153 pacientes en cuatro grupos de pacientes, a saber PG: 1, PG: 2, PG: PG 3 y 4: usando el grupo G2 de 49 genes. C) La supervivencia parcela curva para el grupo de genes G2. El eje horizontal representa los meses de supervivencia y la vertical para la supervivencia por ciento (%) en el grupo de pacientes correspondiente. Totalmente cuatro grupos de pacientes, es decir, PG: 1, PG: 2, PG: PG 3 y 4: se analizan para el grupo de genes G2. D) Un diagrama detallado curva de supervivencia para los dos grupos de pacientes, PG: 3 y PG: 4, que muestra una prueba de log-rank p-valor significativo de 0.0471.E) Una parcela curva de supervivencia para los dos grupos de pacientes, PG: 3 y PG: 4 Con un 49 seleccionados al azar genes (en los que no están dentro de los 49 genes G2) que muestra el log-rank test, p-valor es 0.1558.
Cuando aplicamos el mismo
in silico
enfoque minera de la segunda cohorte de pacientes de Lu et al [37], (compuesto por 42 pacientes y 5 personas normales), los resultados mostraron que una firma de genes de 19 de los 307 genes predijo mejores tasas de supervivencia para PG4 y normales que otras PGs con un valor de p de 0,0078 (Figura S4).
Discusión
estimulada por TGF por primera vez, hemos aplicado la tecnología chip-ss de todo el genoma en todo el mapeo de, SMAD4- genes regulados dependientes en una línea celular de cáncer de ovario (A2780). Nuestros datos muestran que en comparación con el estado basal (sin estimulación TGF), la mayoría de SMAD4 loci de unión son ya sea recién obligado a cromatina (74,2%) o desplazado unido (24,8%) a la estimulación TGF, lo que sugiere TGF estimula las células cancerosas pueden alterar la paisaje de los patrones de unión SMAD4. Además, nuestro análisis reveló GO sorprendentes similitudes entre las 10 principales categorías GO para 1.443 y 1.316 SMAD4 genes diana en estimulados y no estimulados condiciones (datos no mostrados). Sin embargo, 318 genes expresados diferencialmente, que contienen al menos un estimulados loci de unión SMAD4, fueron significativamente enriquecido para GO términos más específicos, como parte de la célula y las proteínas de la morfogénesis de desarrollo. Este resultado indica que SMAD4 puede regular un conjunto muy específico de los genes diana en respuesta a la señalización de TGF, a fin de facilitar funciones específicas en ese tipo de célula a través de esta vía de señalización específica. De hecho, el análisis de IR SMAD4 genes diana y sin cambios en el nivel de expresión génica después de la estimulación TGF encontrado una de las categorías de genes enriquecidos es 'EGF como señalización', proporcionando una prueba más de que otras vías de señalización pueden modular los genes regulados SMAD4-dependientes de cáncer de ovario. Un ejemplo de ello puede ser la proteínas morfogenéticas óseas (BMP), que también están aguas arriba de SMAD4 y por lo tanto puede ser capaz de regular algunos de estos genes diana SMAD4. BMPs han demostrado ser los principales reguladores de la fisiología ovárica y que participan en el desarrollo del cáncer de ovario y otros tipos de cáncer [38] - [40]. En futuros estudios la contribución de la regulación de los genes diana SMAD4 identificados cada uno vías de señalización 'intentará ser desambiguado
Al igual que en otros resultados para factores de transcripción, incluyendo receptores de estrógenos alfa (ER) [41] -. [43 ], receptor de andrógenos (AR) [44], y de peroxisoma proliferador activado del receptor (PPAR) [45], se observó que la mayoría (& gt; 70%) de loci de unión SMAD4 situada a más de 8 kb de distancia de 5'TSS de un conocido gen RefSeq. Esto podría sugerir los loci de unión TGF llegado muy cerca al promotor a través de un bucle de cromosomas a la estimulación TGF. Curiosamente, nuestro análisis
de novo
motivo también identificó un motivo SMAD-como en un conjunto de loci de unión 5-distal, pero no en un conjunto de 5'-promotor loci (datos no mostrados). Nuestro análisis de la ubicación de todo el genoma también señala la importancia de las tecnologías de secuenciación de todo el genoma de toda-, como demostramos muchos loci de unión están muy lejos de la 5'TSS de un gen conocido y por lo tanto una tecnología promotor matriz puede pasar por alto muchos loci unión a la diana de un factor de transcripción. Nuestros estudios futuros se centrarán en la realización de chip-3C-qPCR para confirmar si estos loci de unión distales están de hecho relacionados con estos genes en particular, lo que podría descubrir el mecanismo subyacente de TGF /SMAD4 regulación génica mediada.
Un aspecto importante de este estudio es el uso de
in silico
la minería de datos de cohortes de pacientes disponibles al público para identificar a un subgrupo de TGFß /SMAD4 genes diana como una firma genética para predecir los resultados clínicos (supervivencia). Por lo que sabemos, éste es el primer estudio que intente utilizar TGF señalización genes regulados de respuesta SMAD4 clasificar a los pacientes de cáncer de ovario en diferentes subtipos de los grupos de pacientes, así como predecir pobre supervivencia de las buenas poblaciones de supervivencia con significación estadística (Figura 5). Por lo tanto, la combinación de chip-ss identificado loci de unión, perfiles de expresión génica, y un
in silico
minera de cohortes de pacientes pueden proporcionar un enfoque poderoso para la identificación de posibles firmas de genes con importancia biológica y clínica.
en conclusión, nuestro estudio proporciona el primer mapa de todo el genoma completo de miles de objetivos TGF /SMAD4 en una línea celular de cáncer de ovario, que aún podría ser utilizado para el estudio de las funciones SMAD4 en la tumorigénesis. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio que relaciona TGF /SMAD4 genes regulados a la información clínica sobre la supervivencia de los pacientes de cáncer de ovario y de identificar posibles firmas de genes para el pronóstico en el cáncer de ovario. En nuestros estudios futuros, vamos a realizar un análisis de chip-ss de sitios de unión TGF /SMAD4 utilizando un panel de líneas celulares de cáncer de ovario representan diferentes subtipos histológicos y las células de cáncer de ovario iniciar.
Materiales y Métodos
cultivo de células y TGF estimulación
células A2780 [15] fueron cultivadas en RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con suero bovino fetal al 10% en una CO 37 ° 5%
2 incubadora. Antes de la estimulación TGF, las células se dividieron en ~ 70% de confluencia y se inspeccionan diariamente. Para la viruta, 80% de células confluentes se estimularon de manera óptima con 10 ng /ml recombinante TGFß1 (Sigma, St. Louis, MO) durante 1 hora antes de la reticulación de formaldehído mientras que el análisis de expresión se realizó después de 3 horas de estimulación con 10 ng /ml TGFß1.
inmunoprecipitación de la cromatina y secuenciación masiva en paralelo
la cromatina immunoprecipitation (cHIP) se llevó a cabo como se describe anteriormente [46], [47] con algunos cambios dignos de nota. Brevemente, las células se enjuagaron con PBS temperatura ambiente antes de ser reticulado en una solución de formaldehído al 1%. Las células se recogieron a continuación y se homogeneizaron en presencia de inhibidores de la proteasa antes de que se sometió a ultrasonidos ADN. perlas Dynal magnéticos (Invitrogen) combinados con una mezcla de anticuerpos (20% SMAD4#9515 (Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA) y el 80% SMAD4 DCS-46 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) se usa para tirar hacia abajo SMAD4 durante la noche. el ADN purificado se utilizó para detectar el enriquecimiento veces por Syber verde QRT-PCR véase la Tabla S3 para obtener una lista de los cebadores.
bibliotecas de secuenciación se generaron para la secuenciación paralela masiva utilizando métodos estándar. en pocas palabras, 500 ng de ADN pulldown se sometió a terminar la reparación, adenilación terminal, y la ligadura de adaptador antes de fragmentos que van desde ~175-250 fueron aisladas de un 2% e-gel (Invitrogen). Después de un ciclo de PCR estandarizado 12, se evaluó la calidad del ADN en un ADN 1000 Bioanalyzer . chip (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) antes de ser presentados para la secuenciación en una Illumina GAII Todos los datos chip-ss es depositado en la Expresión génica Omnibus (GEO) de bases de datos en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (http: //www.ncbi .nlm.nih.gov /geo) y son el número de acceso GSE27526.
la expresión de genes de perfiles
ARN total fue extraído de las células utilizando Trizol (Invitrogen) para el análisis microrarray en una Affymetrix HGU133 Plus 2