Extracto
Antecedentes
La vitamina D se sabe que juega un papel importante en prevención de cáncer. Una de las características asociadas con la aparición de malignidad es la elevación de los niveles de Cu (II). El modo de prevención del cáncer mediado por el calcitriol, la forma biológicamente activa de la vitamina D, siguen siendo en gran parte desconocido.
Métodos
El uso exógeno agregado de Cu (II) para estimular una malignidad como una condición en la novedoso sistema celular de linfocitos sobrecargados de calcitriol conejo, se evaluó la peroxidación de lípidos, de carbonilación de proteínas, daño en el ADN y la consiguiente apoptosis. mediadores de radicales libres se identificaron utilizando captadores de radicales libres y el papel de Cu (II) en la reacción fue aclarada usando quelantes de iones metálicos activos redox celular.
Resultados
La peroxidación de lípidos y proteínas de carbonilación ( marcadores de estrés oxidativo), consecuente fragmentación de DNA y la apoptosis se observaron debido a calcitriol-Cu interacción (II). Los radicales hidroxilo, peróxido de hidrógeno y superóxido aniones median el estrés oxidativo producido durante esta interacción. Entre los metales activos redox celular, se encontró que el cobre que es responsable de esta reacción.
Conclusión
Este es el primer informe que implican a Cu (II) y la interacción calcitriol como la causa de la acción citotóxica selectiva de calcitriol contra las células malignas. Se demuestra que esta interacción conduce a la producción de estrés oxidativo debido a la producción de radicales libres y la consecuente fragmentación del ADN, lo que conduce a la apoptosis. Un supuesto mecanismo se presenta para explicar este efecto biológico
Visto:. Rizvi A, Hasan SS, Naseem I (2013) Selectivo citotóxica de acción y el daño del ADN por calcitriol-Cu (II) Interacción: supuesto mecanismo de Prevención del Cáncer . PLoS ONE 8 (9): e76191. doi: 10.1371 /journal.pone.0076191
Editor: Partha Mukhopadhyay, National Institutes of Health, Estados Unidos de América
Recibido: June 9, 2013; Aceptado: 23 Agosto 2013; Publicado: 27 de septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Rizvi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. AR recibida junior Beca de Investigación UGC-CSIR del Gobierno de la India. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
vitamina D
3 se obtiene de los alimentos (productos lácteos fortificados y los aceites de pescado) o se sintetiza en la piel de 7-dehidrocolesterol por irradiación ultravioleta. En el hígado, la vitamina D
3 es hidroxilado en C-25 por la vitamina D de 25 hidroxilasa o el citocromo P450 y forma 25-hidroxivitamina D
3 (25 (OH) D
3). 25 (OH) D
3 se transporta a los riñones, donde en el túbulo renal proximal que es hidroxilado en C-1 resulta en la formación de la actividad hormonal de la vitamina D, 1,25-dihidroxivitamina D
3 (1,25 (OH)
2D
3) o calcitriol, que es un nutriente esencial que media una variedad de procesos metabólicos [1]. Varias líneas de evidencia sobre la base de la farmacología y
in vivo
estudios en modelos animales muestran que el calcitriol es un agente anti-cáncer de
in vivo
[2], que actúa mediante el inicio de la apoptosis y la inhibición del crecimiento de varias líneas de células malignas [3]. Los estudios epidemiológicos muestran que una menor exposición a la luz solar y los consiguientes niveles más bajos de calcitriol aumenta el riesgo de cáncer y mediar en la progresión de varios tipos de cáncer, que incluyen cánceres de mama, ovario, colon, esófago, recto, páncreas y la sangre [4,5]. La amplia variedad de células malignas que responden a la fluctuación de los niveles de calcitriol indica el papel generalizado de calcitriol en la mediación de los efectos anti-cáncer. Sin embargo, aún se desconoce el mecanismo exacto por el que se efectúen los efectos anticancerígenos de calcitriol.
Uno de los rasgos característicos de malignidad es la elevación de los niveles de cobre [6-8]. El cobre es un importante ion metálico encontrado para ser asociado con el ADN de la cromatina, en particular con guanina [9]. Se sabe que en las células malignas, las concentraciones de cobre pueden ser elevados de dos a cinco veces, en comparación con los reportados en las células normales [10]. Aunque la razón exacta de elevación en los niveles de cobre durante la malignidad sigue siendo poco clara, se cree que el aumento de la angiogénesis para ser una posible razón [11].
En este estudio, se propone un vínculo fisiológico entre calcitriol y cobre en las células malignas. Se describe un, Cu (II) inducida, vía mediada por radicales libres putativo, lo que explica la acción citotóxica selectiva de calcitriol contra las células malignas. Para ilustrar la actividad de calcitriol, se ha utilizado un sistema celular de linfocitos de calcitriol sobrecargado (cols). Demostramos que Cols, cuando expuestos a iones Cu (II) para simular el ambiente de una célula maligna, se someten a daño oxidativo y la rotura del ADN, lo que finalmente conduce a la muerte celular. Desde calcitriol, una especie esencialmente hidrófobo, afecta al ADN, una molécula altamente polar, presentamos una hipótesis para explicar la interacción entre calcitriol y el ADN. Sobre la base de mutagénesis, bioquímica y datos relacionados con la estructura [12-18], se discute la posibilidad de que el receptor de vitamina D (VDR) sirve como un "adaptador de proteínas" que media en este proceso. Utilizamos la estructura recientemente dilucidado del VDR y su pareja de unión RXR (receptor X retinoico) [19] para explicar nuestra hipótesis. A lo mejor de nuestro conocimiento, la presente investigación es el primer informe que muestra que el Cu (II) desempeña un papel en la muerte celular mediada por el calcitriol.
Material y Métodos
Productos químicos
Todos los productos químicos y enzimas utilizados se obtuvieron de Sigma Aldrich (EE.UU.). Todas las soluciones se prepararon el mismo día y utilizar inmediatamente.
Declaración Ético de Experimentación Animal
experimentaciones animales se les permitió por el Ministerio de Medio Ambiente y Bosques, Gobierno de la India bajo nº de registro 714/02 /a /CPCSEA emitida por el Comité para los fines de control y supervisión de los experimentos con animales (CPCSEA) del 16 de noviembre de 2002 y aprobado por el comité ético institucional del Departamento de Bioquímica de la Universidad musulmana de Aligarh, Aligarh, India (Nº: DNo1).
Preparación de calcitriol sobrecargado linfocitos (CDA)
Quince conejos albinos machos con un peso de 1 + 0,1 kg fueron comprados y se dividieron aleatoriamente en tres grupos de cinco conejos cada uno. Los conejos fueron alojados en jaulas individuales de acero, y se mantienen en pienso para conejos estándar y agua, siempre
ad libitum
, con 12 h de luz y oscuridad ciclos a 25 ° C. Los animales se aclimataron durante un mes antes de comenzar el experimento. Los animales del grupo uno recibió 200 ng /g de peso corporal de colecalciferol disuelto en 1 ml de etanol, vía intraperitoneal cada día durante un período de dos semanas. Los animales en el grupo dos recibieron inyecciones intraperitoneal de 1 ml de etanol (control del vehículo) y los animales en el grupo tres sirvieron como controles. Después de dos semanas se sacrificaron los animales y se recogió sangre en tubos heparinizados y se diluyeron en fosfato libre de iones de solución salina tamponada (pH 7,0). Los linfocitos se aislaron utilizando Histopaque 1077 y las células se suspendieron en RPMI 1640. linfocitos aislados recientemente se utilizaron para todos los experimentos.
Determinación de los niveles intracelulares calcitriol en COLs
linfocitos aislados se lisaron y la célula lisado se utilizó además para determinar los niveles de calcitriol, utilizando un USCN Life Sciences Inc. (Huston, Texas, EE.UU.) kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Tratamiento de linfocitos
los linfocitos se suspendieron en un volumen total de 3 ml de PBS y se incubó en presencia de Cu (II) (25 mM) durante 2 horas. La reacción también se realizó en presencia de quelantes específicos de iones metálicos. Desferoxamina (50 M) se utilizó para quelar Fe (II) iones, histidina (50 mM) se utilizó para quelar Zn (II) y bathocuprione y neucuprione (50 mM cada uno) fueron utilizados para quelato de Cu extracelular e intracelular (II) iones. eliminadores de radicales libres (catalasa 20 g /ml, la superóxido dismutasa (SOD) 20 g /ml, y tiourea 0,1 mM) se utilizaron en un conjunto separado de reacciones; para implicar el papel de ROS en Cu (II) estrés oxidativo mediado. Igual número de linfocitos (1 x 10
8 + 10
3) se utilizaron en todos los experimentos.
Cu (II) la peroxidación lipídica inducida en Cols
sustancias reactivas
al ácido tiobarbitúrico (TBARS) se estimaron en los linfocitos por el método de Ramanathan et al. [20], con modificaciones menores. Para 1,5 ml mezcla de reacción, 0,5 ml de 10% de TCA (ácido tricloroacético) y 0,5 ml de 0,6 M se añadieron TBA (ácido 2-tiobarbitúrico) y la mezcla se incubó en un baño de agua hirviendo durante 20 minutos. La absorbancia se leyó a 532 nm y se convierte en nano-moles de sustancias reactivas TBA utilizando el coeficiente de extinción molar.
Cu (II) inducida por la proteína de carbonilación en COLs
linfocitos tratadas se lisaron y de la se determinó la cantidad de grupos carbonilo formado [21]. Una mezcla de reacción ml después del tratamiento se mezcló con 0,5 ml de 10 mM de 2,4-dinitrofenilhidrazina en M HCl 2,5. La mezcla se dejó durante 1 hora a temperatura ambiente y se añadió al tubo de 0,5 ml de ácido tricloroacético al 20%. El tubo se dejó en un cubo de hielo durante 10 minutos seguido de centrifugación a 12.000 x g durante 15 min. El sobrenadante se descartó y el sedimento de proteína se lavó con etanol /acetato de etilo (1: 1 v /v) y se disolvió en 2 ml de 6 M de guanidina (pH 2,3) y se agitó. El contenido de carbonilo se calculó utilizando el coeficiente de absorción molar de 22.000 M
-1 cm
-1
Comet, Ensayo (Single Cell alcalina electroforesis en gel) de CDA
ensayo cometa se ha realizado mediante el método empleado por Singh et al. [22], con modificaciones menores. Totalmente diapositivas esmerilado se recubrieron previamente con 1,0% de agarosa de fusión normal. Los linfocitos se mezclaron con 90 l de 1,0% de agarosa de bajo punto de fusión para formar una suspensión de células y se pipeteó sobre la primera capa y se cubrieron con un cubreobjetos. Los portaobjetos se colocaron en bolsas de hielo durante 10 minutos para solidificar la agarosa. Los cubreobjetos se retiraron suavemente y se pipeteó una tercera capa de 0,5% agarosa de bajo punto de fusión. Los portaobjetos se cubrieron con cubreobjetos y se colocaron en bolsas de hielo para solidificar. Los cubreobjetos se retiraron a continuación y los portaobjetos se sumergieron en hielo tampón de lisis frío durante una hora. Después de la lisis, el ADN se le permitió relajarse en solución electroforética alcalina (NaOH 300 mM, EDTA 1 mM, pH & lt; 13). La electroforesis se realizó a 4 ° C, en una intensidad de campo de 0,7 V /cm y 300 mA de corriente. Los portaobjetos se neutralizaron con hielo frío Tris 400 mM (pH 7,5), y se tiñeron con 75 l de bromuro de etidio (20 mg /ml) y se cubrieron con un cubreobjetos. Los portaobjetos se obtuvo usando un sistema de análisis de imágenes (Komet 5.5, Kinetic Imaging, Liverpool, Reino Unido) unido a una Olympus (CX41) microscopio de fluorescencia (Olympus Optical Co, Tokio, Japón) y una cámara de CC integrado COHU 4910 (equipado con 510-560 nm de excitación y 590 nm filtros de barrera) (COHU, San Diego, CA, EE.UU.). Imágenes de 25 células se analizaron desde cada diapositiva triplicado. Longitud de la cola (migración del ADN de núcleo en μmeters) fue el parámetro utilizado para evaluar el daño del ADN.
apoptosis inducida Cu (II) en Cols
linfocitos tratados se unta en un lugar limpio, etanol esterilizado portaobjetos de vidrio, y se tiñeron con tinción de Leishman. Las células apoptóticas se puntuaron visualmente en tres campos visuales seleccionados aleatoriamente de acuerdo con criterios de Hasan et al. [23] utilizando un microscopio compuesto binocular Nikon.
El análisis estadístico
Los valores se expresan como media ± SEM de tres experimentos independientes. Los datos se analizaron por el test de Tukey después de análisis de varianza de una sola vía (ANOVA) utilizando GraphPad Prism 5.01 (California, EE.UU.). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a P & lt; 0.05
Resultados
modelo celular para el estudio de la interacción ex vivo de calcitriol y cobre
Como se mencionó anteriormente el calcitriol se conoce para mediar efectos anticancerígenos. Se ha informado de que el Cu (II) también es significativamente elevado en las células malignas. Para estudiar los efectos de la interacción calcitriol-Cu (II), hemos desarrollado un sistema modelo basado en los linfocitos. Calcitriol sobrecarga de los linfocitos se logró mediante inyección intraperitoneal de la colecalciferol calcitriol precursor, que se sometió a la conversión en calcitriol, dentro del sistema animal. Después de la inyección colecalciferol, se observó que los niveles de calcitriol en los linfocitos aislados fueron elevados por 25,52% (Figura 1). los niveles de Cu (II) se incrementaron en un
in vitro
suplementación de aislados, CDA con Cu (II). Los ensayos para la peroxidación de lípidos, de carbonilación de proteínas y el daño del ADN como consecuencia de la interacción-Cu calcitriol (II) se realizaron en el sistema de linfocitos aislados.
Los niveles de calcitriol en calcitriol sobrecargado de linfocitos (cols) y linfocitos lisados de control. Los valores expresados como la media ± SEM (n = 3) * P & lt;. 0,001 en comparación con el control y el control del vehículo
Cu (II) en la peroxidación lipídica inducida CDA
El calcitriol tiene ha demostrado que causa el estrés oxidativo. Una de las consecuencias del estrés oxidativo es la peroxidación de los lípidos celulares [20]. Por lo tanto, la peroxidación de lípidos se empleó como un marcador para evaluar el estrés oxidativo como una función de los niveles de calcitriol. Elevación en los niveles de calcitriol no dio lugar a la peroxidación de lípidos significativa en CDA (Figura 2). Sin embargo, la exposición de COLs a Cu (II) iones condujo a un marcado aumento en la peroxidación de lípidos (Figura 2). Para determinar si la peroxidación de lípidos es un Cu (II) efecto específico de, o si otros iones metálicos divalentes con actividad redox, tales como Fe (II) y Zn (II) mediar la peroxidación de lípidos en presencia de calcitriol, los quelantes de Fe (II se agregaron) y Zn (II) iones (desferoxamina e histidina, respectivamente) para CDA aisladas. Se observó que la eliminación de Fe (II) y Zn (II) no causó una inhibición significativa de la peroxidación de lípidos (Figura 2). Como control, se introdujeron los quelantes de Cu (II) para probar el papel específico de Cu (II) en la causa de estrés oxidativo en CDA. Se observó que la inhibición significativa de la peroxidación de lípidos se logró después de la retirada de Cu (II) (Figura 2). Para identificar la ubicación de la piscina Cu (II) (intra-celular frente extracelular) que media en la peroxidación de lípidos, el efecto de Cu (II) quelantes con diferentes permeabilidades de membrana se puso a prueba en la peroxidación lipídica en COLs aisladas. Es importante señalar que bathocuprione, que es un Cu (II) quelante membrana impermeable, no inhibió la peroxidación de lípidos tan eficazmente como neucuprione, un quelante de cobre membrana permeable (Figura 2). Se infiere que la piscina intracelular de Cu (II) media la peroxidación de lípidos a través de interacciones con calcitriol. Se observó que exógenamente añadió Cu (II) en los linfocitos de control (sin carga) no indujo la peroxidación lipídica significativa (Figura 2). Como la peroxidación es causada por la actividad de los agentes de daño oxidativo, se utilizaron eliminadores de radicales libres (SOD, catalasa y tiourea) para determinar la identidad de los radicales libres que están involucrados en Cu Eventos (II) inducido por oxidación -calcitriol. Se observó una inhibición efectiva de Cu (II) inducida por la peroxidación lipídica en CDA aislados con SOD, catalasa y tiourea (Figura 2). Se infiere que el anión superóxido, peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo, rescatados, respectivamente, por SOD, catalasa y tiourea, median Cu (II) inducida por la peroxidación de lípidos.
(A) Control (B) de control de vehículo (C ) Cu (II) (25μM) [añadió a la no calcitriol cargado, los linfocitos de control] (D) de sobrecarga calcitriol (sobrecarga E) calcitriol + Cu (II) (25μM) (sobrecarga F) calcitriol + Cu (II) (25μM) + Bathocuprione (50 micras) (membrana impermeable Cu (II) quelante) (G) de sobrecarga Calcitriol + Cu (II) (25μM) + Neucuprione (50 micras) (membrana permeable Cu (II) quelante) (H) de sobrecarga Calcitriol + Cu (II) (25μM) + desferoxamina (50 micras) (Fe (II) quelante) (I) de sobrecarga Calcitriol + Cu (II) (25μM) + histidina (50 micras) (Zn (II) quelante) (J) de sobrecarga Calcitriol + Cu (II) (25μM) + SOD (20 microgramos /ml) de sobrecarga (K) Calcitriol + Cu (II) (25μM) + catalasa (20 microgramos /ml) (L) de sobrecarga Calcitriol + Cu (II) (25μM) + tiourea (0,1 mM). Valores expresados como media + SEM (n = 3). P & lt; 0,05 en comparación con el control y cols con Cu (II) (25μM). Todas las incubaciones se llevaron a cabo durante 2 horas a 37º C.
Cu (II) inducida por carbonilación de proteínas en Las CDA
carbonilación de proteínas es una consecuencia del estrés oxidativo y la interacción de los radicales libres con cadenas laterales de aminoácidos. Por lo tanto carbonilación proteína sirve como un marcador para el estrés oxidativo encontrado por un sistema biológico. La exposición de COLs a Cu (II) iones resultó en un marcado incremento en la carbonilación de proteínas totales. Quelantes intracelular Zn (II) y Fe (II) no afectó a la carbonilación de proteínas mientras que quelante de Cu (II) del sistema como resultado una marcada disminución en el contenido total en carbonilo. La presencia de captadores de radicales (SOD, catalasa y tiourea) en el sistema dio lugar a una marcada disminución en el contenido total de proteínas carbonilo (Figura 3).
(A) control (B) de control del vehículo (C) Cu (II) (25μM) [añadió a la no calcitriol cargado, los linfocitos de control] (D) de sobrecarga calcitriol sobrecarga (E) calcitriol + Cu (II) (25μM) de sobrecarga (F) calcitriol + Cu (II) (25μM) + Bathocuprione (50 micras) (membrana impermeable Cu (II) quelante) (G) de sobrecarga Calcitriol + Cu (II) (25μM) + Neucuprione (50 micras) (membrana permeable Cu (II) quelante) (H) de sobrecarga Calcitriol + Cu (II) ( 25μM) + desferoxamina (50 micras) (Fe (II) quelante) (I) de sobrecarga Calcitriol + Cu (II) (25μM) + histidina (50 micras) (Zn (II) quelante) (J) de sobrecarga Calcitriol + Cu (II) ( 25μM) + SOD (20 microgramos /ml) (sobrecarga K) Calcitriol + Cu (II) (25μM) + catalasa (20 microgramos /ml) (L) de sobrecarga Calcitriol + Cu (II) (25μM) + tiourea (0,1 mM). Valores expresados como media + SEM (n = 3). P & lt; 0,05 en comparación con el control y cols con Cu (II) (25μM). Todas las incubaciones se llevaron a cabo durante 2 horas a 37º C.
Cu daño en el ADN celular inducida (II) en COLs
generación de radicales libres provoca el daño del ADN, lo que conduce a la apoptosis [ ,,,0],24]. Una de las características de la apoptosis es la rotura del ADN en fragmentos, que se detecta por un ensayo de cometa. Se observó que la sobrecarga de calcitriol en los linfocitos dio lugar a daños en el ADN, que fue significativamente mayor después de la incubación de CDA con Cu (II) (Figura 4A, 4D). A fin de determinar la especificidad de Cu (II) en la mediación de daño en el ADN, se utilizó la membrana permeable Cu (II) -chelator neucuprione. La incubación de CDA aisladas con neucuprione daño en el ADN, inhibió, que implican a Cu intracelular (II) como participante en el daño del ADN mediada por calcitriol (Figura 4B, 4D). La participación de otros cationes divalentes en el daño del ADN calcitriol mediada en linfocitos fue probado con desferoxamina e histidina, que no inhibe el daño del ADN, descartando la participación de Fe (II) y Zn (II) en el proceso (Figura 4B, 4D ). La inhibición de daño en el ADN por SOD, catalasa y tiourea implica que el daño del ADN es causada por el anión superóxido, peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo (Figura 4C, 4D).
daño del ADN en los linfocitos de control, el control del vehículo (A) linfocitos, CDA y cols con Cu (II) (25μM). Valores expresados como media + SEM (n = 3) ** P & lt; 0.001as comparación con el control y el control del vehículo, P & lt; 0,001 cuando * y ** se comparan). (B) La eliminación de Cu (II) y el daño del ADN. COLs con Cu (II) (25μM) + neucuprione (Neo) (50 micras) (membrana permeable Cu (II) quelante), desferroxamina (Desf) (50 micras) (Fe (II) quelante), histidina (His) (50 micras) ( Zn (II) quelante) Valores expresados como la media ± SEM (n = 3) * P & lt.; 0,001 en comparación con el control y cols con Cu (II) (25μM). (C) Las CDA con Cu (II) (25μM) se incubaron junto con superóxido dismutasa (SOD) (20 microgramos /ml), catalasa (CAT) (20 microgramos /ml), y tiourea (tio) (0,1 mM) valores expresados como media + SEM (n = 3). (D) Imágenes representativas de Comet Assay (1) Control (2) de vehículo de control (3) CDA (4) COLs + Cu (II) (25μM) (5) COLs + Cu (II) (25μM) + Neo (50 micras) (6) Las CDA + Cu (II) (25μM) + Desf (50 micras) (7) COLs + Cu (II) (25μM) + Su (50 micras) (8) COLs + Cu (II) (25μM) + SOD (20 microgramos /ml) (9) Las CDA + Cu (II) (25μM) + Cat (20 microgramos /ml) (10) COLs + Cu (II) (25μM) + Thio (0,1 mM). * P & lt; 0,001 en comparación con el control y cols con Cu (II) (25μM). Todas las incubaciones se llevaron a cabo durante 2 horas a 37º C.
Cu apoptosis inducida (II) en el CDA
La apoptosis se caracteriza por cambios morfológicos en la célula. Los núcleos de las células apoptóticas se caracterizan por la formación de cuerpos apoptóticos distintos y fragmentación nuclear. La exposición de los COLs a Cu (II) iones resultó en un marcado incremento en el número de células apoptóticas. La eliminación de cobre del sistema disminuyó el número total de células apoptóticas, mientras que la quelación de otros iones metálicos divalentes activos redox (Zn (II) y Cu (II)) no afectó significativamente la apoptosis. eliminadores de radicales libres se redujo con éxito el número de células apoptóticas por lo tanto implican claramente el papel de las especies reactivas del oxígeno en Cu (II) de la apoptosis inducida CDA (Figura 5).
(A) de control de vehículo de control (B) (C ) Cu (II) (25μM) [añadió a la no calcitriol cargado, los linfocitos de control] (D) de sobrecarga calcitriol (sobrecarga E) calcitriol + Cu (II) (25μM) (sobrecarga F) calcitriol + Cu (II) (25μM) + Bathocuprione (50 micras) (membrana impermeable Cu (II) quelante) (G) de sobrecarga Calcitriol + Cu (II) (25μM) + Neucuprione (50 micras) (membrana permeable Cu (II) quelante) (H) de sobrecarga Calcitriol + Cu (II) (25μM) + desferoxamina (50 micras) (Fe (II) quelante) (I) de sobrecarga Calcitriol + Cu (II) (25μM) + histidina (50 micras) (Zn (II) quelante) (J) de sobrecarga Calcitriol + Cu (II) (25μM) + SOD (20 microgramos /ml) de sobrecarga (K) Calcitriol + Cu (II) (25μM) + catalasa (20 microgramos /ml) (L) de sobrecarga Calcitriol + Cu (II) (25μM) + tiourea (0,1 mM). Valores expresados como media + SEM (n = 3). P & lt; 0,05 en comparación con el control y cols con Cu (II) (25μM). Todas las incubaciones se llevaron a cabo durante 2 horas a 37º C.
Discusión
En este estudio, proporcionar evidencia preliminar de que el calcitriol-Cu (II) la interacción es importante en causar daño en el DNA , lo que puede conducir a la apoptosis. Puesto que se ha demostrado que el Cu (II) está presente unido al ADN genómico [9] y se eleva en las células malignas [6-8], Cu (II) se puso a prueba como metal candidato para activar la química de calcitriol.
los estudios descritos aquí probar el papel de calcitriol-Cu interacción (II) en la peroxidación de lípidos, de carbonilación de proteínas y el daño del ADN, tres indicadores de estrés oxidativo y la consiguiente apoptosis. Para la actividad pro-oxidante, se requiere la generación de especies reactivas del oxígeno, de calcitriol. Varios fármacos pro-apoptóticos [25,26], moléculas derivadas de plantas [24,27], y la vitamina C [28], actúan para dañar el ADN de ión metálico mediada por la reacción de Fenton.
Se propone un mecanismo putativo ( Figura 6 a) por el cual calcitriol puede interactuar con el ADN ligado Cu (II) para ejercer sus efectos pro-oxidantes. El grupo metileno del calcitriol acepta un electrón de Cu (II) y por una serie de reordenamientos de doble enlace y autolisis de agua forma radicales hidroxilo. Estos radicales hidroxilo pueden o bien combinar entre sí y dar lugar a la producción de peróxido de hidrógeno o, alternativamente, pueden interactuar con Cu (I) y dar lugar a la producción de Cu (II), estableciendo de ese modo un ciclo redox.
( a) La producción de radicales de hidroxilo, aniones superóxido y el peróxido de hidrógeno plomo a daños en el ADN y la consiguiente muerte celular. (B) Hetero-dímero de VDR (verde) y RXR (naranja) que muestra la separación entre el sitio de unión calcitriol y el ADN ligado. Panel superior: Vista normal al eje del ADN unido. Panel inferior: Visión a lo largo del eje del ADN unido. El calcitriol (oscuro palos verdes y esferas) unidos a VDR, que constituye el sitio de producción de radicales libres, se separa de la molécula de ADN de ~ 39 Å. Para referencia, también se muestra el ácido retinoico unido a RXR. La molécula de ADN de doble cadena se muestra como palos negro /azul delgadas. Las medidas de distancia y la figura de preparación se realizaron en PyMOL (www.pymol.org) usando coordenadas del VDR /RXR hetero-dímero [Orlov et al. EMBO J. 2012] amablemente proporcionados por B. Klaholz.
El peróxido de hidrógeno una vez formado, puede reaccionar adicionalmente con Cu (II) que conduce a su degradación homolıtica /hetrolytic, que las formas aún más radicales hidroxilo, y Cu (II) se reduce a Cu (I). Alternativamente anión superóxido puede reaccionar con agua y formar aún más peróxido de hidrógeno.
Dado que el cobre intracelular se une a ADN, y el calcitriol es conocido por entrar en el núcleo, la producción de radicales libres y el peróxido de hidrógeno por el mecanismo propuesto, con toda probabilidad, tendrá lugar en las inmediaciones de ADN que conduce al daño del ADN. Los radicales hidroxilo parecen jugar un papel importante en la generación de estrés oxidativo, ya que tiourea, un potente eliminador de radicales hidroxilo puede evitar tanto la peroxidación lipídica y el daño del ADN de manera significativa. También es importante señalar que la membrana permeable Cu (II) quelante, neucuprione también inhibe la peroxidación de lípidos, de carbonilación de proteínas, daño en el ADN y la apoptosis, posiblemente por quelantes y por lo tanto, haciendo que el ADN unido de cobre disponible para reaccionar con calcitriol.
Para descartar la participación de los otros principales metales redox activos presentes en los sistemas biológicos, (II) y Zn (II) se pusieron a prueba Fe. Los experimentos con quelantes de Fe (II) y Zn (II) no causaron la inhibición de la peroxidación de lípidos calcitriol mediada, carbonilación de proteínas, daño en el DNA y la apoptosis en CDA. Por lo tanto, se concluye que el Cu (II) interactúa específicamente con calcitriol para mediar el daño del ADN que conduce a la apoptosis. Calcitriol se infiere a desempeñar un papel en la activación de la apoptosis en un ambiente rico Cu (II), tal como la observada en las células malignas, que pueden actuar como un mecanismo de defensa para controlar el crecimiento de células malignas.
resultados descritos en el presente estudio proporciona una visión de las interacciones-ADN de calcitriol-Cu (II). A este respecto, es importante señalar que el calcitriol, una molécula hidrofóbica, interactúa con Cu (II) y de ADN, que son a la vez muy polar. Como derivado de lípido, particiones de calcitriol en bicapas lipídicas. En el caso de una interacción directa entre calcitriol y las especies polares, es imperativo que una molécula adaptadora trae calcitriol en el entorno de ADN y el ADN ligado Cu (II). Un tal molécula es el receptor de la vitamina D (VDR). Está bien documentado que VDR se localiza en el núcleo [29], y se une selectivamente a tanto calcitriol y el ADN. Por proximidad espacial daño oxidativo eficiente entre calcitriol y el ADN (junto con los iones unidos Cu (II)) es necesario. En segundo lugar los ratones knockout de VDR se han demostrado ser extremadamente sensibles a carcinógenos químicos. Dentro de los 60 días de exposición, el 88% de los ratones nulos VDR expuestas al carcinógeno químico DMBA desarrolló cáncer [30]. ratones nulos VDR han demostrado ser muy sensibles a lukemia inducida químicamente y experimentales causas de ablación VDR aumento de la piel y glándula mamaria tumuroginesis [30] que indica una función clara de la VDR en el control del proceso de la carcinogénesis. Se ha demostrado que la expresión de VDR se correlaciona positivamente con la supresión de tumores [30]. Un modelo de la estructura de longitud completa VDR, en combinación con la pareja de unión del receptor de ácido retinoico (RXR) ha informado a través de la reconstrucción crio-microscopía electrónica (crio-EM) recientemente [12]. Es de importancia observar que la región bisagra VDR se ha demostrado que ser flexible, y esta flexibilidad es fundamental para la función del polipéptido de longitud completa [13-16]. Calcitriol molécula se encuentra para ser separado de la molécula de ADN unido por una distancia de aproximadamente 39 Å en la estructura de VDR (Figura 6B). Nuestra hipótesis es que la molécula VDR puede sufrir un cambio conformacional a lo largo de la bisagra, la figura 6B (panel superior), lo que eleva el ADN unido cerca de calcitriol [18].
El hecho de que el calcitriol es un proxidant en las células malignas se ha demostrado por Koren et al. [31] que demostraron que en la línea celular MCF-7, los niveles de glutatión aumentan tras la exposición a calcitriol, que es un indicador del aumento de la generación de ROS. Narvaez y Gales [32] han demostrado que el calcitriol la apoptosis de las células malignas induceded depende de la generación de radicales libres. El compromiso de las células malignas a la apoptosis calcitriol mediada ha demostrado ser independiente de caspasas, lo que indica que la apoptosis calcitriol mediada de células malignas es ejecutado por vías no clásicos. Nuestra no enzimática, cobre inducida, mecanismo mediado por ROS que conduce a la fragmentación del ADN irreparable puede ser uno de los varios factores que contribuyen a la muerte apoptótica de las células malignas tras la exposición a calcitriol.
Agradecimientos
SSH gracias las Universidad de Purdue para las instalaciones. Los autores agradecen al Prof. M. Mushfiq y el Dr. Saltanat Raza del Departamento de Química de la UMA, que ayudó a trabajar a cabo el mecanismo de reacción. AR desea gracias Khursid Alam Khan (Departamento de Ciencias de la vida silvestre, la UMA) por su apoyo, mientras que este trabajo estaba en marcha. Prof. Bruno Klaholz de IGBMC (Francia) proporcionó las coordenadas utilizadas para generar la estructura de VDR.