Extracto
Antecedentes
cáncer epitelial de ovario es la principal causa de muerte por cáncer ginecológico. La mayoría de los pacientes responden inicialmente a la quimioterapia basada en platino después de la cirugía reductora, sin embargo, la recaída es muy común y en última instancia, emerge de resistencia de platino. La comprensión del mecanismo de crecimiento tumoral, metástasis y la recaída resistente a los medicamentos tendrá un impacto profundamente el manejo terapéutico del cáncer de ovario.
Métodos /Principales conclusiones
El uso de microarrays de tejido del paciente (TMA),
In Opiniones y vitro
in vivo
estudios Presentamos un papel de de cistationina-beta-sintasa (CBS), una enzima del metabolismo de azufre en el carcinoma de ovario. Presentamos aquí que la expresión de cistationina-beta-sintasa (CBS), una enzima de metabolismo del azufre, es común en el carcinoma de ovario seroso primario. El
in vitro
efectos de CBS silenciamiento puede ser revertida mediante la suplementación exógena con el GSH y H
2S producción química Na
2S. Silenciando CBS en un modelo ortotópico cisplatino resistentes
in vivo fotos: por la entrega de CBS nanoliposomal siRNA inhibe el crecimiento del tumor, reduce la formación de nódulos y sensibiliza a las células de cáncer de ovario con el cisplatino. Los efectos fueron corroborados adicionalmente por inmunohistoquímica que demuestra una reducción de H & amp; E, Ki-67 y las células CD31 positivas en si-RNA tratado en comparación con los animales tratados con ARN codificado. Por otra parte, la CBS también regula la bioenergética de las células de cáncer de ovario mediante la regulación de la producción de ROS mitocondrial, consumo de oxígeno y la generación de ATP. Este estudio reporta un papel importante de la CBS en la promoción del crecimiento del tumor de ovario y el mantenimiento de fenotipo resistente a los medicamentos mediante el control de comportamiento redox celular y la regulación bioenergética mitocondrial.
Conclusión
La presente investigación pone de relieve la CBS como un potencial terapéutico objetivo en el cáncer de ovario resistente al platino en recaída y
Visto:. Bhattacharyya S, Saha S, K Giri, Lanza IR, Nair KS, Jennings NB, et al. (2013) cistationina beta-sintasa (CBS) Contribuye a avanzado de ovario progresión del cáncer y la resistencia a medicamentos. PLoS ONE 8 (11): e79167. doi: 10.1371 /journal.pone.0079167
Editor: Soumitro Pal, el Hospital de Niños de Boston & amp; Escuela de Medicina de Harvard, Estados Unidos de América
Recibido: 30 Agosto, 2013; Aceptado: 18 Septiembre 2013; Publicado: 13 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Bhattacharyya et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud (NIH) CA135011 y CA136494 (PM), CA 157481 (RB), CA148747 (WC) y el Programa de cáncer de la Clínica Mayo de la Mujer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En los últimos años la gasotransmitter H
2S ha ganado gran importancia que van desde procariotas a vertebrar la biología y la ampliación [1] - [6]. En un artículo seminal, Roth et al. demostró que el tratamiento previo con H
2S impedido lesión hipóxica en ratones mediante la reducción drástica de la temperatura corporal central de los animales y el metabolismo, similar a lo que se observa en hibernación mamíferos [7]. Sin embargo, otro artículo demostró que las enzimas pérdida de H
2S sintetizan sensibilizados una gran cantidad de bacterias que causan enfermedades a los antibióticos principalmente a través de un aumento del estrés oxidativo [8]. Sin embargo, el papel de las enzimas metabólicas que sintetizan H
2S no se ha descrito en la biología del cáncer sigue siendo objeto de investigación.
En los seres humanos, dos principales enzimas metabólicas sintetizan H
2S, cistationina beta-sintasa (CBS ) localizada principalmente en el cerebro y los tejidos del hígado y cistationina liasa gamma (CSE /CTH) se encuentra principalmente en tejidos musculares [9]. CBS es la primera enzima limitante de la velocidad en la vía de transulfuración y mediante la utilización de homocisteína (Hcy) produce H
2S y el precursor de cisteína cistationina [10]. Además de la captación celular de la cistina, la síntesis de cisteína es el paso limitante de la velocidad para la producción de glutatión (GSH), el antioxidante ubicua. Los estudios que utilizan ratones desmontables CBS han subrayado la importancia de esta enzima en los trastornos cardiovasculares y neurovasculares, causando principalmente la disfunción endotelial, que se cree que es debido a los niveles de homocisteína en plasma mejoradas [11] - [13]. Sin embargo, la suplementación con vitamina B
12 y ácido fólico (que facilitan la remetilación de la Hcy a metionina) reduce los niveles circulantes de homocisteína todavía no lograron reducir los síntomas de la enfermedad cardiovascular. Por otro lado, la vitamina B
6, un cofactor para CBS, no logró reducir los niveles circulantes de Hcy en los ensayos clínicos recientes [14], [15]. Estos resultados indican la implicación de otros componentes, además de Hcy, como actores clave en los trastornos mencionados anteriormente.
Teniendo en cuenta la notable acción citoprotectora de H fisiológica
2S y glutatión nos planteamos que las células cancerosas pueden explotar esta única característica de la CBS para producir H
2S cuando están bajo estrés oxidativo o al insulto citotóxico. En este contexto, nos hemos centrado en el cáncer epitelial de ovario, que es la principal causa de muerte por cáncer ginecológico en mujeres. La mayoría de los pacientes responden inicialmente a la quimioterapia basada en platino después de la cirugía reductora, sin embargo, la recaída es muy común y en última instancia, emerge de resistencia de platino. El mecanismo de esta recurrencia y evolución del fenotipo de resistencia a fármacos, sin embargo sigue siendo poco conocida [16], [17]. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer informe que describe un papel para la CBS en el mantenimiento de la salud celular de las células de cáncer de ovario, sintonizando el comportamiento redox celular y la producción de energía mitocondrial. Silenciando CBS inhibe significativamente la proliferación de células de cáncer de ovario, la formación de nódulos metastásicos y los sensibiliza al cisplatino tanto
in vitro Opiniones y en modelos de ratón ortotópico preclínicos
in vivo
. Mecánica, silenciando CBS reduce severamente los niveles de GSH celular, afecta H
producción 2S, activa supresores de tumores tales como p53 y inhibe la activación de NF-kB. CBS co-localiza con los marcadores mitocondriales en las células cancerosas, y silenciar CBS disminuye el consumo de oxígeno mitocondrial con un incremento concomitante en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Estos resultados juntos indican que CBS juega un papel importante en la regulación del equilibrio redox y el metabolismo de las células de cáncer de ovario promover el crecimiento tumoral y la metástasis.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
las muestras de pacientes.
todos los 210 participantes inscritos hasta el 2009, de quien se obtuvo de tejidos para TMA, dieron su consentimiento informado por escrito de un protocolo aprobado por el IRB (09-008365) y los datos clínicos fue extraída para todos los casos. Todos los estudios fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Clínica Mayo (Protocolo#09-008365).
Los experimentos con animales.
ratones desnudos atímicos hembra (NCR-nu) se adquirieron en el Instituto Nacional del Cáncer Centro para el Desarrollo (Frederick, MD) -Frederick Investigación del cáncer y. Todos los ratones fueron alojados y mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos en instalaciones aprobadas por la Asociación Americana para la Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio (ACUF#01-12-01531) y de acuerdo con las regulaciones y normas del Departamento de Agricultura, US Estados Unidos actuales Departamento de Salud y Servicios Humanos, y los NIH. Todos los estudios fueron aprobados por la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center de Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión.
Reactivos
Los detalles de todos los reactivos utilizados están dentro de
Archivo S1.
OV167 y OV202 (obtenido de V. Sridhar, Clínica Mayo) líneas de células se cultivaron en MEM y DMEM suplementado, respectivamente, con 10% de FBS y 1% de antibiótico (penicilina /estreptomicina). OVCAR-5 era de ATCC y se cultivaron en DMEM con suero bovino fetal al 10% y 1% de antibiótico (penicilina /estreptomicina). Las células A2780 (Sigma-Aldrich) se cultivaron en RPMI con FBS al 10% y 1% de antibióticos (penicilina /estreptomicina) de acuerdo con la recomendación del proveedor. OVCAR-5 células se cultivaron en DMEM de alta glucosa con FBS al 10%, L-glutamina y NEAA. OSE (TST) las células fueron cultivadas en medios MCDB105 con 15% de FBS y 1% de higromicina. Los /CP 70 líneas A2780 celulares se cultivaron de acuerdo con nuestros procedimientos publicados previamente [18]. línea celular SKOV3 de ATCC y SKOV3-ip del laboratorio de V. Sridhar (Clínica Mayo) se cultivaron en un medio de McCoy 5A suplementado con FBS al 10% y 1% de antibiótico.
Participantes en el estudio y la construcción de microarrays de tejidos (TMA)
TMA se crea a partir de tumores fijados con formalina e incluidos en parafina de 210 casos de la clínica Mayo matriculados hasta diciembre de 2009. Todos los participantes por resumieron consentimiento informado por escrito de un protocolo aprobado por el IRB (09-008365) y los datos clínicos para todos los casos. Todos los estudios fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Clínica Mayo (Protocolo#09-008365).
se utiliza un sistema automatizado de Beecher Instrumentos ATA-27 arrayer siguiente revisión patólogo que indica la localización del tumor. Tres núcleos de 0,6 mm se retiraron de cada bloque caso de parafina y se colocan en un bloque de parafina receptor de acuerdo con un mapa electrónico TMA aleatorizado. bloques receptores se cortaron en secciones de 5 micras y se montaron en portaobjetos cargados.
Anticuerpo, inmunohistoquímica y la puntuación de
TMA tinción se realizó en el centro de tinción automático Leica sobre bonos con polímero de unión kit de detección de refinar (catálogo#DS9800, Leica Microsystems). Las láminas fueron expuestos a anticuerpo primario que reconoce la CBS (1:1000, A01 policlonal, Abnova), después de la optimización de las condiciones de tinción de tejidos de control positivo (tumores de células granulosas). Los controles negativos incluyeron un partido de isotipo no específica y los sueros de ratón negativo (1:500); Los portaobjetos se obtuvo de forma independiente por 2 autores (RB y EB), y las discrepancias se resolvieron por un patólogo ginecológica (
Archivo S1
).
La transfección y se transfectaron de derribo
Las células con el control de siRNA o revueltos CBS siRNA (siRNA Hs_CBS_5 FlexiTube (SI02777159, QIAGEN) /SASI_Hs01_00214623 (Sigma)) por el agente de transfección HiPerFect® en suspensión con una ligera modificación del protocolo del fabricante (
archivo
S1).
lisis celular y Western Blot
La lisis celular y Western Blot se llevó a cabo según el procedimiento ya publicado [19]. Los anticuerpos primarios se utilizaron a una concentración de la siguiente manera: CBS (1:1000 dilución), anticuerpo CSE (1:1000), α-tubulina (1:2000), β-actina (1:1000 dilución), NF-kB p65 (1:1000 dilución) y el anticuerpo p53 (1:200 dilución).
PCR en tiempo real
El ARN total fue aislado de las células transfectadas utilizando RNeasy Mini kit Plus (QIAGEN). El ARN se retrotranscribió primero utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad) y luego en tiempo real PCR se realizó utilizando TaqMan® SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems). Los cebadores para la CBS humana (PPH13484B-200) y la beta actina (ACTB PPH00073G-200) fueron de QIAGEN. Para CSE, cebadores diseñados a medida se utilizaron (Forward: CAGCCTTCAATGTCAATCACC: CAGCAATTACACCAGAAACCAAG y retroceso). La C
t método comparativo se utilizó para calcular la abundancia relativa de ARNm y se compara con el de la expresión de beta actina [20]. Los experimentos se llevaron a cabo tres veces por triplicado.
Ensayo de proliferación celular
células de cáncer de ovario transfectadas se recogieron por tripsinización, contadas sembradas en 24-wellplates (4 × 10
4 por pocillo) y cultivaron durante 24 h y el ensayo de timidina (3H) llevó a cabo [21] (
archivo
S1).
la homocisteína (Hcy) Medición
niveles de homocisteína como se ha descrito anteriormente en el Los lisados celulares de células A2780 tratados Sc-siRNA y CBS siRNA se determinaron 48 horas después de la transfección mediante cromatografía líquida espectrometría de masas (LC /MS /MS) (
archivo S1
).
La homocisteína Sobredosis experimento
Aproximadamente, 10
4 A2780, OSE células o SKOV3-ip por pocillo se sembraron en una placa de 96 pocillos con los respectivos medios de cultivo de crecimiento. Después de 24 h, se añadieron diversas concentraciones de Hcy disueltos en medios de cultivo de crecimiento a las células y se incubaron durante 24 h en un CO
2 incubadora. 24 h post-tratamiento, la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTS como se mencionó anteriormente.
H
2S Medición
H
2S concentraciones de no tratada o tratada AOAA células de cáncer de ovario se midieron después de una literatura informado protocolo con modificaciones menores [22]. El H
2S concentración de cada muestra se calculó frente a una curva de calibración de Na
2S.
H
2S Rescate Experimento
A2780 células fueron transfectadas con siRNA control mezclado o control CBS siRNA como se mencionó anteriormente. 48 h después de la transfección, las células se recogieron por tripsinización y 10
4 células /pocillo se sembraron en una placa de 96 pocillos. Después de 12 h, se añadieron diversas concentraciones de Na
2S disueltos en RPMI-FBS al 10% a las células y se incubaron durante 24 h en un CO
2 incubadora. Después de 24 h, la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTS como se mencionó anteriormente.
GSH Ensayo
El ensayo se realizó según el protocolo del fabricante (Cayman Chemicals). Brevemente, las líneas celulares de cáncer de ovario se transfectaron con el control mezclado o CBS siRNA en placas de cultivo de 60 mm como se mencionó anteriormente. Después de 48 h, las células se rasparon y se recogieron en 50 mM MES pH 6,0 y se lisaron por sonicación a 4 ° C. El lisado se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 min a 4 ° C y se recogió el sobrenadante claro (es decir lisado celular). El lisado se de-proteinated usando el reactivo de equipo y el GSH celular total determinada frente a una curva estándar generada de forma simultánea mediante la medición de la absorbancia a 405 nm durante 25 minutos después de la adición de cóctel de ensayo. El experimento se realizó por triplicado y significación determinada usando la prueba t de dos lados de Student, P £ 0,05 fue considerado significativo.
GSH Experimento de rescate
A2780 células fueron transfectadas con siRNA control mezclado o el control de la CBS siRNA como se mencionó anteriormente. Mensaje 48 h de la transfección, las células se recogieron por tripsinización y 10
4 células /pocillo se sembraron en una placa de 96 pocillos. Después de 12 h, se añadieron diversas concentraciones de glutatión reducido disuelto en RPMI-FBS al 10% a las células y se incubaron durante 24 h en un CO
2 incubadora. Mensaje 24 h de tratamiento, la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTS con Cell Titer 96® (Promega) según el protocolo del fabricante. La viabilidad celular se expresa como una relación de porcentaje de la absorbancia de las células tratadas con los controles no tratados.
ROS Ensayo
El ensayo ROS se llevó a cabo en las células A2780 48 h post-transfección con revueltos control o CBS siRNA después de una modificación de un procedimiento previamente publicado usando citometría de flujo [23] (
archivo
S1).
Luciferase reportero de ensayo
Aproximadamente, 2 × 10
4 número de células A2780 se sembraron por pocillo de placa de 96 pocillos, el día antes de la transfección. El día siguiente las células se transfectaron con una mezcla de NF-kappa B impulsado plásmido de luciferasa de luciérnaga (100 ng), renilla plásmido de luciferasa (50 ng) y siRNA (200 nM) por pocillo usando Lipofectamine y Plus reactivo (Invitrogen) según el protocolo del fabricante . Mensaje 48 h de la transfección, los medios de cultivo se descarta y se ensayaron para la actividad de luciferasa de luciérnaga y la actividad luciferasa de Renilla utilizando el Sistema Dual Glo Luciferase Assay (Promega) según el método del fabricante. La relación de la actividad de luciferasa de luciérnaga a Renilla continuación, se calculó la actividad de luciferasa se mide por luminiscencia y los datos se normalizaron. El experimento se realizó por triplicado y significación determinada usando la prueba t de Student bilateral, P £ 0,05 fue considerado significativo.
Microscopía Confocal
La localización de la CBS se determinó por inmunotinción seguido por microscopía confocal. Aproximadamente, se sembraron 1,5 x 10
3 células por cámara de un portaobjetos de 4 con cámaras. Después de 12 h, las células fueron tratadas con 200 nM Mitotracker Green (Invitrogen) durante 30 min a 37 ° C en medio completo fija con 4% PFA, permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 en PBS, se bloquearon con BSA al 4% en PBS, teñido con anticuerpo CBS primario (dilución 1:100) en 1% BSA-PBS, se bloquearon con suero de cabra al 5% en 1% BSA-PBS y se tiñeron con anticuerpo de cabra marcado con Cy3 anti-anticuerpo secundario de conejo. Las células se lavaron 3 x 3 min con PBS después de cada paso durante la inmunotinción. Las imágenes fueron adquiridas mediante microscopio Zeiss LSM510 y procesados usando ImageJ (NIH).
Los experimentos consumo de oxígeno
de alta resolución respirometría (Oxygraph, Oroboros Instruments, Innsbruk, AT) se utilizó para medir el oxígeno las tasas de consumo en células intactas [24]. Se utilizó el software DatLab (Oroboros Instruments, Innsbruk AT) para determinar O
2 de flujo bajo tratamiento AOAA aguda y en siRNA células tratadas A2780. las velocidades de flujo de oxígeno se expresaron por millón de células
(Archivo S1).
mitocondrial ROS producción
niveles de ROS mitocondrial se determinaron en el control revueltos siRNA y CBS siRNA células tratadas 48 h post-transfección mediante tinción MitoSOX (Invitrogen) se llevó a cabo según el protocolo literatura [25]
(detallado en S1 archivo)
.
de la citrato sintasa (CS) Actividad
se midió espectrofotométricamente la actividad de CS en los extractos celulares totales de células A2780 después del tratamiento con diferentes dosis de AOAA de 3 h después de un método publicado literatura [26].
NAD /NADH Ratio Medición
relación /NADH NAD se midió utilizando Abcam NAD /NADH Kit de ensayo (ab65348) en lisados de células enteras de acuerdo con el protocolo de los fabricantes (los datos de
archivo S1
).
ATP y ADP total /relación ATP
niveles totales de ATP en CBS silenciados células A2780 y AOAA tratadas se midieron las células A2780 usando Sigma adenosina 5'-trifosfato (ATP) bioluminiscente Assay Kit (FLAA) y ADP /ATP relación se midió usando ADP de Abcam /kit de ensayo de relación de ATP según los protocolos de los fabricantes. protocolo detallado en
Archivo S1.
liposomal siRNA Preparación
En
in vivo
entrega, siRNA se incorporó en DOPC como se describe anteriormente [18]. Para más detalles ver
S1 Archivo.
modelo ortotópico de cáncer de ovario
Antes de la inyección de las células tumorales en los ratones (8-12 semanas de edad), las células se lavaron dos veces con PBS, individual por 0,1% de EDTA frío, se centrifuga durante 7 min, y se reconstituyó en HBSS (Invitrogen). La viabilidad celular se confirmó mediante exclusión con azul de tripano. Los tumores se establecieron mediante inyección i.p. la inyección de 1,0 × 10
6A2780 células /CP20. Una vez establecido, este modelo de tumor refleja el patrón de crecimiento de cáncer de ovario avanzado [27]. Para evaluar los efectos de la terapia de siRNA en el crecimiento del tumor, el tratamiento se inició después de 1 semana i.p. la inyección de las células tumorales. Los individuos que hicieron las necropsias, colecciones de tumores, y el procesamiento de tejidos fueron cegados a las asignaciones a los grupos de tratamiento (Archivo S1).
La inmunohistoquímica de muestras tumorales
octubre muestras tumorales congeladas se seccionaron y se tiñeron para H & amp; E, Ki-67 (MIB-1, Dako, M7240) o CD31 (PECAM-1, SantaCruz, sc-1506-R) como se describe anteriormente [28]. (S1 Archivo).
Análisis estadístico
Todos los resultados se muestran como media +/- S.D.. La significación estadística se determinó usando la prueba t de Student de dos colas, y un valor de P £ 0,05 (*) fue considerado significativo y p≤0.01 como altamente significativa (**). Para la comparación entre varios grupos, se utilizó un modelo lineal (Archivo S1).
Resultados
CBS se sobreexpresa en cáncer ovárico epitelial primaria y líneas celulares de cáncer de ovario
Tejido los estudios de distribución en humanos han revelado que el hígado y el páncreas tienen la más alta expresión del ARNm de la CBS con alguna expresión en el cerebro y el riñón [29]. En modelos murinos, CBS se ha sugerido que participan en el desarrollo de los ovocitos y
CBS
- /- ratones sufren de disfunción uterina [11], [30]. Para entender el papel de la CBS en el cáncer de ovario humano, se evaluó el nivel de expresión de la CBS en muestras de cáncer de ovario primario y su relación con factores quirúrgicos patológicos. Utilizando una serie de microarrays de tejidos (TMA) construidos a partir de los cánceres ováricos epiteliales primarias se identificaron 210 casos con tinción evaluables mediante TMA. Encontramos expresión de CBS a ser común en el citosol de los tumores primarios de ovario, particularmente en el carcinoma seroso, la variante histológica más común. La Tabla 1 resume los factores demográficos, clínicos e histológicos que fueron evaluados por una asociación de moderada a fuerte expresión CBS (Tabla 1). Brevemente, moderada fuerte expresión se asoció con la histología serosa (69,8% vs. 41,0% vs. serosa nonserous, p & lt; 0,001) y los cánceres de grado más alto (64,7% vs. 31,6%, grado 3 o 4 grado vs. 1 o 2, p = 0,005) (Fig. 1A). Aunque estadísticamente significativamente diferentes a través de las etapas, la expresión todavía estaba presente en el 35% de los tumores en fase inicial. Al considerar sólo los 149 casos serosas en la cohorte más amplia, la expresión fue de moderada a fuerte en 8/11 etapa temprana (FIGO etapas I y II) tipos de cáncer, lo que sugiere que la expresión de CBS es una característica relativamente temprana de los cánceres de ovario seroso. Habiendo demostrado la expresión de CBS en los tejidos tumorales humanos, se comparó la expresión de CBS en ovárica normal vs. líneas celulares de cáncer. Empleamos cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR) e inmunotransferencia para evaluar la expresión de CBS en el ARNm y los niveles de proteína, respectivamente (Fig. 1B-D). Tanto en el ARNm y el nivel de proteínas, mínima o ninguna expresión de la CBS se observó en la línea de células epiteliales de la superficie del ovario no maligno (OSE). Sin embargo 4 de cada 6 líneas celulares de cáncer expresan significativamente alta CBS tanto a la proteína y el ARNm. Curiosamente, se observó expresión de CSE en líneas celulares que expresaban poco o nada de CBS incluyendo OSE, lo que sugiere una correlación inversa entre las expresiones de las dos enzimas (Fig. 1B). Después de haber confirmado que la CBS se expresa tanto en líneas celulares y en los cánceres de ovario primario A continuación trató de examinar la importancia funcional de la CBS
.
(A) tinción inmunohistoquímica de un microarray de tejido de muestras epiteliales de cáncer de ovario. Se muestran imágenes representativas de ninguna (i), débil (ii), moderada (iii) y (iv) una fuerte tinción. (B) Expresión de CBS y CSE en diversas líneas celulares de ovario tal como se determina por inmunotransferencia. α-tubulina se utilizó como control de carga. datos (C) RT-PCR que muestra la expresión de ARNm de CBS en diversas líneas celulares de ovario. datos (D) RT-PCR que muestra la expresión de mRNA CSE en diversas líneas celulares de ovario. (E) Efecto de la CBS caída en la proliferación de datos (F) Immunoblotting OV202, SKOV3, A2780 y A2780 /células CP-70 y para determinar el grado de caída mediada por siRNA. (G) Efecto de la inhibición de la CSB sobre la proliferación de OV202, SKOV3 y células A2780 por AOAA (tratamiento de 24 h) determinado a través de ensayo MTS.
La regulación por disminución de la proliferación celular CBS deteriora
in vitro
para determinar ningún papel para la CBS en la proliferación de células de cáncer de ovario, CBS fue silenciada en el A2780, A2780 /CP-70, las células OV202 y SKOV3 utilizando siRNA CBS-específica. Para descartar la orientación no específica del siRNA, desmontables y la proliferación se evaluó con siRNA de dos fuentes diferentes. Una disminución significativa en la proliferación se observó en todas las líneas celulares de cáncer de ovario estudiados en CBS caída por (
3H) -timidina incorporación (Fig. 1E). knockdown eficiente de CBS (~ 80%) también se confirmó por inmunotransferencia 48 h post-transfección, en comparación con células transfectadas siRNA revueltos (Fig. 1F). Para confirmar aún más los efectos de silenciamiento CBS sobre la viabilidad celular de cáncer de ovario, se utilizó un inhibidor químico específico de CBS, ácido Aminoxyacetic (AOAA) [8]. Viabilidad de A2780, las células OV202 y SKOV3, tratados con diferentes concentraciones de AOAA durante 24 h se evaluaron mediante el ensayo de MTS. La viabilidad celular se redujo drásticamente hasta 50% a ~ 7 concentración AOAA mM con nuevos descensos dependientes de la dosis hasta que por la concentración ~ 10 mM para las células A2780 y SKOV3 mientras que en OV202 el efecto fue menos pronunciada (Fig. 1G). Estos datos sugieren que un límite umbral para la actividad CBS existe lo que se requiere para sostener la proliferación de células de cáncer de ovario.
regulación a la baja de los niveles de CBS Altera antioxidante, disparadores apoptótica Cascadas y mejora la sensibilidad de drogas
La salida de CBS inhibe reacciones en la célula podría ser, a) una acumulación de homocisteína b) disminuyó H
2S yc) disminuyó cistationina, el precursor de GSH. Por lo tanto, primero a prueba si la Hcy fue un factor causal de la disminución de la proliferación (2A Fig. B). Se complementó el medio de cultivo con concentraciones crecientes de Hcy y entonces determinada viabilidad de OSE y las células de cáncer de ovario (SKOV3 en IP y A2780) usando el ensayo de MTS. El aumento de los niveles de homocisteína no tuvieron impacto en la viabilidad de cualquiera de las células de la prueba por lo tanto indican que la disminución de los niveles de H
2S o cistationina probablemente eran responsables de la reducción de la proliferación (Fig. 2B). Además, no se observaron diferencias significativas en los niveles de homocisteína celulares tal como se mide por espectrometría de masas en CBS caída en las células A2780, además de descartar un papel de Hcy en la causa de reducción de la proliferación (Fig. 2A). Sin embargo, la falta de diferencias significativas en los niveles de homocisteína podría ser debido a la Hcy puede someterse a una rápida conversión de metionina por la metionina sintasa o pueden ser utilizados por el CSE para producir H
2S pero no cistationina [31].
(A ) Cambio en los niveles de homocisteína en los lisados celulares de células A2780 tratado Sc-siRNA y CBS siRNA medidas por espectrometría de masas. (B) experimento sobredosis Hcy para demostrar el efecto de Hcy (24 h de tratamiento) sobre la proliferación de OSE, A2780 y células SKOV3-IP mediante el ensayo de MTS. (C) H
niveles 2S en OV202, SKOV3 y células A2780 después de la inhibición crónica con diferentes dosis de AOAA para 3 h. (D) Na
2S experimento de rescate después desmontables de CBS en células A2780. Las células se trataron con diferentes dosis de Na
2S durante 24 h y la viabilidad celular se determinó por el ensayo de MTS. (E) Cambio en el nivel de glutatión total de 48 horas después de la transfección con células A2780 control mezclado y CBS siRNA en OV202, y SKOV3. experimento de rescate (F) después de GSH desmontables de CBS en células A2780. Las células fueron tratadas con diferentes dosis de GSH durante 24 h y la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTS.
A continuación se probó la contribución de H
2S en el apoyo a la proliferación de líneas celulares de cáncer de ovario . Una disminución dependiente de la dosis en los niveles intracelulares de H
2S se observó 3 h después de la inhibición de la CBS con diferentes concentraciones de AOAA (Fig. 2C). La disminución general de H
2S niveles de OV202 células fue menos pronunciada que en el A2780 y células SKOV3 que podría ser debido a la existencia de H
2S vía de síntesis alternativa en OV202 células. Estos resultados indican que CBS juega un papel crítico en H
síntesis 2S en estas células de cáncer de ovario. Sin embargo, el papel de la CSE no se puede descartar en este punto, aunque es poco probable ya que la mayoría de las líneas celulares de cáncer de ovario prueba aquí demostró mínima o insignificante expresión del CSE tanto en el mensajero y en el nivel de proteínas. Para confirmar aún más un papel de H
2S Se complementaron los medios de cultivo con concentraciones crecientes de H
donante 2S, sulfuro de sodio (Na
2S) [(32, 33], en revueltos siRNA y CBS siRNA tratados células A2780. en mM Na 5
2S concentración se observó un rescate ~ 20% en la viabilidad celular (Fig. 2D). rescate parcial de la proliferación celular por H
2S en células silenciadas-CBS sugiere que las vías diferentes a H
2S biosíntesis tales como GSH también podría desempeñar un papel importante. por lo tanto, el próximo enfocados en el desciframiento de un papel de GSH en la proliferación de células de cáncer de ovario. silenciamiento CBS disminuyó significativamente los niveles totales de glutatión celular (GSH + GSSG) en células de cáncer de ovario dramáticamente en comparación con las células de control (Fig. 2E). Es importante destacar que se observó un rescate dependiente de la concentración de GSH de la viabilidad celular en CBS silenciados células A2780, con rescate completa a una concentración de 2 mM durante 24 h (Fig. 2F). aumentar simultáneamente en ROS celular se observaron niveles tal como se determina por el H
2carboxy ensayo de fluorescencia DCF en las células A2780 silenciados-CBS (Fig. 3A) que corrobora con la caída de glutatión intracelular en las células totales silenciados-CBS. Estos resultados sugieren que el efecto más significativo de silenciar CBS en las células cancerosas es la inhibición de la maquinaria antioxidante celular. En este sentido, otras dos moléculas, p53 y NF-kappa B se ha demostrado ser notablemente sensible a redox [34] - [38]. De hecho, silenciando CBS en células A2780 expresión de p53 inducida y la disminución de la expresión de la
de RelA
/subunidad p65 de NF-kB (Fig. 3B). De conformidad, la activación de NF-kappa B también se inhibió en casi un 50% en el CBS silenciado células A2780 como se determina por un ensayo de luciferasa promotor que tiene múltiples NF-kappa B (p65 /p50) sitios de unión (Fig. 3C). Sin embargo, un papel más directo para la CBS, además de una mayor ROS en la causa de disminución de la activación de NF-kB también es posible. Desde el glutatión intracelular de ROS y se vieron afectados notablemente en CBS células silenciadas, que próximos a determinar si la combinación con cisplatino mejoraría la eficacia terapéutica [39]. De hecho el tratamiento de células A2780 con cisplatino disminuyó la IC
50 valor de 13,1 mu M en las células transfectadas siRNA de control a 7,9 M en células transfectadas CBS siRNA como se determina por el ensayo de MTS, 24 h de tratamiento post cisplatino (Fig. 3D). Estos datos indican que la CBS actuando a través de glutatión y H
2S puede proporcionar una importante ventaja en la supervivencia de las células cancerosas contra el insulto citotóxico.
(A) Efecto de la CBS desmontables (48 h después de la transfección) sobre el total ROS nivel determinado por el ensayo de DCF y se cuantifica por citometría de flujo. de datos (B) Immunoblotting ejemplificar el efecto de la CBS silenciamiento de la expresión de p53 y p65 de NF-kB en las células A2780. β-actina sirve como control de carga. (C) de ensayo reportero de luciferasa que muestra el efecto de CBS caída en la actividad de NF-kB en las células A2780 transfectadas con luciferasa de la luciérnaga con sitio de unión múltiple NF-kappa B y revueltos ARNsi de control o CBS siRNA.
en peso
-renilla luciferasa se transfectó a normalizar la actividad luciferasa de luciérnaga. (D) CBS silenciamiento aumenta la actividad del cisplatino en las células A2780. El (•) y (О) muestra el efecto del cisplatino sobre el control revueltos siRNA y CBS siRNA células tratadas. La viabilidad celular se determinó después del tratamiento con dosis crecientes de cisplatino durante 24 h a través de ensayo de MTS y de la viabilidad celular se expresó como una relación de porcentaje de células tratadas con los controles no tratados. El IC
50 valores se obtuvieron mediante análisis de regresión no lineal.
Silenciar CBS Reduce mitocondrial Respiración y Inhibe la síntesis de ATP
En un esfuerzo por investigar el papel de la CBS, además de metabolismo de los aminoácidos, se determinó primero la localización celular de la enzima CBS usando inmunofluorescencia.