Extracto
Aplicaciones
exosomal microARN (miARN) han estado atrayendo gran interés como potenciales biomarcadores de diagnóstico de cáncer. El objetivo de este estudio fue caracterizar los perfiles de miARN de exosomas de suero y de identificar a los que están alterados en el cáncer colorrectal (CCR). Para evaluar su uso como biomarcadores de diagnóstico, la relación entre los niveles de miARN exosomal y cambios patológicos de pacientes, incluyendo estadio de la enfermedad y la resección del tumor, se examinó.
analiza Diseño Experimental
microarrays de miRNAs en se realizaron fracciones de exosoma enriquecida de muestras de suero de 88 pacientes primarios de CRC y 11 controles sanos. Los niveles de expresión de miRNAs en el medio de cultivo de cinco líneas celulares de cáncer de colon también se compararon con los del medio de cultivo de una línea celular de colon derivada normal. Los perfiles de expresión de miRNAs que son expresados diferencialmente entre CRC y conjuntos de muestras de control se verifica por medio de 29 pares de muestras de pacientes con resección post-tumorales. La sensibilidad de miRNAs seleccionados como biomarcadores de la CRC se evaluaron y compararon con los de los marcadores tumorales conocidos (CA19-9 y CEA) utilizando un receptor de funcionamiento característico análisis. Los niveles de expresión de miRNAs seleccionadas también fueron validados por cuantitativa en tiempo real RT-PCR análisis de un conjunto independiente de 13 pacientes con CCR.
Resultados
Los niveles séricos de exosomal siete miRNAs (let- 7a, MIR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223 y miR-23a) fueron significativamente mayores en pacientes con CRC primarias, incluso aquellos con enfermedad en estadio temprano, que en los controles sanos, y fueron significativamente las reguladas después de la resección quirúrgica de los tumores. Estos miRNAs también se secretaron a niveles significativamente más altos de líneas celulares de cáncer de colon que por una línea celular de colon derivada normal. Las altas sensibilidades de los siete miRNAs exosomal seleccionados fueron confirmados por un receptor de funcionamiento característico análisis.
Conclusión
ha firmas
exosomal miARN parecen reflejar los cambios patológicos de pacientes con CRC y varios miRNAs son prometedores biomarcadores para no el diagnóstico no invasiva de la enfermedad
Visto:. Ogata-H Kawata, Izumiya M, Kurioka D, Honma Y, Yamada Y, Furuta K, et al. (2014) circulantes exosomal microARNs como biomarcadores de cáncer de colon. PLoS ONE 9 (4): e92921. doi: 10.1371 /journal.pone.0092921
Editor: Tadayuki Akagi, Universidad de Kanazawa, Japón
Recibido: 13 Noviembre 2013; Aceptado: February 26, 2014; Publicado: 4 Abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Ogata-Kawata et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Financiación proporcionada por la Investigación avanzada de Productos médicos Programa de Minería del Instituto Nacional de Innovación Biomédica (NIBIO) (08-02), http://www.nibio.go.jp; Grant-in-Sida del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar (13802015), http://www.mhlw.go.jp/; Grant-in-Sida del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes & amp; Tecnología de Japón (13314780), http://www.jsps.go.jp/; Centro Nacional de Investigación del Cáncer y el Fondo de Desarrollo (23-B-08), http://www.ncc.go.jp. Centro Nacional del Cáncer Biobanco es apoyado por el Fondo Nacional de Desarrollo Centro de Investigación del Cáncer y. . Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y el análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: Hideki Ohta, Hiroyuki Okamoto y Hikaru Sonoda, son empleados de Shionogi & amp; Co., Ltd. Shionogi & amp; Co., Ltd. tiene una licencia exclusiva para varios miRNAs que se presentan en este trabajo. Shionogi & amp; Co., Ltd. ha solicitado una patente (WO2011 /040525) para el desarrollo de estos miRNAs como marcadores de diagnóstico. No hay más patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es una de las principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. Métodos sistemáticos para el diagnóstico de condiciones patológicas pueden contribuir a una alta tasa de detección de los pacientes en etapas tempranas de CRC, lo que lleva a una reducción en las tasas de mortalidad. La aplicación de la prueba de sangre oculta en las heces y la sigmoidoscopia flexible como métodos de selección ha reducido la mortalidad por CCR [2], [3]. Sin embargo, estas técnicas tienen limitaciones inherentes; la sensibilidad de la detección de la prueba de sangre oculta en heces es bastante baja y la sigmoidoscopia flexible es invasivo e incómodo para los pacientes. Carbohidratos antígeno 19-9 (CA19-9) y el antígeno carcinoembrionario (CEA) han sido ampliamente utilizados como marcadores tumorales para la detección de muchos tipos de cáncer, incluyendo el colon, hígado, páncreas y estómago. Sin embargo, la sensibilidad de estos marcadores para la detección de CRC es baja, especialmente en las primeras etapas de la enfermedad [4]. Por lo tanto, hay una necesidad para el desarrollo de marcadores de diagnóstico CRC-específicas para la detección rápida, no invasiva y altamente sensible de los pacientes.
Los microARN (miRNA) son endógenas, pequeña, los ARN no codificantes y su expresión específica de tejido contribuye al control preciso de diversos procesos biológicos [5], [6]. La disfunción de miRNAs se encuentra en varios tipos de cáncer y los perfiles de expresión endógenos de miRNAs se puede utilizar para clasificar los tipos de cáncer [7], [8]. Varios miRNAs que muestran altos niveles de expresión en tejidos de cáncer se han reportado como marcadores de diagnóstico o pronóstico adecuadas [9]. Estudios recientes demostraron que miRNAs son secretadas por diversas células, incluyendo las células de cáncer, en los fluidos corporales tales como sangre, orina, leche materna y saliva,
vía
exosomas [10] - [12]. Los exosomas son pequeñas vesículas de membrana de aproximadamente 100 nm que incorporan proteínas, lípidos, ARNm, y miRNAs, en función del origen de las células secretoras [13], [14]. Por lo tanto, miRNAs exosomal en los fluidos corporales pueden ser biomarcadores de diagnóstico útiles para la detección de cáncer [10], [15]. Sin embargo, en la actualidad existe una falta de información con respecto a la relación entre los perfiles de miARN exosomal en la sangre y la condición patológica de los pacientes con cáncer.
A continuación, se realizó un perfilado a base de microarrays de miRNAs exosomal en sueros de controles sanos (HC ) y pacientes con CRC primarios. También se examinaron los perfiles de miARN en exosomas de líneas celulares de cáncer de colon para identificar biomarcadores candidatos secretadas por células de cáncer de colon. Las firmas exosomal miARN diferían entre los pacientes y los controles de CRC. Mediante la comparación de los perfiles de miARN de muestras clínicas y líneas celulares, ocho miRNAs (let-7a, miR-1224-5p, MIR-1229, MIR-1246, miR-150, miR-21, miR-223 y miR-23a) que fueron significativamente elevados en los exosomas de suero de pacientes con CRC primaria y se redujeron regulado después de la cirugía fueron identificados. elevación asociada al CRC de siete de estos miRNAs exosomal fue validado en un conjunto de muestras independientes utilizando cuantitativa en tiempo real RT-PCR (QRT-PCR). Tomados en conjunto, los resultados presentados aquí demuestran que exosomal firmas miARN reflejan los cambios patológicos en pacientes con CCR y son aplicables para el desarrollo de estrategias de diagnóstico para la detección de CRC primarias.
Materiales y Métodos
Las muestras clínicas
las muestras de suero de 88 pacientes con CCR fueron proporcionados por el Centro Nacional del cáncer del hospital Biobanco, Japón (Tokio, Japón) de 2003 a 2004. las muestras de suero (de entre 35 a 65 años) con un tumor primario fueron también recogidos de 29 de los pacientes después de la resección quirúrgica del tumor primario, de 2003 a 2004. para la validación de QRT-PCR, las muestras de suero de 13 pacientes con CRC diferentes (de 45 a 70 años) con un tumor primario fueron proporcionados por el hospital Nacional del Centro del cáncer Biobanco , Japón en 2009. Las muestras quirúrgicas de cáncer de colon primario y las regiones circundantes no cancerosas se obtuvieron de los pacientes tratados en el hospital de la Universidad de Teikyo (Tokio, Japón) [16]. Los sueros de 19 individuos (de 35 a 65 años) que se sometieron a un examen físico completo en el Centro Médico de NTT Tokio (Japón) en 2011 fueron utilizados como muestras de HC. Las muestras de suero fueron almacenadas a -20 ° C hasta su uso.
Declaración de Ética
aprobaciones de la Junta de Revisión Institucional para el uso de las muestras fueron obtenidas en NTT Centro Médico de la Universidad de Tokio, y Nacional del Cáncer Centrar. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes incluidos en el estudio.
Las líneas celulares
Todas las líneas celulares utilizadas en este estudio se obtuvieron de la American Tissue Culture Collection. las células del colon derivados fetales humanos normales FHC se cultivaron en DMEM-F12 que contiene HEPES 25, 10 ng /toxina del cólera ml, 5 mg /ml de insulina, 5 mg, 100 ng /ml de hidrocortisona, y suero bovino fetal /ml de transferrina 10% [17]. El HCT116, HT-29, líneas celulares de cáncer de colon humano RKO, SW48, y SW480 se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino [18] - [20]. El medio de cultivo se recogió después de un crecimiento de las células durante 48 h.
Preparación de fracciones de exosoma enriquecida
fracciones exosoma se prepararon por un método de centrifugación-ultracentrifugación paso a paso, como se describe previamente con modificaciones menores [13]. Brevemente, medio de cultivo de líneas celulares de cáncer de colon se centrifugó a 500 xg durante 5 minutos para eliminar los restos celulares, y después se centrifugó a 16.500 × g durante 20 min usando un rotor JA-30.50 (Beckmann). El sobrenadante clarificado se pasó a través de un filtro de 0,20 micras y luego se ultracentrifugó a 120.000 xg durante 70 min usando un rotor TLA-110 (Beckmann). Los sedimentos se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y después se resuspendieron en 250 l de PBS como fracciones de exosoma enriquecida. Las muestras de suero (750 l) de pacientes con CRC y los HC se diluyeron ocho veces con PBS y las fracciones de exosoma enriquecida se prepararon como se ha descrito anteriormente. Enriquecimiento de la CD81 marcador de exosoma en las fracciones preparados fue confirmada por análisis de inmunoblot (ver Métodos S1 y Figura S1).
Preparación de RNA total exosomal
La fracción exosome preparado a partir de suero se mezcló con 750 l de reactivo Trizol-LS (Invitrogen) y la fase acuosa se recogió mediante la adición de cloroformo. Después de la adición de etanol a la fase acuosa, el ARN total se purificó utilizando RNeasy Mini Spin Columnas (Qiagen). La muestra de ARN se secó utilizando un concentrador Speed-vac centrífuga (Savant) y después se disolvió en 10 l de agua libre de nucleasa. La concentración de ARN se determinó usando un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific) y el Quanti-iT RiboGreen RNA Assay Kit (Invitrogen). Se analizó la calidad del ARN usando un Agilent 2100 Bioanalyzer y pequeños de ARN chips (Agilent Technologies).
miARN análisis de microarrays
Total ARN procedente de las fracciones exosome fueron marcadas con Cy3-PCP utilizando el Agilent reactivo de marcado miARN, y después se hibridó con un oligonucleótido miARN microarray humana (8 × 15 K, versión 3.0; Agilent Technologies), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la hibridación, la matriz se lavó con expresión génica kit de tampón de lavado (Agilent Technologies) y digitalizadas mediante un escáner de microarrays de ADN de Agilent. Después de la conversión numérica de los datos brutos, utilizando extracción de características de software (versión 10.7; Agilent Technologies), los datos transformados se analizaron utilizando el software GeneSpring GX (versión 12.5; Biología Digital). Las intensidades de señal de las manchas en la micromatriz se normalizaron a la intensidad de la señal total de la matriz y se muestran como porcentajes. Los datos de microarrays miARN se han depositado en la base de datos NCBI Gene Expression Omnibus con GSE40247 código de acceso.
QRT-PCR
miRNAs exosomal fueron transcritas inversa utilizando la transcriptasa inversa MultiScribe (Life Technologies) y miRNA- cebadores específicos. Los miRNAs se cuantificaron mediante PCR en tiempo real utilizando kits TaqMan microARN (Life Technologies) y el sistema de PCR en tiempo real 7300 (Applied Biosystems), de acuerdo con un protocolo estándar [21]. Se utilizó el ciclo umbral comparativo (Ct) para evaluar el nivel de detección relativa de cada uno de los genes miARN en la muestra, el cual fue determinado utilizando la 2
método -ΔΔCT [22]. En los experimentos de QRT-PCR, miR-451 se usó como un patrón interno porque era detectable en todas las muestras y sus intensidades normalizadas no fueron significativamente diferentes entre los exosomas séricos de HC y CRC (
P
& gt; 0,05).
el análisis estadístico
a dos lados de Student pareada
t-test o
de Welch
t-test
se utilizó para determinar la significación estadística de las diferencias en los microarrays intensidad de la señal. El análisis de agrupamiento jerárquico de la base de datos de todos los perfiles de miARN se realizó mediante el método de Ward. El funcionamiento del receptor curva característica y el área (ROC) bajo la curva se analizaron para evaluar la posibilidad de utilizar una relación de miRNA seleccionado como un marcador de diagnóstico para la CRC. Los coeficientes de correlación de perfiles de miARN exosomal entre las líneas celulares y de los niveles de CA 19-9, CEA, y miRNAs exosomal en el suero del paciente como candidatos marcadores de CRC se determinaron mediante análisis multivariante. Estos análisis se realizaron utilizando el software JMP9. Se utilizó el test de Jonckheere-Terpstra (software SPSS, versión 18) para determinar la correlación entre las etapas del tumor CRC /nodo /metástasis (TNM) y los niveles de miRNA.
Resultados
Identificación de miRNAs exosomal que se elevan en el CCR de análisis de microarrays
cribado basado en microarrays se utilizó para detectar los niveles de miRNA en fracciones exosomal de muestras de suero de pacientes con CRC y HC, así como medios de cultivo de una línea celular de colon derivada normal y cinco líneas celulares de cáncer de colon humano diferente. La Figura 1 muestra una visión general de la estrategia de detección utilizada. Las fracciones de exosoma enriquecida se prepararon utilizando un método de centrifugación-ultracentrifugación paso a paso, como se muestra en la Figura S1A. El enriquecimiento de los pequeños ARN y CD81 en las fracciones de exosoma se confirmó mediante electroforesis capilar y análisis de inmunotransferencia, respectivamente (Figuras S1B-D). Un análisis de correlación y multivariados parcelas de datos de microarrays indican la detección reproducible de miRNAs exosomal en experimentos independientes y las correlaciones entre los perfiles de miARN de las diferentes líneas celulares de cáncer (Figura S1E y en la Tabla S1). Los perfiles de miARN exosomal de las cinco líneas celulares de cáncer de colon y la línea celular de FHC eran distintos de los perfiles de miARN celular endógeno (Figura S1F).
Los perfiles de miARN de las fracciones exosome de muestras de suero de 88 CRC pacientes primarios (incluyendo estadios clínicos TNM I, II, IIIa, IIIb y IV) y 11 HC se determinaron utilizando microarrays. Las características de los pacientes y los miRNAs exosomal detectadas en cada grupo se muestran en la Tabla 1. Se detectaron un total de 164 miRNAs en todas las muestras de suero analizadas (Figura S2A) y 69 miRNAs se expresaron en niveles significativamente más altos en pacientes con CRC que los HC (
P Hotel & lt; 0,05) (Figuras S2 B y S2C, el cuadro S2). El análisis de los perfiles de exosomal miARN de medios de cultivo de cinco líneas celulares de cáncer diferente de colon y células FHC epiteliales normales de colon reveló que 52 miRNAs se secretaron a niveles significativamente más altos de todas las líneas celulares de cáncer de cinco de colon que de las células FHC (Figuras S3A y S3B, Tabla S3).
Una comparación de los 69 miRNAs hasta reguladas a partir de pacientes con CRC y los 52 miRNAs hasta reguladas a partir de las líneas celulares de cáncer de colon reveló que 16 miRNAs estaban presentes en ambos conjuntos (Figura 2 ): let-7a, miR-1224-5p, MIR-1229, miR-1246, miR-1268, el miR-1290, MIR-1308, miR-150, miR-181b, miR-181d, MIR-1915, miR 21, miR-223, miR-23a, miR-483-5p, y miR-638. Los niveles de expresión endógenos de estos miRNAs fueron medidos en las líneas celulares de FHC y de cáncer de colon, así como el cáncer de colon y combinar los tejidos no cancerosos de cuatro pacientes adicionales. Con la excepción de miR-181d, que fue significativamente hasta reguladas tanto en las células cancerosas y tejidos de ninguno de estos miRNAs se expresaron en los tejidos de cáncer (Figura S3C) o líneas celulares de cáncer (
P
& gt; 0,05 ) (Figura S3D) a niveles significativamente más altos que los tejidos no cancerosos casadas o de la línea celular de FHC, respectivamente. Estos resultados indican que la secreción de miRNAs no depende de sus niveles de expresión celular y sugieren que miRNAs endógenos hasta reguladas en las células de cáncer no son necesariamente sustratos para la secreción de exosoma mediada. las células de cáncer de colon parecen secretar un subconjunto de miRNAs en los espacios extracelulares a través de los exosomas.
exosomal Suero niveles de miARN en 11 HC (azul) y 88 pacientes con CRC (rojo) en diferentes estadios TNM (I a IV). Las intensidades de las señales se normalizaron a la intensidad de la señal total de los microarrays. Las líneas horizontales indican la intensidad de señal normalizada media para cada grupo. Diferencias estadísticamente significativas se determinaron por Welch de
t-test
.
La relación entre los niveles séricos de exosomal 16 miRNAs y los estadios clínicos de cáncer de colon
A continuación, hemos analizado la relación entre los 16 miRNAs comúnmente hasta reguladas y las etapas clínicas de la CRC mediante la separación de los pacientes con CCR sobre la base de su estadio TNM. Para cada uno de los genes miARN, hay una correlación significativa (
P Hotel & gt; 0,05) entre el nivel exosomal y la etapa clínica de la enfermedad fue identificado por una prueba de Jonckheere-Terpstra (figura S4)
abajo. -Regulación de ocho miRNAs después de la eliminación de los tumores primarios
para determinar si las 16 miRNAs comúnmente hasta reguladas originó a partir de células de cáncer, se utilizaron análisis de microarrays para determinar los niveles de estos miRNAs en fracciones de exosoma enriquecida de suero emparejados muestras recogidas después de la resección quirúrgica de tumores primarios (n = 29 pacientes). Los niveles de expresión de ocho de los miRNAs se redujeron significativamente (
P Hotel & lt; 0,05) después de la eliminación de los tumores primarios (Figura 3 y Tabla S4): let-7a, miR-1224-5p, MIR-1229, MIR-1246, miR-150, miR-21, miR-223 y miR-23a. Estos resultados sugieren que estos ocho miRNAs pueden derivar de exosomas secretadas por células de cáncer y que sus niveles pueden reflejar el estado del cáncer de colon de los pacientes.
(A) Diagrama de dispersión de la 16 comúnmente hasta reguladas miRNAs exosomal suero en pacientes con CRC (n = 29) antes de (Pre) y después (post) extirpación quirúrgica de tumores. El conjunto de muestras incluyó la etapa I (n = 6), fase II (n = 6), estadio IIIa (n = 5), estadio IIIb (n = 9), y la etapa IV (n = 4) de los pacientes. Los datos representan las intensidades de señal normalizadas medias (%). Los puntos rojos indican las ocho miRNAs que fueron significativamente las reguladas después de la resección del tumor: let-7a, miR-1224-5p, MIR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223, miR y 23a. (B) Los cambios individuales en los niveles séricos de exosoma de los ocho miRNAs regulan a la baja en los pacientes con CCR-(n = 29) antes (pre) y después (Post) la extirpación quirúrgica de los tumores. diferencias estadísticamente significativas entre las medias de los valores previos y los valores medios de Correos se determinaron mediante Student pareada
t-pruebas
.
Los posibles miRNAs exosome suero para aplicaciones como biomarcadores de diagnóstico de
Para estimar su poder como marcadores diagnósticos potenciales, los valores de corte de las ocho miRNAs que son regulados hasta en el cáncer de colon y el regulado después de la resección del tumor se analizaron mediante una curva ROC (Figura 4). Las verdaderas tasas positivas de miR-1246 y miR-23a para la identificación de los 88 pacientes con CCR fueron 95,5% y 92,0%, respectivamente; estos miRNAs también tenían bajas tasas de falsos positivos para la identificación de los 11 HC (9% y 0%, respectivamente). Las verdaderas tasas positivas de miR-21, miR-150, let-7a, miR-223, miR-1224-5p, y miR-1229 para la identificación de CCR fueron 61,4%, 55,7%, 50,0%, 46,6%, 31,8% y 22.7%, respectivamente; las tasas de falsos positivos de estos miRNAs variaron de 0% a 9% (Figura 4). Se observa que un uso combinado de 8 miRNAs no mostró más poder de diagnóstico que los de miRs-1246 y -23a (datos no mostrados). En comparación, la sensibilidad de CEA y CA19-9, que son conocidos biomarcadores de CRC, fueron 30,7% y 16,0%, respectivamente. Un análisis multivariado indicó ninguna correlación entre los niveles de los ocho miRNAs seleccionados en exosomas en suero y los niveles séricos de CEA y CA19-9 (Tabla S5). Por lo tanto, que re-evaluaron los niveles de expresión de los ocho miRNAs en exosomas suero por QRT-PCR análisis de un conjunto de muestras adicional que incluía ocho HC, I pacientes con CRC de siete etapas, y seis pacientes en estadio II CRC (Tabla S6). Los niveles de siete de los miRNAs, a saber let-7a, MIR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223 y miR-23a, fueron significativamente mayores en los exosomas de suero de pacientes con CRC que los de HC (
P Hotel & lt; 0,05) (Figura 5). aumentos estadísticamente significativos en los niveles de expresión de estos miRNAs se observan incluso para la primera etapa (etapa I TNM) CRC muestras (Figura S5). Estos resultados sugieren que los miRNAs exosomal suero pueden ser útiles para la detección precoz del CRC primarias.
Las intensidades de señal de los miRNAs se muestran como porcentajes de la intensidad de la señal total. Los valores de corte de las ocho miRNAs que fueron reguladas en el cáncer de colon y el regulado después de la resección del tumor se analizaron mediante una curva ROC. Las cajas negras indican los pacientes sobre el valor de corte de los biomarcadores o los niveles de miRNA. Las intensidades normalizadas de miRNAs no detectables en suero exosomas se calcularon como 0.
Los diagramas de caja y bigotes de los niveles de expresión de los ocho seleccionados miRNAs en un conjunto independiente de los HC (n = 8) y CRC pacientes con tumor primario (n = 13). Las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de datos HC y CRC se determinaron por Welch de
t-pruebas
. El método comparativo ciclo umbral (Ct) se utilizó para cuantificar los niveles de miRNAs exosomal en pacientes HC y CRC. La proporción relativa se calculó utilizando el método 2
-ΔΔCt. El valor Ct de miR-451 se utilizó como estándar interno. Cada punto de datos se normalizó a una muestra representativa HC.
interés importante Discusión
Recientemente, han atraído miRNAs como un medio para analizar las vías moleculares implicadas en el desarrollo y progresión del cáncer. Además de sus importantes funciones celulares, es posible que miRNAs secretadas incrustados en exosomas pueden ser biomarcadores de diagnóstico para la detección del cáncer. Aquí, el análisis exhaustivo de los perfiles de miARN exosomal identificaron 16 miRNAs que se expresaron en niveles significativamente más altos en líneas celulares de cáncer de colon y muestras de suero de pacientes con CRC que las células normales de colon derivada de y muestras de suero de los HC, respectivamente. Endógenas niveles de expresión de la mayoría de estos miRNAs no son regulados hasta en líneas celulares de cáncer y tejidos de cáncer, lo que sugiere que la secreción exosomal de miRNAs no depende de los niveles de expresión celular. Por otro lado, miR-181, un cáncer asociado miRNA dependiente del contexto [23], [24], sólo se indica hasta reguladas niveles de expresión celulares y exosomal en líneas celulares de cáncer y muestras clínicas, lo que sugiere una hipótesis interesante que la función exosomal de miR-181 podría estar involucrado en el desarrollo del cáncer de colon y la progresión.
Los niveles en suero de exosomal ocho de estos 16 miRNAs fueron significativamente las reguladas después de la resección quirúrgica de tumores primarios, lo que sugiere que estos miRNAs son secretados de células tumorales. Sin embargo, no se excluye la posibilidad de que estos miRNAs son secretadas por otras células, incluyendo las células inmunes e inflamatorias, que se producen por casualidad en lesiones primarias del tejido. elevaciones Por último, asociada al CRC de los niveles exosomal de siete niveles de miARN (let-7a, MIR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223 y miR-23a) se validaron mediante qRT-PCR , que indica que estos miRNAs pueden ser biomarcadores adecuados para detectar cánceres de colon. Las altas sensibilidades y especificidades de estos miRNAs exosomal determinados por análisis ROC (Figura 4) apoyar su uso como biomarcadores de diagnóstico.
Los niveles exosomal de los siete seleccionados miRNAs no dependían de la etapa clínica del CCR (figura S4 ). De hecho, el miR-23a y miR-1246 mostraron sensibilidades altas para las muestras de la etapa I del 95% y 90%, respectivamente. En comparación, la sensibilidad de CA 19-9 y CEA para la etapa I CRC son sólo el 10 y el 15%, respectivamente. Por otra parte, QRT-PCR demostró la detección reproducible de estos miRNAs en altos niveles en un conjunto independiente de exosomas de suero de pacientes en estadio I CRC (Figura S5). Estos hallazgos sugieren que estos miRNAs son biomarcadores adecuados para la detección de CRC etapa temprana. Sin embargo, se requiere una validación adicional para apoyar esta propuesta.
Un informe reciente demostró que let-7a se expresa en altos niveles en los exosomas secretadas en el suero de las células tumorales de glioblastoma [15]. Además, el miR-1246 es detectable en muestras de suero enteros, en lugar de fracciones exosome, a partir de pacientes con cáncer de esófago [25]. También medimos let-7a, miR-1224-5p, y miR-150 niveles en el medio de cultivo de líneas de células pancreáticas y se encontró que los niveles fueron similares a los secretados por las líneas celulares de cáncer de colon de cinco (datos no mostrados), lo que sugiere que estos miRNAs se secretan habitualmente a partir de varias células de cáncer. Varios informes han sugerido el uso de circulante miRNAs en el plasma o suero entero, incluyendo el miR-141, miR-21, miR-221, miR-29 y miR-92a, como biomarcadores de diagnóstico de CCR [26] - [30]. Estos miRNAs se muestran para mostrar sensibilidades y especificidades comparables a los de los marcadores de cáncer de colon actualmente en uso. En particular, se informó de miR-141, miR-221 y miR-21 a ser de hasta reguladas en tejidos de cáncer [31] - [33]; el miARN total establecido a partir de plasma o suero puede incluir miRNAs celulares endógenas derivadas de células tumorales rotos o que circulan [34], [35], lo que puede explicar por qué el miR-141, miR-221 y miR-21 están presentes en niveles altos en el conjunto de muestras de suero o plasma de pacientes con cáncer. Además, se informó de miRNAs de suero /plasma, que no están asociados con vesículas, para mostrar la estabilidad diferencial al tratamiento por la RNasa A [36], lo que sugiere que miRNAs exosomal son más preferibles como muestras biológicas para el desarrollo de biomarcadores de diagnóstico debido a su estabilidad en el suero /plasma. De hecho, los resultados presentados aquí demuestran que los niveles de exosomal miARN también reflejan el estado de portadores de cáncer y alteraciones patológicas de los pacientes. Los exosomas son liberados de forma activa a partir de células de cáncer y sus constituyentes específicos dependen de la célula de la cual se originan. De hecho, las células cancerosas pueden utilizar un mecanismo aún no identificado para incrustar un subconjunto de miRNAs en exosomas.
En resumen, se han realizado recientemente intentos de utilizar miRNAs en suero o plasma como biomarcadores de diagnóstico de diversos tipos de cáncer [37] ; Sin embargo, actualmente no existe una visión colectiva de la cual los miRNAs deben ser seleccionados como marcadores. Las propiedades únicas de los exosomas, incluyendo su capacidad de incrustar miRNAs específicos, su estabilidad en la circulación, su detección reproducible y, lo más importante, el hecho de que reflejan las propiedades de las células cancerosas, puede hacer que sean útiles para el desarrollo de estrategias de diagnóstico altamente sensibles para la monitorización rápida y no invasiva de la condición patológica de los pacientes con cáncer.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Preparación de fracciones de exosoma enriquecida de medio con suero o cultivo celular. (A) Descripción general del procedimiento de enriquecimiento de exosomas. (B) El análisis por inmunotransferencia de los niveles de CD81 en el suero humano antes de exosoma de enriquecimiento y antes (carril 2) o después de un almacenamiento overnsight a 4 ° C (carriles 5 y 6), -20 ° C (carriles 7 y 8), o - 80 ° C (calles 9 y 10). suero bovino fetal (FBS) antes (carril 1) y después del almacenamiento durante la noche a 4 ° C (calles 3 y 4) se utilizó como control. La fracción enriquecida en exosoma continuación se preparó a partir de 1 ml de suero utilizando el método de ultracentrifugación se describe en la sección Materiales y Métodos (carril 11). Cinco microlitros de cada muestra de suero, o 300 ng de la fracción enriquecida se cargaron en un gel de SDS-poliacrilamida de gradiente 10-20%. CD81, un marcador de exosoma, se detectó usando un anticuerpo específico. (C) Detección de la pequeña fracción de ARN de los ARN celulares totales (endógenos) y ARN (exosomal exosomal) a partir de células HCT116 (30 ng de cada uno). Los ARN se cargaron en 5-150 nt pequeños chips de ARN (Agilent) y capilar a electroforesis utilizando un Agilent 2100 Bioanalyzer. Una fracción de ARN pequeño que contiene miRNAs fue detectable en aproximadamente 10-40 nt. El pico a 4 nt representa un marcador de tamaño. Las flechas llenas y abiertas indican 5S ARNt y ARNr pequeñas, respectivamente. FU, unidades de fluorescencia. (D) El análisis por inmunotransferencia de la expresión de CD81 en medio de cultivo libre de suero de células HCT116 antes y después de exosoma de enriquecimiento. Las cantidades especificadas de las muestras de proteínas del sedimento celular, medio de cultivo, y las fracciones de exosoma enriquecidos se sometieron a análisis de inmunoblot utilizando anticuerpos dirigidos a CD81 o anti-γ-tubulina, una proteína intracelular representativo. Los carriles 1-4, sedimento celular; carriles 5-7, el medio de cultivo libre de suero; carriles 8-10, la fracción enriquecida en exosomas. (E) Los diagramas de dispersión de la intensidad de señal normalizada (%) de miRNAs exosomal (paneles de la izquierda) y miRNAs celulares endógenos (paneles de la derecha) en las líneas celulares indicadas. (F) La agrupación jerárquica de miRNAs endógenos y exosomal en la línea celular normal de FHC y cinco líneas celulares de cáncer de colon humano. Los datos representan los valores medios de las intensidades normalizadas de señales (%) de n = 3 experimentos independientes. Un total de 489 miRNAs se detectaron en todas las muestras
doi:. 10.1371 /journal.pone.0092921.s001 gratis (TIF)
figura S2. el análisis de microarrays de perfiles
miARN en muestras de suero exosome enriquecida a partir de pacientes con CRC y los HC. (A) La agrupación jerárquica de miRNAs exosomal en muestras procedentes de 11 HC y 88 pacientes con CRC (TNM: etapa I, n = 20; etapa II, n = 20; estadio IIIa, n = 20; fase IIIb, n = 16; en estadio IV , n = 12). El sombreado azul y el rojo indica los pacientes de HC y de CRC, respectivamente. Las intensidades de señal de cada uno de los genes miARN se muestran como un porcentaje de la intensidad total de la señal en la matriz. Se detectaron un total de 64 miRNAs en todas las muestras de suero analizadas. (B) La agrupación jerárquica de los 69 miRNAs que se expresaron en niveles significativamente más altos en pacientes con CRC de los HC (
P Hotel & lt; 0,05 por Welch de
t-test
). plot (C) de la dispersión de las intensidades de las señales normalizadas de los 69 miRNAs exosomal que son regulados hasta en pacientes con CCR (eje y) en comparación con HC (eje x). Los datos representan las intensidades de señal normalizadas medios de cada miARN de los pacientes con CCR y HC
doi:. 10.1371 /journal.pone.0092921.s002 gratis (TIF)
Figura S3. el análisis de microarrays de miRNAs
exosomal de líneas celulares de cáncer de colon y los niveles de expresión de miRNAs endógenos. (A, B) Los niveles de expresión de los 52 miRNAs que fueron secretadas a partir de cinco células de cáncer de colon en niveles significativamente más altos que a partir de células FHC (
P
& lt; 0,05). Los datos representan las intensidades de señal normalizadas medias de n = 3 experimentos independientes de microarrays.