Extracto
estudios de asociación
genoma completo (GWAS) han identificado 19 variantes de riesgo asociados con el cáncer colorrectal. Como la mayoría de estas variantes de riesgo residen fuera de las regiones codificantes de los genes, se realizó
cis-expresión
loci de rasgos cuantitativos (
cis
-eQTL) analiza para investigar las posibles funciones de regulación de la expresión de vecinos genes. Cuarenta microsatélite isla methylator fenotipo negativo tumores colorrectales estables y CpG y tejidos de colon normales adyacentes apareados fueron utilizados para SNP en todo el genoma y perfiles de expresión génica. Se encontró que tres variantes de riesgo (rs10795668, rs4444235 y rs9929218, rs706771 utilizando casi perfectas proxies, rs11623717 y rs2059252, respectivamente) fueron significativamente asociada (FDR
q-valor
≤0.05) con niveles de expresión de genes cercanos (& lt ; 2 Mb arriba o aguas abajo). Hemos observado una asociación entre el alelo de baja el riesgo de cáncer colorrectal (A) para rs10795668 en 10p14 y el aumento de expresión de
ATP5C1 gratis (
q
= 0,024) y entre el alelo de alto riesgo de cáncer colorrectal (C ) para rs4444235 en 14q22.2 y el aumento de expresión de
DLGAP5
(
q
= 0,041), tanto en muestras de tumor. El cáncer colorrectal alelo de riesgo bajo (A) para rs9929218 en 16q22.1 se asoció con una disminución significativa en la expresión de ambos
NOL3 gratis (
q
= 0,017) y
DDX28
(
q
= 0,046) en las muestras de tejido de colon normal adyacente. De los cuatro genes,
DLGAP5
y
NOL3
se ha informado previamente a desempeñar un papel en la carcinogénesis de colon y
ATP5C1
y
DDX28 ¿Cuáles son las proteínas mitocondriales implicada en el metabolismo celular y la división, respectivamente. La combinación de los resultados de GWAS, estudios funcionales anteriores, y el
cis
-eQTL análisis descritos aquí sugieren actividades funcionales putativos para tres de los cáncer colorrectal GWAS loci riesgo identificado como la regulación de la expresión de los genes vecinos.
Visto: Loo LWM, Cheng I, Tiirikainen M, Lum-Jones A, Seifried A, Dunklee LM, et al. (2012)
cis
-Expresión análisis de QTL de cáncer colorrectal Establecido variantes de riesgo en los tumores de colon y el tejido normal adyacente. PLoS ONE 7 (2): e30477. doi: 10.1371 /journal.pone.0030477
Editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 1 de septiembre de 2011; Aceptado: 16 de diciembre de 2011; Publicado: 17 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Loo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del cáncer de los Institutos nacionales de Salud en virtud de la RFA#CA-95-011; y por medio de acuerdos de cooperación con la Universidad de Hawai colorrectal Registro Familiar del Cáncer (U01 CA074806), Mayo Clinic Cooperativa Registro Familiar de Estudios de Cáncer de Colon (U01 CA074800), Registro de Ontario para Estudios de familiar de cáncer colorrectal (U01 CA074783), la Universidad del Sur de California familiar neoplasia colorrectal Collaborative Group (U01 CA074799), y los miembros del colon Registro Familiar del cáncer y los IPs Además, este trabajo fue apoyado en parte por la subvención 5U24 CA074806 y Affymetrix Colaboraciones en el Programa de Investigación del Cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
estudios de asociación
Genome-wide (GWAS) de cáncer colorrectal han revelado 19 variantes genéticas comunes en 14 loci que contribuyen al riesgo de cáncer colorrectal [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]. Todos menos uno (rs10936599) de estas variantes de riesgo residen en regiones intrónicas, intergénicas o gen-desierto (Tabla 1) y pueden servir como marcadores para variantes causales que regulan genes vecinos o distantes. Por lo tanto, el desafío actual es dilucidar cómo estas variantes de riesgo influyen específicamente el desarrollo del cáncer colorrectal. Un enfoque prometedor es la evaluación de estas variantes para sus asociaciones con la expresión diferencial de genes desde la abundancia de transcripción puede actuar como un fenotipo intermedio útil en el desciframiento de la relación entre un locus genético y un fenotipo clínico [8].
los niveles de expresión de genes son altamente heredables [9], [10], [11] y la expresión diferencial de genes se puede asignar a un locus genético particular, como un locus de expresión de rasgos cuantitativos (eQTL) que afecta a cerca (
cis
) o distantes (
trans-
) genes [12], [13]. De hecho, se ha informado de riesgo loci GWAS ser enriquecido para eQTLs, proporcionando información sobre posibles efectos mecánicos, así como ayudar en la identificación de variantes adicionales que pueden dar cuenta de la heredabilidad de la enfermedad [14]. Mientras que varios estudios eQTL anteriores han llevado a cabo casi exclusivamente en líneas celulares linfoblásticas [12], [15], [16] asociaciones, algunos estudios recientes han demostrado específicos de tejido entre variantes genéticas y la expresión de genes [17], [18], [19]. Para loci riesgo de cáncer, se espera que las asociaciones observadas eQTL en el tejido originario dando lugar a que el tumor sea más informativo [20].
Para descubrir si las variantes de riesgo establecidos para el cáncer colorrectal afecta a la expresión de los genes diferencialmente por vecinos genotipo, se realizó un
cis
-eQTL análisis del riesgo identificado colorrectal-GWAS variantes usando las muestras de tejidos adyacentes normales y tumorales de colon duplicadas tomadas de 40 pacientes con cáncer de colon. Este es el primer estudio para llevar a cabo un
cis
-eQTL análisis tanto en tejido normal y tumoral adyacente de un grupo homogéneo de tumores colorrectales caracterizadas molecularmente (MSS y CIMP-negativas).
Materiales y métodos
Ética Declaración
la aprobación para este estudio se obtuvo de acuerdo con la normativa local Institucional Review Board (IRB) en todos los centros participantes. Todos los sujetos incluidos en este estudio firmaron un consentimiento informado por escrito.
Sujetos de estudio y muestras de tejidos
fresco congelado, se recogieron los adenocarcinomas de colon y muestras de tejidos normales adyacentes apareados en tres sitios (Mayo Clinic, Monte Sinaí, y la Clínica de Cleveland) de los participantes en el Registro de cáncer colorrectal Familiar (C-CFR) [21] y la prueba de la inestabilidad de microsatélites (MSI) y CpG fenotipo isla methylator (CIMP). Las muestras de 40 microsatélites estables (MSS) /CIMP-negativos tumores, la forma más común de cáncer de colon, y sus pares de muestras adyacentes normales de tejido (un total de 80 muestras) se utilizaron para este estudio. Los 40 pacientes eran de ascendencia europea, con una edad media de diagnóstico de 57 años de edad.
El aislamiento de ADN y ARN
Todas las muestras tumorales fueron seccionadas y teñidas con hematoxilina y eosina, y luego revisados por un patólogo para determinar el contenido de las células tumorales. Las muestras tumorales utilizadas para el estudio tenían & gt; el contenido de las células tumorales 70%. ADN genómico y ARN total se extrajeron de estas muestras de tejido utilizando el kit QIAGEN AllPrep ADN /ARN Mini (Qiagen, Valencia, CA) siguiendo las recomendaciones del fabricante.
MSI y CIMP Exámenes
estado de MSI fue determinada mediante el ensayo de 10 loci microsatélites (
BAT25
,
BAT26
,
BAT40
,
BAT24C4
,
D5S346
,
D17S250
,
ACTC
,
D18S55
,
D10S197
, y
MYCL
) como se describe anteriormente [22]. Los tumores se clasifican como MSS si no hay marcadores mostraron inestabilidad. Para la prueba de CIMP, el ADN del tumor se trató con bisulfito de sodio y se analizó usando el ensayo de MethyLight basado en PCR automatizada en tiempo real para identificar los sitios CpG metilados en las regiones promotoras de un panel de cinco genes establecido para CIMP (
CACNA1G
,
IGF2
,
Neurog1
,
RUNX3
, y
SOCS1
) y en la región promotora de
MLH1
. se informó el estado CIMP como se describe anteriormente en [23]. Los tumores se clasifican como CIMP negativo si la hipermetilación del promotor se encuentra en ≤ 2 genes del panel de cinco genes y si no había
MLH1
methyation promotor de ADN.
Análisis de microarrays
perfiles de expresión génica de los tumores de colon y el tejido normal adyacente se evaluaron con el Affymetrix GeneChip Human exón 1,0 ST array (Affymetrix, Santa Clara, CA); GEO número de Acceso GSE31737. RNA ribosómico (rRNA) se eliminó a partir de ARN total utilizando el kit de aislamiento de RiboMinus humano /ratón Transcriptome (Invitrogen Carlsbad, CA). Después de la reducción de ARNr, el Affymetrix GeneChip Total Transcripción (WT) Sentido Meta Etiquetado de ensayo se utilizó para generar amplificada y dianas de ADN de hebra de sentido para la hibridación con biotina en el GeneChip Human exón 1,0 ST arrays, siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Genómica se extrajo el ADN a partir de tejido de colon normal (n = 34) o de la sangre (n = 6) muestras y genotipo utilizando la Affymetrix Genome-Wide SNP Human 6,0 matriz. En resumen, se procesaron muestras de ADN, se etiquetan y se hibridaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Todos los arreglos fueron digitalizadas en GeneChip® El escáner 3000 7G utilizando el software de Affymetrix GeneChip consola de comandos (AGCC) para medir la intensidad de la señal fluorescente en cada ubicación de la sonda. La tasa media de las llamadas para las 80 muestras fue del 99,6%.
Selección de variantes de riesgo para CRC
Se consideraron todas las 19 variantes de riesgo establecidos para el cáncer colorrectal lo informado por los estudios de asociación de genoma completo a noviembre, 2010 (Tabla 1) [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]. Genotipo datos para 12 de las 19 variantes no estaban disponibles desde el 6,0 array Affymetrix (Tabla 1). Para cada uno de estos 12 no variantes en la matriz, se seleccionó un proxy entre los SNPs se escriben dentro de una región de 20 kb anteriores o posteriores del alelo de riesgo, lo cual fue más alta en LD (r
2≥0.90) con el riesgo variante entre HapMap CEU (http://gvs.gs.washington.edu/GVS/). Debido rs10411210 en 19q13.1 no tenía un proxy aceptable (r
2 & lt; 0,90). En la matriz de Affymetrix 6.0, que fue excluido, lo que resulta en un total de 18 variantes de riesgo para el análisis
Real- PCR en tiempo de validación
validación técnica de perfiles de expresión génica se realizó en 20 pares normales adyacentes al tumor incluidos en los ensayos de microarrays. se llevó a cabo en tiempo real PCR cuantitativa (qPCR) para los genes que se encuentran diferencialmente expresado por geneotype en este estudio (
ATP5C1
,
DLGAP5
,
NOL3
,
DDX28
) y para cuatro genes (
APC
,
MACC1
,
DCC
, y
DSC2
) previamente identificados para ser expresados diferencialmente en los tumores colorrectales. Brevemente, el ADNc se preparó a partir de hasta 2 g de RNA total sin tratar usando la alta capacidad de cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems Foster City, CA). Para Real-Time qPCR, 21-25 ng de cDNA (basado en la entrada de ARN) se ha ejecutado en placas de 384 pocillos de PCR por triplicado utilizando 1 x genes TaqMan ensayos de expresión y TaqMan PCR Universal Mastermix con los perfiles térmicos recomendados en la 7900HT Fast real -Tiempo PCR System (Applied Biosystems Foster City, CA).
análisis estadístico
para cada una de las 18 variantes de riesgo examinados, un
cis
-eQTL análisis se realizó para investigar la asociación entre los genotipos de SNP y la expresión de genes de todos los genes cercanos (a menos de 2 Mb arriba y aguas abajo de cada SNP). Cada SNP fue examinado por los modelos dominantes y co-dominantes, con el alelo mayor reportado entre los europeos como el alelo de referencia. no se presentan variantes de riesgo que tienen una categoría genotipo con menos de 2 muestras. los valores de expresión de genes en todo el genoma eran de registro
2-transformado y normalizado utilizando robusta gama Multi-Análisis (RMA), utilizando la mediana resumen esmalte [24]. El valor de la expresión del transcrito de cada gen considerado se basó en la media de la intensidad probeset para ese gen. Para identificar
cis
-genes asociado con la expresión diferencial por SNP genotipo, se llevó a cabo el análisis multivariante de covarianza (ANCOVA), ajustando por la etapa del tumor y de la hornada de ensayo. El Benjamini y tasa de falso descubrimiento de corrección de Hochberg (FDR) se aplicó para corregir el número de genes probados dentro del intervalo de 4 Mb encuestados para cada alelo de riesgo [25]. Spearman prueba de correlación de rangos se llevó a cabo para validar la correlación entre microarrays y ensayos de qPCR. Se utilizó el Partek Genómica Suite de Software 6.5 (St. Louis, MO) para microarray y análisis de datos estadísticos.
Resultados
En nuestra muestra de 40 emparejado MSS y CIMP-negativos y tumores colorrectales tejidos normales adyacentes, se identificaron 50 genes que son expresados diferencialmente por el genotipo para 11 de las 18 variantes de riesgo estudiados (
p-valores
& lt; 0,05; Tabla S1). Después de corregir múltiples pruebas, cuatro genes (
ATP5C1
,
DLGAP5
,
NOL3
,
DDX28
) fueron identificados para demostrar una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de expresión en el tumor o tejido de colon normal adyacente en una o más de las tres categorías de genotipo para rs10795668 (10p14), rs4444235 (14q22.2), o rs9929218 (16q22.1) (prueba global: FDR
q
-valor & lt; 0,05; Tabla 2). Para rs10795668 en 10p14, se observó una diferencia significativa en los niveles de expresión de genes en los tumores por el genotipo para el gen que codifica para la subunidad gamma en el complejo F1 de la ATP sintasa mitocondrial (
ATP5C1
;
q
-valor = 0,024). En contraste, no hubo diferencia en los niveles de expresión génica por el genotipo para
ATP5C1
u otros genes vecinos en el tejido de colon normal adyacente para esta variante. Del mismo modo, para rs4444235 en 14q22.2, se observó una diferencia significativa en los niveles de expresión génica por el genotipo para el
Drosophila
homólogo de discos, amplio proteína asociada 5 (
DLGAP5; q
-valor = 0,041) al comparar los niveles de expresión de genes en el tejido tumoral, pero no en el tejido normal adyacente. Para rs9929218 en 16q22.1, se observaron dos genes que tienen una diferencia en los niveles de expresión del genotipo: proteína nucleolar 3 (
NOL3
;
q
-valor = 0,017) y la caja DEAD polipéptido 28 (
DDX28
,
q
-valor = 0,046), en el lado normal, pero no en el tejido tumoral.
las comparaciones específicas del genotipo para las tres variantes de riesgo con
cis
-eQTL asociaciones se muestran en la Tabla 2 y la Figura 1. se observó un incremento en la expresión estadísticamente significativa de
ATP5C1 Hoteles en los tumores de los pacientes homocigotos para el alelo a (
q
-valor = 0,006) en rs10795668 (10p14) en comparación con el genotipo de referencia (GG). Para rs4444235 (14q22.2), los tumores de los pacientes que eran homocigóticos para el alelo C tuvieron significativamente más alta expresión de
DLGAP5 Hoteles en comparación con los tumores de los que tienen el genotipo de referencia (TT) (
q
-valor = 0,014). Para rs9929218 (16q22.1), la expresión específica para el genotipo
NOL3
y
DDX28
en el tejido de colon normal adyacente se redujo significativamente en los pacientes heterocigotos para el alelo A frente a aquellos con el genotipo de referencia (GG) (
q
-valor = 9,34 × 10
-5 y
q
-valor = 4,15 × 10
-4, respectivamente).
Los diagramas de caja de genes normalizado los niveles de expresión de
ATP5C1
,
DLGAP5
,
NOL3
,
y DDX28 Opiniones de tejido de colon normal adyacente emparejado (n = 40) y el tumor de colon de tejido (n = 40). Cada punto representa los niveles de expresión normalizados de ARN para un individuo. El nivel de expresión génica mediana para cada grupo específico genotipo se indica mediante una línea dentro de cada caja dentro de la gráfica. El
p-valor
indica la importancia de la prueba global de la comparación de expresión a través de los genotipos. Si los valores de p fueron significativas (
p
-value≤0.05), el FDR
q
fueron proporcionados-valores, lo que indica la importancia después de la corrección para comparaciones múltiples.
Debido al pequeño número de sujetos que eran homocigóticos para los alelos menores de cáncer colorrectal, también se consideraron los niveles de expresión de genes en muestras que llevaban una o dos copias del alelo menor, en comparación con el genotipo de referencia (última columna de Tabla 2). muestras tumorales de pacientes con una o dos copias del alelo menor (s) (cualquier A) para rs10795668, en comparación con el genotipo GG, demostró una mayor expresión de
ATP5C1
en 10p14 (
q
-valor = 0,004). Del mismo modo, para las muestras tumorales de pacientes con una o dos copias del alelo menor (s) (cualquier C) en rs4444235 (14q22.2), expresión de
DLGAP5
se aumentó en comparación con los tumores con el TT genotipo (
q
-valor = 0,032). No hubo diferencia estadísticamente significativa en la expresión de
NOL3
y
DDX28
en el tumor o tejido normal adyacente al comparar pacientes con una o dos copias del alelo menor (s) (A) versus aquellos con el genotipo GG para rs9929218 en 16q22.1 (Tabla 2).
los cuatro genes que hemos identificado que se expresa de forma diferente en relación con las tres variantes de riesgo han demostrado tener un papel en el cáncer-relacionada mecanismos, tales como el metabolismo y la proliferación celular y la apoptosis [26], [27], [28], [29]. Por lo tanto, se compararon los niveles de expresión de los cuatro
cis
genes -regulated (
ATP5C1
,
DLGAP5
,
DDX28
,
NOL3
) entre tumores y tejido de colon normal adyacente. Los cuatro genes fueron expresados diferencialmente en los tumores en comparación con las muestras de tejido de colon normales adyacentes. El nivel de expresión de
ATP5C1 gratis (
p-valor = 0,005
) fue menor en los tumores, mientras que los niveles de expresión de
DLGAP5
(
p CD - valor = 7,80 × 10
-7),
DDX28 gratis (
p-valor = 0,016
) y
NOL3 gratis (
p-valor
0,044) fueron mayores en los tumores de colon en comparación con tejido normal adyacente (Figura 2).
Los diagramas de caja de los niveles de expresión de genes para
ATP5C1
,
DLGAP5
,
NOL3
,
y DDX28 Hoteles en emparejados tejido tejido del colon y el tumor de colon normal adyacente (n = 40 pares). El significado de la expresión diferencial se indica mediante el
p-valor
.
Para confirmar la fiabilidad de los resultados de microarrays, se realizó una validación técnica usando ensayos de qPCR de los niveles de expresión génica en 20 casos con el resto de RNA, de los 40 casos originales, tanto para las muestras de tejidos normales y tumorales adyacentes. coeficientes de correlación de rangos de Spearman orden de la de los cuatro genes identificados en el
cis
-eQTL análisis en el tipo de tejido (tumor o normal) donde se observó la expresión diferencial genotipo específico eran,
ATP5C1 r
s
= 0,39;
DLGAP5 r
s
= 0,68;
NOL3 r
s
= 0,11;
DDX28 r
s
= 0,22. Como un paso de validación técnica adicional, que ensayaron cuatro genes (
APC
,
MACC1
,
DCC
, y
DSC2
) que se han establecido previamente que se expresó diferencialmente entre el tumor y el tejido normal adyacente en el cáncer colorrectal [30], [31], [32], [33]. Encontramos una buena correlación (correlación de Spearman orden jerárquico,
r
s Hotel & gt; 0,5) en los perfiles de expresión génica para los cuatro genes entre nuestra microarrays y qPCR ensayos. En concreto, una menor expresión de
APC
,
DCC
, y
DSC2
y una mayor expresión de
MACC1
se observó en las muestras tumorales en relación con el emparejado el tejido normal adyacente, tanto en el microarray y qPCR ensayos. Estos datos apoyan la validación técnica fiabilidad de nuestras observaciones sobre la base de los resultados de microarrays de expresión génica.
Discusión
Nuestro estudio examinó 18 de las variantes de riesgo de cáncer colorrectal identificadas GWAS-19 para la asociación con la expresión de los genes vecinos (a menos de 2 Mb arriba y aguas abajo de la SNP) en 40 pacientes con cáncer de colon y MSS CIMP-negativo, usando muestras de tumores de colon normal y adyacentes fresco-congelado emparejado (Figura S1). Se identificaron cuatro genes (
ATP5C1
,
DLGAP5
,
NOL3
, y
DDX28
) en tres loci de riesgo con una diferencia estadísticamente significativa en la expresión génica los niveles de genotipo.
ATP5C1
codifica la subunidad gamma del núcleo catalítico (F1) de la ATP sintasa mitocondrial, el complejo de enzimas responsables de la síntesis de ATP, sabe que juega un papel central en celular respiración. Un evento común en las células tumorales es el interruptor metabólico de la respiración (en la mitocondria) de la glucólisis (en el citosol), a menudo referido como "el efecto Warburg" [34], [35]. Múltiples mecanismos pueden iniciar este interruptor, una de las cuales es una disminución en la expresión de la subunidad beta de la ATP sintasa (F1) (
ATP5B
), que conduce a la interrupción de la función catalítica del complejo ATP sintasa, un evento que se ha observado previamente en múltiples tipos de cáncer [26], [29]. En las muestras de tumores analizados en el presente estudio, se observó un aumento en los niveles de expresión de
ATP5C1 Windows que se asoció significativamente con el alelo A en rs10795668. El alelo A se ha asociado con un menor riesgo de cáncer colorrectal (OR = 0,89;
p
= 2,5 × 10
-13) en un GWAS anterior [6]. Por lo tanto, el aumento de expresión de
ATP5C1
asociado con el alelo A sería coherente con el mantenimiento de la actividad de la ATP sintasa y la respiración celular y potencialmente la inhibición de la progresión del tumor para el cáncer colorrectal.
DLGAP5
, también conocido como
HURP gratis (hepatoma hasta reguladas proteína), codifica una proteína de unión a los microtúbulos involucrados en la formación y función de los husos mitóticos [36], [37] y se cree que es una célula regulador del ciclo y el destino de la Aurora quinasa A [38], [39]. La sobreexpresión de la
DLGAP5
se ha asociado con la desregulación de la formación de las fibras del huso durante la mitosis y la función [38]. Además, se ha informado de que
DLGAP5
puede tener un papel en el vástago de mantenimiento y la supervivencia celular y se ha observado que se sobre-expresado en células de cáncer de colon [27], [28], [40]. El alelo C de rs4444235 se ha informado anteriormente en GWAS a aumentar el riesgo de cáncer colorrectal (OR = 1,11;
p
= 8,1 × 10
-10) [3]. Nuestra conclusión de que el alelo C se asocia con un aumento de
DLGAP5
expresión en tumores, sugiere un posible mecanismo por el cual este alelo puede promover la progresión tumoral para el cáncer colorrectal. Además, observamos que rs4444235 se ha demostrado que tienen una asociación significativamente más fuerte con MSS-subtipos de cáncer colorrectal [3], que fue el subtipo molecular de las muestras tumorales incluidas en nuestro estudio.
DDX28
codifica para una proteína con actividad de caja DEAD ARN helicasa. Aunque
DDX28
específicamente no se ha informado que tienen un papel en el cáncer colorrectal, otros RNA helicases caja DEAD se ha demostrado que se sobreexpresa en los tumores de colon, lo que demuestra una función para RNA helicases en la tumorigénesis [41], [42 ], [43]. La
NOL3
gen, también conocido como ARC (represor apoptosis con el dominio de reclutamiento de caspasas) codifica para una proteína anti-apoptótica que regula p53 y las caspasas 2 y 8 [44], [45]. Varios estudios han demostrado que
NOL3
está regulada por N- activado y H- Ras y se sobreexpresa en el cáncer de colon [41], [46], [47]. También observamos
NOL3
que se sobreexpresa en el tumor en comparación con el tejido normal adyacente. Además, nuestro
cis
-eQTL análisis indicó una asociación para la disminución de la expresión de ambos
DDX28
y
NOL3 Hoteles en tejidos de colon normales adyacentes de individuos portadores del alelo A, en particular casos con el genotipo GA para rs9929218. Tomados en conjunto con el hallazgo de que el alelo A en rs9929218 se asocia con un menor riesgo de cáncer colorrectal (OR = 0,91;
p
= 1.2 × 10
-8) [3], nuestra observación de una asociación entre este alelo y la disminución de
DDX28
y
NOL3
expresión en tejido normal adyacente sugiere que estos genes pueden reducir el riesgo de los cánceres colorrectales al funcionar para inhibir los eventos tempranos de la carcinogénesis colorrectal. Nuestros hallazgos también pueden subrayar la importancia de estudiar el tejido normal, además de tejido tumoral, en los estudios de cáncer eQTL
.
Curiosamente, los genes expresados diferencialmente identificados en este estudio no eran directamente los genes vecinos las variantes de riesgo GWAS. Por ejemplo, para rs10795668,
GATA3
es el gen vecino más cercano, pero no observó ninguna asociación significativa de la expresión diferencial de los
GATA3
y el genotipo de este SNP (
p
-valor & gt; 0,05). Del mismo modo, para rs4444235 y
BMP4
, que están separadas por menos de 10 kb, y para rs9929218 que se encuentra en un intrón de
CDH1
, se observó ninguna asociación con el genotipo y la expresión génica. En un estudio reciente, Carvajal-Carmona et al. informaron en un estudio de mapeo fino para los alelos de riesgo de cáncer colorrectal en 8q23.3 y 16q22.1 [48]. También encontraron ninguna asociación con la expresión génica del gen cercano, como
eIF3h
y
CDH1 Hoteles en líneas celulares de monocitos, respectivamente, pero encontró una asociación con los genes más distantes como
UTP23 Opiniones de rs16892766 en 8q23.3 y
ZFP90 Opiniones de rs2059254 en 16q22.1 [48]. En nuestro estudio de muestras de tejido de colon, también se observó una asociación (
p
= 0,03) para los
ZFP90
niveles de expresión y el alelo de riesgo en 16q22.1 (Tabla S1); sin embargo, la asociación ya no fue significativa después de los ajustes para comparaciones múltiples. Estos resultados y los de otros estudios [3], [12], [15], [49], sugieren que las variantes de riesgo no podrán regular preferentemente los genes que están más cerca. Por el contrario, los mecanismos de regulación transcripcional afectadas por el estado alélico pueden implicar estados de confirmación de la cromatina complejos y funcionar dentro de un contexto específico de tejido
.
Pocos estudios han examinado la relación entre las variantes de riesgo de cáncer colorrectal y la expresión genética en los genes cerca. El estudio investigó COGENT seis variantes de riesgo GWAS por su efecto sobre la expresión de un pequeño número de genes candidatos vecinos en el 90 CEU Hapmap, líneas de células linfoblastoides transformadas con EBV (rs9929218 para
CDH1
y
CDH3
, rs4444235 para
BMP4
, rs10411210 para
RHPN2
, rs961253 para
BMP2
, rs6983267 para
c-MYC
, y rs3802842 para
LOC120376
) [3]. No se encontraron asociaciones significativas. Aunque no estábamos en condiciones de evaluar rs10411210, encontramos parecida ninguna asociación entre las cuatro variantes restantes y la expresión diferencial de estos genes antes o después de la corrección de múltiples ensayos, tanto en el tejido del colon y el tumor adyacente normal (
p-valores
& gt ; 0,05). Además, similar a nuestros hallazgos, un estudio previo de rs6983267 encontró ninguna asociación con
c-MYC
expresión en 117 muestras de tejido de colon normal [50].
Esta es la más completa y uno de los más grandes de tejidos específicos
cis
-eQTL estudios reportados hasta la fecha para el cáncer colorrectal. No obstante, la interpretación de los resultados se ve limitada por nuestro poder estadístico limitado (& lt; 60% para detectar una diferencia del 15% en la expresión a través de genotipos) y la necesidad de estudios de replicación con tamaños de muestra más grandes para confirmar el efecto de estas variantes de riesgo en la regulación la expresión génica de los genes vecinos. Las fortalezas más notables de este estudio fueron la inclusión de ambos tejidos normales y malignos adyacente y la restricción a un grupo homogéneo de tumores colorrectales caracterizadas molecularmente (MSS y CIMP-negativas).
En resumen, nuestros datos indican que es probable que sea altamente informativo el análisis de los efectos de los alelos de riesgo sobre la expresión génica en tumores bien caracterizados y su tejido normal adyacente emparejado. necesitará un nuevo examen de las variantes de riesgo y los genes expresados diferencialmente a ser llevado a cabo para confirmar nuestros resultados, así como la ampliación del análisis a otros subtipos moleculares de cáncer colorrectal y hacer frente a acontecimientos mecanicistas en un contexto específico de tejido
.
La información que sustenta
figura S1. diagrama de flujo de
cis
-eQTL análisis de variantes de riesgo de cáncer colorrectal. El diagrama de flujo muestra los procedimientos para analizar los efectos de alelos de riesgo sobre la expresión génica, de los genes dentro de un rango de 4 Mb de alelo de riesgo, en bien caracterizado tumores colorrectales y su tejido normal adyacente emparejado
doi:. 10.1371 /journal.pone.0030477.s001 gratis (TIF)
Tabla S1.
diferencialmente expresado genes asociados con variantes de riesgo para el cáncer colorrectal. Una lista de los 50 genes que fueron identificados para ser expresadas diferencialmente por el genotipo para 11 de los 18 variantes de riesgo estudiados (
p-valores
& lt; 0,05) en el análisis de 40 pares de tumor colorrectal MSS y CIMP-negativo y tejidos normales adyacentes
doi: 10.1371. /journal.pone.0030477.s002 gratis (PDF)
Reconocimientos
El contenido de este manuscrito no refleja necesariamente las opiniones o políticas del Instituto Nacional del cáncer o cualquiera de los centros colaboradores en las tasas de letalidad, ni la mención de marcas registradas, productos comerciales u organizaciones no implica aprobación por parte del gobierno de Estados Unidos o el CFR. También se agradece a los participantes en el Registro de colon de la familia que han contribuido a una mejor comprensión de la contribución genética al cáncer de colon. También nos gustaría dar las gracias al Programa de Investigación del Cáncer de Affymetrix y los Dres. Gordon Okimoto y Hansong Wang para la orientación analítica.