Extracto
ARN no codificante (ncRNAs) son el producto dominante de la transcripción eucariótica. Estos productos van desde cortos microRNAs (miRNAs) a los ARN no codificantes intergénicas largos (lincRNAs). ARNs circulares formados por secuencias de exonic representan una forma poco estudiada de NcRNA que fue descubierta hace más de 20 años. El uso de un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa basado en TaqMan, se analizó la relación entre la
cir-PICOR
expresión y el cáncer colorrectal (CCR) en un total de 45 CRC y muestras de tejidos no tumorales adyacentes apareados. Hemos encontrado que
cir-PICOR
expresión era típicamente las reguladas en el CCR en comparación con el tejido peritumoral. Este resultado, además de varios experimentos de seguimiento, mostraron que
cir-PICOR
podría aumentar el nivel de
PICOR
, que está implicado en la inhibición de la vía /β-catenina vía . Por lo tanto, nuestros resultados mostraron que
cir-PICOR
juega un papel en la regulación de la CRC por vía Wnt /β-catenina
Visto:. Huang G, H Zhu, Shi Y, Wu W, Cai H, Chen X (2015)
cir-PICOR
juega un papel inhibitorio en el cáncer colorrectal mediante el control de la Wnt /β-catenina. PLoS ONE 10 (6): e0131225. doi: 10.1371 /journal.pone.0131225
Editor: Yifeng Zhou, Facultad de Medicina de la Universidad Soochow, CHINA
Recibido: 24 Abril, 2015; Aceptado: 30-may de 2015; Publicado: 25 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de Wenzhou Ciencia y Tecnología Fundación Oficina de Ciencias Naturales (Y20140700 Dr. XC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es una neoplasia maligna que se encuentra en el colon o en el recto [1, 2]. CRC sigue siendo una causa importante de mortalidad por cáncer en el mundo desarrollado, en gran parte debido a su propensión a metástasis [3]. CRC plantea un importante problema de salud pública, ya que es el tercer cáncer más comúnmente diagnosticado en hombres y la segunda más común en las mujeres. Ha habido muchos estudios comparativos que demuestran los cambios epigenéticos estrechamente asociados con la aparición y el desarrollo de CCR. A pesar de los logros de la investigación CRC son notables, los factores etiológicos y mecanismos que subyacen a la patogénesis CRC desarrollo parecen ser compleja y heterogénea.
Recientemente, el ARN circular, un tipo de ARN no codificante que por lo general no actúa mediante la codificación de una proteína, se encontró que era estrechamente relacionado con el desarrollo de tumores [4]. ARN circular se compone generalmente de más de un exón y por lo general se enriquece con microRNA funcional (miRNA) sitios de unión; por ejemplo,
CDR1
contiene varios sitios de unión conservadas de los genes miARN-7 (miR-7). Recientemente, un estudio informó de que
cir-PICOR
es un ARN circular que se extiende por varios exones de ubiquitina (Ub) proteína ligasa (E3) (tiña) [5-7]. El artículo indicó que
cir-PICOR
alberga muchos sitios de unión miARN que pueden unirse a la 3'-UTR de
PICOR
, incluidos los de miR-7, miR-17, miR-214 , miR-128 y miR-216b [5, 8]. El estudio de miRNAs es más madura que la de ARN circular; miRNAs son 21-nucleótidos de longitud ARN no codificantes que tienen un papel importante en numerosos procesos biológicos en las plantas y los animales [9]. miRNAs maduro jugar un papel regulador importante en el crecimiento celular, la proliferación, diferenciación y muerte celular.
cir-PICOR
juega un papel importante en el desarrollo y progresión de la CECA [7].
objetivos ITCH
's, incluyendo p63, p73, y Notch1, se asocian generalmente con la formación de tumores y quimiosensibilidad, lo que demuestra la conexión de la tiña de la biología del cáncer [10]. investigación discutido anteriores actividades contra el cáncer de ARN circular en líneas celulares de melanoma malignos [11]. Sin embargo, no existen estudios informaron sobre el papel funcional de ARN circular en el CCR.
En este estudio, la hipótesis de que
cir-PICOR
desempeña un papel similar en el CCR. Para probar esta hipótesis, hemos desarrollado un método para delinear las diferencias en la transcripción
cir-PICOR
entre CRC y se combina tejidos adyacentes no neoplásicas.
Materiales y Métodos
Estudio sujetos
Todos los sujetos de este estudio eran homogéneos chinos Han. Cuarenta y cinco muestras de tejido y paracancerous CRC correspondientes se obtuvieron de los pacientes en el Primer Hospital Afiliado de Wenzhou Medical College (Wenzhou). No hubo restricciones en la edad, etapa de CRC, el sexo o la histología. Durante el reclutamiento, cada sujeto dieron su consentimiento informado por escrito mediante la programación de una entrevista en la que recibieron un cuestionario estructurado. Este estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional de Wenzhou Medical College. Las características clínicas de todos los pacientes se enumeran en la Tabla 1.
Cultivo de células
El CRC líneas celulares HCT116 y SW480 humana se compraron desde el Banco de Células de Type Culture Collection de la Academia de Ciencias de china, Shanghai Instituto de Biología celular y se pasaron por menos de 6 meses.
Construcción del plásmido de ARN circular
Hemos construido el plásmido de ARN circular que se utiliza en este estudio. El método de construcción se publicó anteriormente [8]. La construcción resultante (
pcDNA3
.
1-cir-PICOR
) se verificó por secuenciación directa.
La extracción de RNA y la reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real
ARN total fue aislado de las células y tejidos utilizando el reactivo TRIzol según las instrucciones del fabricante. La expresión génica relativa de
cir-PICOR
se determinó mediante qPCR, que se basa en el método TaqMan.
GAPDH
se utilizó como un control estándar interno, y todas las reacciones se realizaron por triplicado [12, 13]. Los cebadores utilizados para la amplificación por PCR cuantitativa es la GCAGAGGCCAACACTGGAA hacia adelante, el TCCTTGAAGCTGACTACGCTGAG inversa, la CCGTCCGGAACTATGAACAACAATGGCA sonda.
R RNasa la digestión
La reacción de digestión RNasa R se realizó siguiendo los procedimientos publicados anteriormente. Las reacciones de digestión y precipitación se repitió dos veces con una proporción de 3 U de enzima /mg de RNA [14].
transfecciones transitorias y ensayos de luciferasa
células HCT116 y SW480 fueron transfectadas con el reportero plásmidos descritos más arriba usando Lipofectamine 2000. las células fueron co-transfectadas con los miRNAs de acuerdo con las instrucciones del fabricante [15]. Cada grupo incluía 6 repeticiones, y por triplicado se realizaron experimentos independientes.
actinomicina D ensayo
células HCT116 y SW480 fueron transfectadas transitoriamente utilizando Lipofectamine 2000 y fueron co-transfectadas con ARNm como se indica para 24 h . Las células fueron expuestas a la actinomicina D. Se recogieron las células, y se analizó la estabilidad de la
cir-PICOR
ARNm utilizando cuantitativa transcripción reversa PCR (QRT-PCR). El ensayo se realizó de acuerdo con el artículo anterior.
Western blot
Western blot para evaluar Wnt3a, β-catenina y expresión β-acción se llevó a cabo como se describe anteriormente [16].
viabilidad de las células de ensayo
la viabilidad celular se midió utilizando el sistema de conteo de la célula Kit-8 (CCK-8) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Hubo 6 repeticiones para cada grupo, y los experimentos se repitieron al menos 3 veces.
análisis estadísticos
La correlación entre la expresión de
cir-PICOR
y el
PICOR
gen en los tejidos de CRC se determinó mediante análisis unidireccional de modelos de regresión lineal y la varianza. Las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante la prueba t de un asociado, de Student de 2 colas. Un
P-valor de
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Identificación de la ARN circular
Dos juegos de
PICOR
cebadores fueron diseñados para este estudio: un conjunto divergente para amplificar sólo la forma circular y un conjunto convergente para amplificar las formas lineales. Se confirmó que la forma circular se amplificó utilizando los cebadores divergentes. ADNc y ADN genómico se utilizaron como los controles. Como era de esperar, no se observó amplificación utilizando los cebadores divergentes sobre el ADN genómico. GAPDH se usó como el control lineal (Fig 1A).
(A) cebadores convergentes puede amplificar ARN circulares y ARN lineales. cebadores divergentes amplifican ARNs circulares sólo en cDNA en comparación con el ADN genómico (ADNg). GAPDH es el control lineal. (B) El
cir-PICOR
se expresó en un nivel superior en aproximadamente el 75,6% de los tejidos adyacentes CRC en comparación con los tejidos que coincida con CRC. El nivel de expresión de
cir-PICOR
se analizó mediante QRT-PCR basada en Taq-Man y normalizado a
GAPDH
. Los datos se representan como media ± SEM de tres experimentos independientes. (C) cebadores aleatorios y los cebadores oligodT se utilizaron respectivamente en los experimentos de transcripción inversa. La predicho
cir-PICOR
está ausente en las muestras enriquecidas poli (A). (D) El predijo
cir-PICOR
es reaccionar contra al tratamiento RNasa R. prueba t de 2 colas de Student se utilizaron en la prueba de las diferencias entre los grupos * p & lt; 0,05 comparado con el control.
Expresión de
cir-PICOR Hoteles en CRC y los tejidos circundantes
Se utilizó el conjunto de cebadores divergentes y utilizó un TaqMan-basan QRT-PCR ensayo para validar la presencia del ARN circular en 45 tejidos de CRC y vinculado tejidos no cancerosos.
cir-PICOR
se expresó en un nivel superior en aproximadamente el 75,6% de los tejidos de CRC en comparación con la de las muestras no cancerosas emparejados (Figura 1B).
Caracterización de
cir -ITCH Hoteles en células CRC
Se construyó un vector para expresar
cir-PICOR
en las células tras el estudio previo y después realizó experimentos. Los plásmidos construidos se transfectaron transitoriamente en células HCT116 y SW480.
En los experimentos de transcripción inversa, se utilizaron cebadores aleatorios y cebadores oligo (dT). Los productos circulares se agotaron en las muestras enriquecidas en polyA en comparación con los productos lineales. Cuando se utiliza el oligo (dT) cebadores, la cantidad de expresión (normalizado para GAPDH) de lineal
PICOR
fue significativamente mayor que la de circular
PICOR
(Fig 1C) [11].
Se utilizó la enzima RNasa R, exoribonuclease una muy processive 3'-5 ', para poner a prueba nuestras predicciones de las características de ARN circulares. Esta exonucleasa degrada moléculas de ARN lineales en una "dirección 3'-5, pero no funciona en los ARN circulares [17, 18]. Como era de esperar, en contraste con los ARN de control lineales, que fueron degradadas, el ARN circular predicho era resistente al tratamiento con RNasa R (Fig 1D).
Interacción entre
cir-PICOR
y miRNA
Recientemente, ARN circular ha sido identificado como una clase abundante de transcripciones de regulación que funcionan como esponjas miARN [5, 8]. El software de Miranda fue utilizado para pronosticar el destino miARN. La secuencia de los microRNAs predijo sitios de unión se presenta en la Tabla 2. Se encontró que el miR-7, miR-20a y miR-214 se pueden unir a la región 3 'no traducida (UTR) de
PICOR Opiniones y
cir-PICOR
. Por lo tanto, hemos insertado el
PICOR
secuencia de unión en psiCHECK-2 y reporteros de luciferasa construidos para estos 3 miRNAs por transitoriamente co-transfección en células HCT116. La construcción se había reducido significativamente la actividad de la luciferasa de miR-7, miR-20a y miR-214 de una manera dependiente de la concentración en las células de control HCT116 (1 pmol miARN-7: 1,02 ± 0,028 frente a 1,236 ± 0,068,
P
= 0,05; 40 pmol miARN-7: 0,808 ± 0,052 frente a 1,236 ± 0,068,
P
= 0,02; 1 pmol miARN-20a: 2,09 ± 0,123 frente a 2,498 ± 0,068,
P
= 0,02; 40 pmol miARN-20a: 1.887 ± 2.498 ± 0.068 0.11versus,
P = 0,006
; 1 pmol de miRNA-214: 1.511 ± 0.059 frente a 1,88 ± 0,043,
P =
0,03; 40 pmol de miRNA-214: 1,38 ± 1,88 frente a 0,058 ± 0,043,
P = 0,006)
. Se encontraron resultados similares cuando repetimos los mismos experimentos en el control de las células SW480.
Se realizó el mismo experimento en
cir-PICOR
células hiper-expresión. Los resultados mostraron que no hubo diferencias significativas en la actividad luciferasa cuando el psiCHECK-2-
PICOR
sitio de unión a con miR-7 y miR-20a se transfectó en células HCT116 y SW480, pero que no había una diferencia significativa de miR-214 (1 pmol miARN-7: 1,147 ± 0,041 frente a 1,236 ± 0,042,
P = 0,069
; 40 pmol miARN-7: 1,138 ± 0,015 frente a 1,236 ± 0,042,
P
= 0,12; 1 pmol miARN-20a: 2,424 ± 0,017 frente a 2,526 ± 0,058,
P
= 0,11; 40 pmol miARN-20a: 2.345 ± 0,04 frente a 2,526 ± 0,058,
P = 0,069
; 1 pmol de miRNA-214: 1.539 ± 0.038 frente a 1.877 ± 0.039,
P = 0,001
; 40 pmol de miRNA-214: 1.407 ± 0.051 frente a 1.877 ± 0.039,
P
= 0,004) ( la figura 2A).
(a) actividad de luciferasa relativa de la psiCHECK-2-picazón construye co-transfectadas con miR-20a, miR-7, miR-214 y el inhibidor en las células HCT116 y SW480. En
cir-PICOR
células hiper-expresión, no hubo diferencias significativas en la actividad luciferasa cuando psiCHECK-2-
PICOR
sitio de unión a la miRNAs se cotransfectaron en células HCT116 y SW480. Seis repeticiones para cada grupo y el experimento repitieron al menos tres veces. Los datos son la media ± SEM. Las células HCT116 y SW480 (B) después de transfectaron con
cir-PICOR
y Control de las células fueron transfectadas, respectivamente, con miR-20a, miR-7 y el inhibidor durante 24 h y luego se expusieron más de actinomicina D durante 1, 2 y 3 h. Se recogieron las células y la estabilidad de los
cir-PICOR
ARNm se analizó mediante qRT-PCR en relación con el momento 0 de bloqueo de nueva síntesis de ARN con actinomicina D; los datos son la media ± SEM, normalizado a
GAPDH
.
células HCT116 y SW480 transfectadas con plásmido construido se trataron con actinomicina D en presencia de 1 o 40 pmol de miR-7 y miR-20a, y el ARN total se recogieron en los puntos de tiempo indicados. Los resultados muestran que en las células de control, el
cir-PICOR
niveles se mantuvo en 20-30%; Sin embargo, hubo pocos cambios en el
cir-PICOR
niveles en las células HCT116 tras la incubación con actinomicina D. Se repitieron estos experimentos en células SW480 con los mismos resultados (Figura 2B).
Asociación de
cir-PICOR
y
Hoteles en PICOR CRC
Recientemente,
cir-PICOR
se informó de regular la expresión génica a través de su papel como un miARN esponja, protegiendo así a los genes diana miRNAs. Por lo tanto, hemos probado la correlación entre los
cir-PICOR
y
PICOR Hoteles en otros 15 pares adicionales de CRC adyuvantes tejidos no cancerosos. Los resultados mostraron que los pacientes con mayor
cir-ITCH
niveles de expresión en los tejidos CRC tenían una sustancial sobre regulación de lineal
PICOR gratis (R
2 = 0,32,
P Hotel & lt; 0,01; Fig. 3A)
(A) las correlaciones lineales entre los
cir-ITCH
niveles de expresión y lineal
PICOR
fueron probados. El valor relativo de expresión se normalizó por
GAPDH
nivel de expresión. Se llevó a cabo (B) de ensayo indicador de luciferasa Un TCF. La actividad luciferasa se normalizó a la actividad de la luciferasa de Renilla. (C) Los niveles de proteína de Wnt3a y β-catenina se evaluó en células de CRC (células HCT116 y células SW480) por transferencia de Western. (D) El nivel de ARNm de
c-myc
y
cyclinD1
fue detectado por RT-PCR cuantitativa después transfectadas con
cir-ITCH
o control de las células en células CRC. (La parte superior es
c-myc
y cuanto menor es
cyclinD1
) Los datos son la media ± SEM y representativos de tres experimentos independientes. (E) células HCT116 y SW480 se sembraron en placas de 96 pocillos después sido transfectadas, y la proliferación celular se llevó a cabo diariamente durante 3 días usando el ensayo de CCK-8. Seis réplicas para cada grupo y el experimento repetido tres veces. Los datos son la media ± SEM. *
P
. & Lt; 0,05 en comparación con los controles
cir-PICOR
está implicado en la regulación de la vía de señalización de Wnt /β-catenina in vivo
proteína PICOR ubiquitinates la forma fosforilada de Dvl2 y promueve su degradación, lo cual inhibe la canónica de señalización Wnt [19]. A fin de verificar si
cir-PICOR
regula la vía de señalización /β-catenina en las células de CRC, se utilizó un ensayo indicador de luciferasa de β-catenina /TCF-sensible. Los resultados mostraron que la sobreexpresión de la tiña inhibió la actividad de flash TOP de una manera dependiente de la dosis (Fig 3B). La β-catenina y niveles Wnt3a se analysised mediante western blot en células con
PICOR
hiperexpresión, y como se muestra en la figura 3C, hubo una disminución evidente en los niveles de β-catenina, mientras que no hubo cambios en la expresión de Wnt3a. A continuación, prueba la expresión de
c-myc
y
cyclinD1
, dos genes diana de la vía de señalización de Wnt /β-catenina, en las células transfectadas con
cir-PICOR
. Su expresión también fue suprimida (Figura 3D).
cir-PICOR modula el crecimiento celular
Se realizó CCK-8 ensayos para probar los efectos de
cir- PICOR
sobre la proliferación celular en las células de CRC. Se ha observado una disminución constante en la proliferación de células de HCT116 (28% -39% de disminución) y las células SW480 (15% -33% de reducción) cuando
cir-PICOR
se sobreexpresa en niveles fisiológicos a través de la CCK-8 los ensayos en comparación con la del control (figura 3E).
Discusión
en este estudio, hemos identificado
cir-PICOR
en el CCR y se encontró que estaba abajo de manera espectacular regulada en los tejidos CRC utilizando un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa basado en TaqMan, indicando que la función potencial de los
cir-PICOR
en el CCR. Una serie de experimentos ilustra la correlación entre los
cir-PICOR Opiniones y miRNAs, lo que demuestra que
cir-PICOR
juega un papel importante como una esponja miARN en el proceso de desarrollo de CCR.
Miles de lincRNAs se han identificado en seres humanos y ratones, y muchos están estrechamente relacionados con el desarrollo de diversos tipos de cáncer, como el carcinoma esofágico de células escamosas (CECA) y carcinoma endometrial [20, 21]. ARN circular es un tipo de lincRNA que juega un papel en el desarrollo tumoral. Por lo que sabemos,
PICOR
es una de las ligasas de proteína ubiquitina E3 que se dirige específicamente a p73 [22], Dvl2 [19], y Notch1 [23], todos los cuales se asocian generalmente con la formación de tumores y quimiosensibilidad.
a pesar de que las funciones de miRNAs están lejos de ser completamente entendido, se prevé que aproximadamente el 30% de los genes que codifican proteínas son controlados por miRNAs [24], y algunos estudios han sugerido que los genes miARN puede unirse al 3 "-UTR de
PICOR
para disminuir su expresión [25]. Memczak et al. (2013) y Hansen et al. (2011) propusieron que la proteína 1 (CDR1) locus relacionado con la degeneración del cerebelo-alberga 70 partidos conservadas a la semilla de miR-7. Esta característica sorprendente sugerido que el ARN circular tiene una posible función como una esponja miARN [5, 8, 26]. Investigaciones anteriores han demostrado que
cir-PICOR
actúa como una esponja para miR-7, miR-17 y miR-214, mientras que en el presente estudio, se encontró que en las líneas celulares de CRC, el miR-7 y miR-20a regular por disminución
PICOR
expresión mediante la unión a su 3'-UTR. Además, estos miRNAs siempre están albergadas por
cir-PICOR
. En nuestro estudio,
cir-PICOR
no actuó como una esponja para miR-214. A nuestro entender, la expresión ectópica de miR-214 suprime la proliferación, la migración y la invasión in vitro, mientras que el miR-214 desmontables promueve la proliferación, la migración y la invasión en líneas celulares de CRC [27].
miRNAs han sido durante mucho tiempo asociado con el cáncer. Elevada miR-7 expresión ha sido descrito en una variedad de tipos de tumores, incluyendo CRC, y se ha implicado en la oncogénesis, la clasificación y la progresión del cáncer [28]. miR-20a contribuye a un aumento de la proliferación y la invasividad de las células de CRC [29]. Sobre la base de esta información, nuestros datos verifican el trabajo de nuestros predecesores. De los datos anteriores, se demostró que
cir-PICOR
participa en el desarrollo de CCR mediante la regulación de la actividad de los genes miARN.
regulación aberrante de la vía de señalización de Wnt se ha convertido en un tema frecuente en la biología del cáncer, y es crucial para el inicio y la progresión de CRC humano. Aproximadamente el 90% de los cánceres de colon esporádicos muestran aberrante de señalización Wnt [30].
cir-PICOR
actúa como una esponja miARN y aumenta el nivel de
PICOR
, que está implicada en la ruta /β-catenina vía. Según la investigación anterior, Picazón puede promover la ubiquitinación y la degradación de fosforilados Dvl2 y, por lo tanto, inhibir la señalización de Wnt canónica [19]. Un ensayo de indicador de luciferasa de β-catenina /TCF-sensible se utilizó para examinar si un solo gen regula la vía de señalización /β-catenina Wnt. Nuestro estudio y otros resultados anteriores indicaron que la sobreexpresión de
cir-PICOR
suprimió de forma significativa la actividad transcripcional relativa TCF.
Los oncogenes
c-myc
y
cyclinD1
son proteínas efectoras de la señal karyomitosis, que pueden desencadenar y regular la transcripción de genes relacionados con la proliferación. Con frecuencia se sobreexpresa en varios tumores humanos, incluyendo CRC [31]. Nuestros resultados mostraron que en las células transfectadas con
cir-PICOR
, la expresión de
c-myc
y
cyclinD1
se disminuyó notablemente. Por lo tanto, sugerimos que
cir-PICOR
tiene un efecto inhibitorio sobre la vía Wnt canónica.
cir-PICOR
juega un papel antitumoral mediante el control de la actividad de los genes miARN, y tiene un papel inhibitorio en la vía Wnt canónica, la inhibición de
c-myc
y
cyclinD1
expresión.
En resumen, nuestro estudio indica que la esponja miARN
cir-PICOR
representa una nueva generación de tecnología para la inhibición de los genes miARN.
cir-PICOR
está implicada en la vía /β-catenina vía, y mediante la inhibición de esta vía, que desempeña un papel en la CRC.
Reconocimientos
Este trabajo fue apoyado por donación de Wenzhou Ciencia y Tecnología Fundación Oficina de Ciencias Naturales (Y20140700).