Extracto
Los microARN (miRNA) son pequeñas ($ ~ $ 22 nucleótidos) ARNs no codificantes que regulan una gran variedad de los procesos biológicos y son frecuentemente mal regulada en el cáncer. microARN asociados con el cáncer se han detectado en el suero y plasma y prometedor, ya que los biomarcadores del cáncer mínimamente invasivos, potencialmente, para evaluar características de la enfermedad en pacientes con enfermedad metastásica que es difícil de biopsia. Aquí hemos utilizado miARN perfiles para identificar miRNAs asociados con el cáncer que son expresados diferencialmente en sueros de pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración metastásico (mCRPC) en comparación con controles sanos. 365 miRNAs perfiladas, se identificaron cinco miRNAs suero (miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-210 y miR-375) que fueron elevados en los casos en comparación con los controles a través de dos cohortes independientes. Uno de ellos, miR-210, es un objetivo transcripcional conocido de la vía de señalización de HIF-1α sensible a la hipoxia. La exposición de las células de cáncer de próstata en cultivo a la hipoxia condujo a la inducción de miR-210 y su liberación en el medio extracelular. Por otra parte, se encontró que el suero miR-210 niveles variaron ampliamente entre los pacientes sometidos a terapia mCRPC, y se correlacionaron con la respuesta al tratamiento como se evalúa por el cambio en PSA. Nuestros resultados sugieren que (i) la hipoxia asociada al cáncer es una característica frecuente, anteriormente poco apreciada de mCRPC, y (ii) de suero de miR-210, podrán desarrollarse como un biomarcador predictivo en pacientes con esta enfermedad distinta biología.
Visto: Cheng HH, Mitchell PS, Kroh EM, Dowell AE, Chéry L, Siddiqui J, et al. (2013) circulantes Perfiles de microARN identifica un subconjunto de cáncer de próstata metastásico pacientes con evidencia de hipoxia asociada a cáncer. PLoS ONE 8 (7): e69239. doi: 10.1371 /journal.pone.0069239
Editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 23, 2013; Aceptado: 6 Junio 2013; Publicado: July 30, 2013
Derechos de Autor © 2013 Cheng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación proporcionado por la Fundación Canaria (MT), Premio Damon Runyon-Rachleff Innovación (MT), Premio del Departamento de Defensa de próstata cáncer de Nueva Investigador (MT), Institutos nacionales de Salud (NIH) CA093900 (a KJP), NIH CA143055 (a KJP) , NIH PO1 CA085859 (al RLV), NIH CA69568 SPORE P50 (a KJP y AMC), NIH SPORE P50 CA97186 (a PSN, MT, y RLV), NIH TR01 5R01DK085714 (MT), NIH T32CA009515-28 (a HHC) , Premio del cáncer de próstata Fundación Creatividad (MT), y Richard M. Lucas Fundación (a RLV). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Muneesh Tewari es un inventor llamado en la solicitud de patente pendiente titulada, "El uso de extracelular ARN para Medir la enfermedad, "# 12/993828. H.H.C., P.S.M., E.M.K., A.E.D., L. C., J. S., P.S.N., B.S.K., R.L.V., A.M.C., K.J.P., y C.M. declarar intereses en competencia. Los autores confirman que esto no altera su adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
La historia natural de los pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración metastático (mCRPC) varía ampliamente, lo que sugiere una biología enfermedad heterogénea en esta población de pacientes. Sin embargo, poco se sabe acerca de la heterogeneidad biológica en mCRPC y enfoques para la estratificación clínica de los pacientes se limitan, en gran parte porque el tejido metastásico no está disponible habitualmente para el estudio. Mínimamente invasiva (por ejemplo, a base de sangre) enfoques que pueden ayudar a estratificar los pacientes sobre la base de la biología del tumor distintos pueden ayudar a informar a la elección del tratamiento, lo cual es especialmente relevante con la reciente introducción de varios nuevos tratamientos eficaces para mCRPC.
microRNAs circulantes (miRNAs) son una clase emergente de biomarcadores basados en la sangre con el potencial de proporcionar información acerca de la biología del tumor distinta en cada paciente [1]. miRNAs son pequeños ($ ~ $ 22 nucleótidos), no codificante moléculas de ARN que post-transcriptionally regulan la expresión génica por la represión de traducción o degradación de transcritos específicos [2]. miRNAs específicos se ha encontrado que regulan una variedad de procesos críticos en la fisiología del tumor, incluyendo la angiogénesis [3], epitelial a mesenquimal transición [4], metástasis [5] y la respuesta del tumor a la hipoxia [6]. miRNAs se han demostrado para ser eficaz basado en los tejidos biomarcadores de cáncer-en el diagnóstico de cáncer de origen desconocido del tejido y en la predicción de los resultados clínicos [7] - [9]. Nosotros y otros han demostrado que la circulación, miRNAs, derivadas de tumores de células libres son muy estables y detectable en el suero de pacientes con cáncer [1]. En trabajos anteriores, hemos utilizado un enfoque miARN candidato para identificar elevación significativa de miR-141 en suero de pacientes con cáncer de próstata metastásico resistente a la castración (mCRPC) [1].
Con el fin de identificar de forma más exhaustiva el cáncer de próstata -asociado miRNAs circulantes, en el presente estudio hemos perfilado miRNAs de suero de pacientes con mCRPC. Se identificaron cinco miRNAs suero que fueron significativamente elevados en los casos en comparación con los controles sanos, incluyendo la hipoxia asociada miR-210. Con el fin de determinar si las células de cáncer de próstata pueden liberar miR-210 en respuesta a la hipoxia, expusimos líneas celulares de cáncer de próstata a condiciones de hipoxia y encontramos que miR-210 se indujo y se libera en el medio extracelular. En el análisis de muestras clínicas y los resultados, se encontró evidencia de que un subgrupo de pacientes mCRPC han aumentado los niveles de miR-210 y que esto se correlaciona con la respuesta al tratamiento, lo que sugiere que el aumento de la hipoxia es una característica de mCRPC que puede definir un subconjunto de pacientes con un distinto biología de la enfermedad.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
LNCaP (ATCC® CRL-1740 ™) y VCAP [10] líneas celulares de cáncer de próstata humano se cultivaron en RPMI 1640 y DMEM, respectivamente, cada uno suplementado con 10% de SFB (o bajo condiciones libres de suero, como se ha indicado), a 37 ° C en un 5% CO
2 incubadora. condiciones de hipoxia (1% O
2) se establecieron en un Thermo Scientific 3595 Incubadora (ThermoFisher), con células mantenidas en condiciones de normoxia (20% O
2) en paralelo.
El aislamiento de ARN Las células cultivadas y medio condicionado
El medio condicionado se eliminó a partir de células cultivadas durante 24, 48 ó 72 horas bajo condiciones de normoxia o hipoxia. Las células se lavaron con 5 ml de PBS y se lisaron en hielo directamente en la placa de cultivo con 600 l de tampón de lisis /encuadernación de la
mir
kit de aislamiento de Vana miARN (Ambion). Los lisados se recogieron manualmente con un raspador de células estéril y se transfirieron a un tubo de microcentrífuga de RNasa /DNasa libre de 2 ml. Se extrajo ARN de lisados de células siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante para el aislamiento de ARN total. Los restos celulares se eliminó de una parte alícuota de 500 l de medio acondicionado (10 ml de volumen total) por filtración a través de una unidad de filtración 0,2 micras Nanosep (Millipore) a 14.000 ×
g
, 5 min, a temperatura ambiente. 400 l muestra filtrada se combinó con 400 l de 2X solución desnaturalizante (Ambion) y se agitó.
C. elegans
de pinchos-en oligonucleótidos fueron introducidos (como una mezcla de 25 fmol de cada oligonucleótido en 5 l de volumen total por muestra de líquido) después de desnaturalización y se utiliza para la normalización de la variabilidad en el aislamiento de ARN a través de muestras como se describió anteriormente [1]. Se extrajo ARN de lisados medios acondicionados utilizando el
mir
kit Vana PARIS (Ambion) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante para el aislamiento de ARN total.
Ética Declaración
Todas las muestras clínicas eran obtenido a partir de sujetos que dieron su consentimiento informado por escrito. Los estudios se realizan de acuerdo con la declaración de Helsinki directrices y con la aprobación ética de las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad de Washington, Fred Hutchinson Cancer Research Center y la Universidad de Michigan.
Producción de sangre y aislamiento de suero de clínica las muestras
Todas las muestras clínicas obtenidas de la Universidad de Washington y la Universidad de Michigan se recogieron y procesaron como se describe anteriormente [1], [11].
Aislamiento de ARN a partir de muestras clínicas de suero
ARN total fue aislado de 400 l de suero recogido de la Universidad de Washington usando el kit mirVana PARIS (Ambion) como se describe anteriormente [1]. Volúmenes iguales de cada tipo de muestra se combinaron para crear mCRPC y mezclas de suero de donantes sanos (n = 25 para cada grupo) para TLDA de perfiles. ARN total fue aislado a partir de muestras de suero recogidas de la Universidad de Michigan usando el kit de aislamiento de ARN miRNeasy (Qiagen) como sigue: 400 l de suero se dividió en cuatro alícuotas de 100, l. Cada parte alícuota se desnaturalizó usando volumen 10 veces (1 ml) Qiazol, que se agitó en vórtex y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min.
C. elegans
de pinchos-en oligonucleótidos fueron introducidos (como una mezcla de 25 fmol de cada oligonucleótido en 5 l de volumen total por muestra de líquido) después de la desnaturalización, que fueron utilizados para la normalización de la variabilidad en el aislamiento de ARN a través de muestras como se describe anteriormente [1] . El ARN se extrajo utilizando cloroformo 0,2X volumen (220 l), y el ARN total se aisló siguiendo el protocolo del fabricante. Para una muestra dada, ARN aislado de cada alícuota de 100 l se reunió y se concentró hasta un volumen de 100 l sobre Microcon YM-3 unidades de filtro (Millipore) a 14.000 ×
g
, 1,5 horas, 4 ° C, que eran cargado invertida en 1,5 ml tubos de microcentrífuga previamente pesados y se eluyó a 1000 ×
g
, 3 min, 4 ° C. Tubos más eluato se pesó en una balanza analítica y se llevaron a 100 l con tampón de elución. ARN se almacenó a -80 ° C.
Recolección y Procesamiento de secciones de tejido clínicos
láser de captura de microdisección (LCM) de las secciones de tejido congelado.
Secciones de próstata flash congelado y los ganglios linfáticos obtenidos a partir de la prostatectomía radical y la autopsia rápida, respectivamente, fueron evaluados por un patólogo para definir las regiones de las células epiteliales tumorales. Para la captura de microdisección por láser se hicieron 5 micras secciones de tejido congelado en un criostato Leica ™ CM3050S a -20 ° C (Leica, Wetzlar, Alemania), colocada sobre Enmarcar diapositivas PEN membrana (MDS Inc., Ontario, Canadá) y luego teñidas fijos de acuerdo con el protocolo HistoGene ™ LCM Frozen Sección Staining Kit (MDS Inc.). Para cada muestra de aproximadamente 2000 células fueron capturados láser a 200 aumentos (Veritas, Arcturus MDS Inc., Ontario, Canadá). La muestra capturada se colocó en 300 l de tampón de lisis de la RNAqueous® Kit Aislamiento de ARN (Ambion, Austin, Texas), se incubaron durante 30 minutos a 42 ° C y se almacenó a -80 ° C hasta que se realizó el aislamiento de ARN. a continuación, los genes miARN se aisló utilizando el kit de aislamiento de ARN RNAqueous® (Ambion).
aislamiento de ARN de muestras de tejidos de LCM.
ARN total fue aislado de las muestras de tejido LCM utilizando el kit de aislamiento de ARN RNAqueous-Micro (Ambion) como sigue: lisados congelados se descongelaron en hielo, se agita vorticialmente y se centrifugaron a 16.100 x g, 30 seg, la temperatura ambiente.
C. elegans
claveteado-en oligonucleótidos fueron introducidos (como una mezcla de 25 fmol de cada oligonucleótido en 5 l de volumen total por muestra de líquido) y se utilizó para la normalización de la variabilidad en el aislamiento de ARN a través de muestras como [1] se describe anteriormente, seguido de la adición de 3 l LCM aditivo. ARN se precipitó de la mezcla de lisado con 1,25 volúmenes de 100% de grado molecular EtOH, y se une posteriormente al conjunto de cartucho de filtro Micro (prehumedecido con 30 l solución de lisis para 5 min) por centrifugación a 10.000 x g, 1 min. El filtro se lavó (180 l Solución de lavado 1, 10000 ×
g
, 1 min; 2 x 180 l Solución de lavado 2/3, 16.100 ×
g
, 30 seg; sólo aire, 16.100 ×
g
, 30 seg). ARN se eluyó de la columna dos veces con 10 l 95 ° C tampón de elución en tubos previamente pesados. Los eluidos se pesaron en una balanza analítica y se llevaron a 20 l con tampón de elución. ARN se almacenó a -80 ° C.
Perfiles de microARN utilizando TaqMan Low-Density Arrays miARN QRT-PCR y selección de candidatos de biomarcadores
ARN a partir de suero agrupado de pacientes mCRPC o controles sanos (compuesto por el mismo volumen de ARN a partir de cada una de las 25 muestras por grupo) fue inverso-transcrito en las reacciones duplicadas de 2 l de ARN agrupado utilizando el kit TaqMan miARN transcripción inversa y la TaqMan miARN Multiplex RT ensayos (piscina humano Set). Un enfoque muestra agrupada fue elegido para el descubrimiento rentable de biomarcadores miARN. miARN expresión fue perfilado de cada réplica reacción de RT utilizando TaqMan Array de baja densidad (TLDA, v1.0) como se describe anteriormente [1]. Multiplex transcripción inversa TLDA qRT-PCR se llevó a cabo en un termociclador de Applied Biosystems 7900HT usando condiciones de ciclo recomendadas por el fabricante. Los datos se analizaron con la versión del software SDS cuantificación relativa 2.2.2 (Applied Biosystems), con un umbral mínimo asignado automáticamente, lo que estaba por encima de la línea base de todos los ensayos que muestran la amplificación medible por encima del fondo. Los valores que estaban por debajo del umbral mínimo fueron asignados arbitrariamente un valor de ciclo umbral (CT) de 40.
P
-valores fueron asignados por la prueba t de Student evaluar replicar datos de perfiles de cada grupo para determinar diferencias significativas en la expresión de los genes miARN entre la piscina y mCRPC muestras de ARN de la piscina de control sanos. Pliegue de cambio valores (FC) se obtuvieron mediante el cálculo de 2
∧ (AveCT
mCRPC piscina-AveCT
Piscina control sano). MicroARN biomarcadores candidatos fueron seleccionados por criterio de FC & gt; 5 y
P
. & lt; 0,05
Medición de Niveles de mRNA de los genes miARN y por individual TaqMan cuantitativa con transcripción inversa PCR (QRT-PCR)
miARN-derivado de las muestras de suero fue inverso-transcrito utilizando el kit TaqMan miARN transcripción reversa (Applied Biosystems) y se cuantificó mediante TaqMan miARN QRT-PCR utilizando conjuntos de cebadores /sondas miARN-específicos (Applied Biosystems) como se ha descrito anteriormente [ ,,,0],1]. Una descripción completa de los ensayos TaqMan utilizados en este estudio se proporciona en la Tabla S4.
miRNAs derivadas de muestras de suero obtenidas de la Universidad de Michigan se cuantificaron por TaqMan miARN QRT-PCR utilizando las curvas de calibración sintéticos miARN para la cuantificación absoluta idéntica a la descrita en la Universidad de Washington conjunto de la muestra [1] con la excepción de que la etapa de pre-amplificación fue excluido de todo cuantificación miRNA distinta de miR-210 (esto se basa en la evidencia empírica que pre-amplificación no aumenta la copia absoluta número de miRNA detectable para otros ensayos TaqMan miARN utilizados aquí, los datos no se muestran)
gene-expresión se cuantificó por TaqMan qRT-PCR como sigue:. ARN de entrada se sometió a transcripción inversa utilizando el TaqMan de expresión génica de transcripción reversa Kit (Applied Biosystems) en una reacción RT a pequeña escala [compuesta de 0,5 l de 10X tampón de transcripción inversa, 0,5 l de 10X Random Primers, 0,2 l con 100 mM dNTPs, dTTP 0,25 l MultiScribe de la transcriptasa inversa y 3,55 l ARN de entrada; componentes distintos del ARN de entrada se prepararon como una mezcla maestra mayor volumen], utilizando un ciclador térmico Tetrad2 Peltier (BioRad) a 50 ° C durante 2 min, seguido de 30 ciclos de 95 ° C durante 10 min, 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 60 segundos. Resultante de ADNc se combinó con 3,75 l de pre-amplificación de reactivos de ensayo [compuestos de 2,5 l TaqMan PreAmp Master Mix y 1,25 l TaqMan de expresión génica de ensayo (GUSB o KRT18) diluido 1:100 en TE; componentes distintos del cDNA de entrada se prepararon como una mezcla maestra de volumen más grande para generar una reacción de PCR volumen total 5,0 l], utilizando un ciclador térmico Tetrad2 Peltier (BioRad) a 95 ° C durante 10 min seguido de 14 ciclos de 95 ° C para 15 segundos y 60 ° C durante 4 minutos. productos de reacción pre-amplificación GUSB o KRT18 se combinaron con 2,75 l de PCR reactivos de ensayo [compuestos de 2,5 l TaqMan 2X PCR Universal Master Mix, Sin AmpErase UNG y 0,25 l de 20X de ensayo TaqMan de expresión génica) para generar un 5,0 l volumen total de PCR reacción para GUSB o KRT18, respectivamente. PCR en tiempo real se llevó a cabo en un termociclador Applied BioSystems 7900HT a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 min. Los datos fueron analizados con la versión de la ficha relativa cuantificación de software 2.2.2 (Applied Biosystems), con el ajuste automático del TC para la asignación de la línea de base y el umbral para la determinación de CT (Ver Tabla S3 de resultados de las mediciones de ARN mensajero).
Resultados y discusión
con el fin de descubrir de manera eficiente miRNAs suero que son diferencialmente abundantes entre los casos frente a los controles, hemos utilizado matrices miARN TaqMan baja densidad basados en la PCR en tiempo real (TLDA) para la detección de la abundancia diferencial de 365 miRNAs cáncer en el ARN del suero combinado de pacientes mCRPC (
n =
25) frente a los controles emparejados por edad (
n = 25
; todos los controles tenían PSA normal y hallazgos del examen rectal normal). Después de la normalización de los datos mediante espiga-en miRNAs de control y comparación de ARN de suero agrupado de los casos mCRPC a la de los controles (Fig. 1
Un
y
inserción
), se identificaron nueve miRNAs que demuestra una mayor que el cambio de 5 veces en abundancia (no ajustado
P Hotel & lt; 0,05, de la prueba t de Student). A continuación mide individualmente estos nueve miRNAs a partir del ARN sérico de casos y controles mCRPC individuales utilizando ensayos TaqMan QRT-PCR-miARN específicos. Se confirmaron los niveles séricos de cinco miRNAs ser significativamente elevados en los casos mCRPC en comparación con los controles (miR-141:
P Hotel & lt; 0,0001, miR-200a:
P = 0,007
, miR-200c :
P = 0,017
, miR-375:
P = 0,009
, y miR-210: análisis de
P = 0,022
, los signos de Wilcoxon). El pliegue-diferencia promedio entre los casos y controles varió de 4,6 (miR-375) a 27,9 (miR-141) (Fig. 1
B Opiniones,
superior y en la Tabla S1). Además, característicos (ROC) parcelas receptor de funcionamiento demuestran la capacidad de estos miRNAs para discriminar entre los dos grupos (miR-141 área bajo la curva (AUC) = 0,899; AUC miR-200a = 0,699; miR-375 AUC = 0,773 ; miR-200c AUC = 0,721 y miR-210 AUC = 0,678) (figura 1
B Opiniones,
menor
).. Es importante destacar que, verificamos que los miRNAs de control no fueron expresados diferencialmente entre las dos poblaciones (Fig. S1).
(
A)
Medición de miRNAs en una mezcla de sueros de pacientes con cáncer de próstata avanzado que circula en comparación con donantes sanos (que comprende un conjunto de Descubrimiento) por TLDA perfiles. Blue- y círculos rellenos representan-marrón miRNAs suero aumentado o disminuido (sin ajustar con valor de p & lt; 0,05), respectivamente, en los pacientes mCRPC en comparación con controles sanos.
Inserción:
Nueve miRNAs demostraron & gt; el cambio de 5 veces (no ajustado
P Hotel & lt; 0,05, de la prueba t de Student). FC, pliegue de cambio. (
B)
Confirmación de miRNAs en suero asociados-mCRPC en muestras individuales del conjunto Descubrimiento de la Universidad de Washington muestras.
Alta
: biomarcadores candidatos miARN se midieron en muestras individuales por TaqMan miARN QRT-PCR (
valor de p
asignado por los signos de Wilcoxon test), donde la abundancia de miARN se da en términos de copias de genes miARN /l de suero. Las barras rojas, media +/- SEM de los genes miARN copias /suero l para cada grupo.
Baja
: (ROC) curvas características de funcionamiento del receptor parcela de sensibilidad frente a (1 - especificidad) para evaluar la capacidad de cada biomarcador miARN para distinguir los casos de los controles.
(C)
Validación de miRNAs en suero asociados-mCRPC en un conjunto de validación independiente.
Alta
: La concentración sérica (copias /l) de miR-141, miR-375, miR-200c, miR-200a y miR-210 se midió mediante TaqMan miARN QRT-PCR. asociado
valores de P fueron asignados por Wilcoxon punto de parcelas firmado-rank test. Las gráficas de puntos y curvas ROC se generaron como se describe para la Fig. 1.
Baja
:
Red
, los resultados de la validación del conjunto de muestras obtenidas de la Universidad de Michigan.
Negro
, los resultados del conjunto de la muestra primaria obtenida de la Universidad de Washington reproducido en la figura. 1
B Opiniones
, menor
. AUC, área bajo la curva; mCRPC, próstata paciente de cáncer de sueros; FC, factor de cambio; CTL, los sueros de control (de individuos machos de la misma edad con PSA normal y tacto rectal negativo).
Para validar estos resultados en un conjunto de muestras independientes recogido en una institución diferente, que mide el miR-141 , miR-200a, miR-200c, miR-375 y miR-210 de los sueros de un adicional de 21 pacientes mCRPC y 20 controles sanos emparejados por edad recogidos en la Universidad de Michigan. Los cinco miRNAs fueron elevados en sueros de casos mCRPC relación con los controles en este conjunto de validación independiente. MiR-141, miR-375 y miR-210 eran significativas a un
P
-valor umbral de & lt; 0,01 en la segunda cohorte (
P = 0,001
,
P =
0,021,
P = 0,022
, respectivamente) y miR-200a y miR-200c tendían hacia la significación (
P = 0,073
,
P = 0,055
, respectivamente) (Fig. 1
C
,
superior). Las curvas ROC fueron generalmente concordantes entre los conjuntos de muestras de las dos instituciones (Fig. 1
C
,
menor
). Análisis de los marcadores séricos miARN en varias combinaciones demostró que la adición de miRNAs adicionales al suero miR-141 (que tenía el mejor rendimiento solo) no mejoró la capacidad de distinguir entre los casos y los controles (datos no mostrados). En consonancia con esta observación, se encontró que entre los casos de cáncer en los que la expresión de miR-141, miR-200a, miR-200c, y miR-375 fue superior a todos los controles sanos, estos miRNAs también se correlacionaron significativamente con los demás y con suero PSA (Tabla S2). Por el contrario, el miR-210 no mostró correlación significativa con ninguno de estos cuatro miRNAs (Tabla S3) ni con niveles séricos de PSA, lo que sugiere que proporciona información clara acerca de la biología de la enfermedad.
Para determinar si los cinco marcadores séricos miARN de mCRPC se expresa en el tejido de cáncer de próstata y por lo tanto podría ser plausiblemente derivado de las células del cáncer, que mide su expresión en las células epiteliales que había sido captura por láser micro-disecados a partir de tejidos de cáncer de próstata primario (
n = página 8) y metástasis en los ganglios linfáticos (
n = página 8). Detectamos el miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-375 y miR-210 en todos los tipos de tejidos evaluados (Tabla S3), lo que sugiere que estos cinco miRNAs, cuando se encuentran en la circulación, podrán ser presentados por el cáncer de próstata, aunque otras fuentes adicionales no pueden ser excluidas.
Tres de los miRNAs asociados con el cáncer de próstata identificados en suero (miR-141, miR-200a y miR-200c) son epiteliales específicos, altamente relacionadas en secuencia y tienen funciones conocidas en mantener el estado epitelial por la supresión de la transición epitelio-mesenquimal [4]. Nuestra hipótesis es que los niveles circulantes elevados de miR-141, miR-200a y miR-200c reflejan el origen epitelial de las células del cáncer de próstata.
La presencia de elevados circulantes de miR-141 y miR-375 en pacientes mCRPC tiene también ha observado en los últimos mCRPC miARN estudios de biomarcadores circulantes [12] - [16]. Curiosamente, elevó el miR-210 no se informó en estos otros estudios, a pesar de que se observó esto en conjuntos de muestras independientes de dos instituciones diferentes. Esto podría ser debido a diferentes grupos de comparación utilizados (por ejemplo, cáncer de próstata localizado en vez de controles sanos como el comparador de mCRPC), el uso de plasma en lugar de suero, las diferencias en el enfoque analítico de datos utilizada para identificar miRNAs expresados diferencialmente, así como posibles diferencias en las características clínicas de los pacientes mCRPC a través de diferentes estudios.
los niveles elevados de miR-210 en suero de pacientes con mCRPC fue particularmente interesante porque este miARN es bien conocido por ser transcripcionalmente activados por la hipoxia inducible por el factor 1 alfa (HIF-1α) [17], [18] y puede contribuir a la adaptación a la hipoxia en los tumores [19], [20]. Esto plantea la posibilidad de que miR-210 se produce y se libera por las células hipóxicas en el cáncer de próstata (y /o por el microambiente del tumor), una posible explicación para los niveles elevados de miR-210 se observó en el suero de un subgrupo de pacientes con mCRPC
.
Para probar si la hipoxia puede estimular la producción y liberación de miR-210 en células de cáncer de próstata, que caracteriza miR-210 abundancia en líneas celulares de cáncer de próstata LNCaP y VCAP (así como en medios acondicionados filtrada) bajo normoxia (20% O
2) y la hipoxia (1% O
2) condiciones durante un transcurso de tiempo de 72 horas (Fig. 2). los niveles de miR-210 se incrementaron por la hipoxia en comparación con la normoxia con una inducción inicial en células LNCaP, seguido de un aumento del nivel posterior en el medio condicionado (Fig. 2). En las células VCAP, no observamos el mismo aumento en el miR-210 copias /ng de ARN y los niveles cayeron a las 72 horas. Los autores especulan que esto podría ser debido a la muerte celular o, alternativamente, que la regulación de miR-210 en respuesta a la hipoxia en las células VCAP puede ser principalmente ocurre a nivel de la liberación. Sin embargo, sí se observó una gradual, aumento dependiente del tiempo en el nivel de extracelular de miR-210 en los medios de las células VCAP acondicionado (Fig. 2). Tomados en conjunto, los resultados indican que los niveles elevados de miR-210 detectados en el suero podrían reflejar la hipoxia tumoral.
Columna de la izquierda, España miR-210 copias /ng de ARN en LNCaP y VCAP cáncer de próstata humano líneas de células cultivadas en normoxia (20% o
2) (barras blancas) o hipoxia (1% o
2) (barras azules) condiciones durante 24, 48 ó 72 horas.
Columna de la derecha, España miR-210 copias /l en el medio condicionado filtrada correspondiente a muestras celulares. *,
P
valor & lt; 0,05; **,
P
valor & lt; 0,01; ***,
P
valor. & Lt; 0,001 (prueba t de Student)
La hipoxia tumoral es un proceso bien caracterizado que contribuye a la progresión del cáncer y la metástasis en muchos cánceres humanos [21]. Evaluación de la hipoxia tumoral en mCRPC se ha limitado hasta la fecha debido al muestreo frecuente de metástasis para la atención clínica de rutina. En un estudio de inmunohistoquímica de la expresión de HIF-1α que incorpora un pequeño conjunto de metástasis de cáncer de próstata, se observó la expresión de HIF-1α a variar ampliamente en las lesiones metastásicas [22]. Aquí, mostramos que un subconjunto de pacientes con cáncer de próstata metastásico han aumentado los niveles de suero de miR-210, proporcionando evidencia de hipoxia previamente poco apreciada en mCRPC. Aunque fuentes de tejidos no tumorales de miR-210 no se puede descartar, el hecho de que la hipoxemia sistémica no es una característica típica de mCRPC es consistente con un modelo en el que la hipoxia del tejido tumoral es el origen del exceso de suero de miR-210. En particular, circulantes elevados de miR-210 también se ha observado en pacientes con adenocarcinoma de páncreas [23], una enfermedad en la que la hipoxia tumoral es bien reconocida y es debido a la alta presión intersticial debido a la respuesta desmoplásico de acogida.
Un fenómeno bien documentado asociado con la hipoxia tumoral es la asociación con la resistencia al tratamiento con radioterapia, quimioterapia y otras terapias [21]. Para determinar si el suero observada miR-210 niveles se asociaron con resistencia al tratamiento, se evaluó retrospectivamente si los pacientes estaban respondiendo o resistentes a la terapia en curso mediante el cálculo de% de cambio de PSA /día utilizando los valores de PSA clínica disponibles medido más recientemente antes y en el momento de suero sorteo de miR-210. Terapias variaban entre los pacientes en esta población retrospectiva, pero típicamente involucrados terapia de privación de andrógenos usando un agonista de GnRH en combinación con un agente quimioterapéutico (por ejemplo, docetaxel, mitoxantrona). Se encontró que los niveles séricos de miR-210 se correlacionaron significativamente con el cambio de PSA% /día durante el tratamiento (Fig. 3
Un
, Pearson r = 0,46,
P = 0,029
). Para reducir el ruido potencial de los pacientes que son menos informativos debido a los bajos niveles de miRNAs en suero asociados al cáncer, también se analizó un subgrupo de pacientes con altos niveles de miRNAs en suero asociados-mCRPC (es decir, "los genes miARN-alta subconjunto", definidos como pacientes cuyo suero de miR-141, miR-200a, miR-200c y /o los niveles de miR-375 eran mayores que el valor más alto observado en ninguno de los 25 controles sanos). En este grupo, la correlación entre el suero de miR-210 y% de cambio de PSA /día fue aún más fuerte (Fig. 3
Un
, Pearson r = 0,61,
P = 0,029
). Por otra parte, los niveles séricos de miR-210 fueron notablemente inferiores en los pacientes cuya enfermedad estaba respondiendo al tratamiento (PSA estable o decreciente), en comparación con aquellos cuya enfermedad era resistente al tratamiento (PSA aumentando en ≥25%) (Fig. 3
B,
P
=
0,001). Es importante destacar que no se observó esta asociación con los otros cuatro miRNAs suero identificados en nuestro estudio (Fig. 3
C
). Nuestros datos sugieren un modelo en el que aumenta la señalización de respuesta a la hipoxia está presente en un subconjunto de pacientes mCRPC, lo que lleva a un aumento en suero de miR-210 y la resistencia a la terapia
Alta:.
MiR-210 copias /l de suero frente% de PSA /cambio de día. % De cambio de PSA /día representa una medida de la respuesta al tratamiento y se calculó utilizando los valores de PSA clínicos disponibles medidos más recientemente antes de, y en el momento de suero miR-210 sorteo. tiempo transcurrido entre los dos extracciones de sangre fue de 30 días significar. círculos cerrados representan el subgrupo de pacientes definidos como "miARN-alta", basada en una mayor abundancia de miRNAs en suero asociados-mCRPC en comparación con todos los individuos de control (como se describe en Resultados y Discusión). Los círculos abiertos representan los pacientes con mCRPC que no cumplían con la definición de "miARN-alta". La línea continua representa la línea de tendencia del subgrupo de pacientes miARN-alta, la línea de puntos representa la línea de tendencia de todos los pacientes.
Oriente:
miR-210 copias /l en suero en pacientes con ya sea una respuesta del PSA (R) o sin respuesta del PSA (NR). PSA de respuesta se define como una disminución o PSA estable (cualquier cambio menos de un aumento del 25%), y no hay respuesta PSA se define como un aumento de PSA de 25% o más, similar a los criterios del Grupo de Trabajo del cáncer de próstata.
Baja:.
Copias /l de suero de miR-141, miR-200a, miR-200c y miR-375 en pacientes, R y NR
Para nuestro conocimiento, este es el primer informe de hacer circular el miR-210 en asociación con mCRPC. Nuestros resultados plantean la posibilidad de que los niveles séricos de miR-210 se podrían utilizar para identificar un biológicamente diferentes, subgrupo de pacientes con hipoxia mCRPC asociado a un tumor para el que se podría considerar el desarrollo de enfoques terapéuticos alternativos. Por ejemplo, se ha informado de miR-210 niveles plasmáticos elevados en pacientes con cáncer pancreático y como indicador de la hipoxia [23], [24], así como correlacionado con la respuesta a trastuzumab en pacientes con cáncer de mama [25]. Además, los inhibidores de mTOR se están estudiando en el cáncer de próstata, y los estudios pre-clínicos han demostrado que la inhibición de mTOR puede conducir a la activación de AKT y HIF-1α activación transcripcional [26]. En este contexto, se especula que sérica elevada de miR-210 podría tener una utilidad potencial como un biomarcador predictivo o la respuesta para esta clase de productos terapéuticos.