Extracto
Antecedentes
La acumulación de evidencia apoya el concepto de que el melanoma es muy heterogéneo y sostenida por una pequeña subpoblación de melanoma células madre similares. Esas células se consideran como responsable de la resistencia del tumor a las terapias. Por otra parte, las células de melanoma se caracterizan por su alta plasticidad fenotípica. En consecuencia, tanto las células madre similares a melanoma y su progenie más diferenciado deben ser erradicados para lograr la cura duradera. Por reevaluar compuestos en poblaciones heterogéneas de melanoma, que podría ser posible para seleccionar compuestos con actividad no sólo contra las células de la bicicleta rápido, sino también contra las células madre, como el cáncer. Los compuestos naturales eran los objetivos del presente estudio.
Métodos
Se analizaron 120 compuestos de los productos naturales Set II para identificar los compuestos activos contra las poblaciones de melanoma cultivadas de una manera independiente de anclaje y enriquecidos con células ejerciendo la capacidad de auto-renovación. La viabilidad celular, la detención del ciclo celular, la apoptosis, la expresión génica, la supervivencia clonogénico y la etiqueta de retención se analizaron.
Hallazgos
Varios compuestos células erradicadas de manera eficiente con capacidad clonogénico y nanaomycin A, estreptonigrina y eran Toyocamicina efectiva a 0.1 M. Otras pero no compuestos anti-clonogénico altamente citotóxicos como briostatina 1, siomicina A, iludina M, michellamina B y la pentoxifilina redujo notablemente la frecuencia de células positivas ABCB5 (cassette, subfamilia B, miembro 5 de unión a ATP). Por el contrario, el tratamiento con colchicina maitansina y seleccionado para las células que expresan este transportador. Maitansina, estreptonigrina, Toyocamicina y colchicina, aunque altamente citotóxicos, dejó una pequeña subpoblación de células en división lentos afectada. Los compuestos seleccionados en el presente estudio alterado diferencialmente la expresión del factor de melanocitos /microftalmia específico de melanoma asociada a la transcripción (MITF) y proto-oncogén c-myc.
Conclusión
seleccionadas compuestos anti-clonogénico podría investigarse más a fondo como adyuvantes potenciales dirigidas a las células madre similares a melanoma en la terapia contra el melanoma combinado, mientras seleccionado citotóxica pero los compuestos no es anti-clonogénico, lo que aumentó la frecuencia de células ABCB5-positiva y se mantuvo lento ciclismo células no afectado, que podría considerarse como una herramienta para enriquecer los cultivos con células que muestran características de las células madre del melanoma
Visto:. Sztiller-Sikorska H, K Koprowska, Majchrzak K, M Hartman, Czyz M (2014) Actividad compuestos naturales 'contra el cáncer Stem-Like o Fast-Ciclismo células de melanoma. PLoS ONE 9 (3): e90783. doi: 10.1371 /journal.pone.0090783
Editor: Christopher Heeschen, Centro Español Nacional del Cáncer (CNIO), España |
Recibido: 9 de diciembre de 2013; Aceptado: February 4, 2014; Publicado: 3 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Sztiller-Sikorska et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Financiación: este trabajo fue financiado por una subvención 2011/01 /B /NZ4 /04921, del Centro Nacional de Ciencias. El Conjunto de Productos Naturales II fue proporcionado sin costo por el Instituto Nacional del Cáncer (NCI, http://www.dtp.nci.nih.gov. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los intratumorales heterogeneidad fenotípica resulta de la variación genética, sino también. de la plasticidad de las células tumorales que se observa en respuesta a los estímulos microambientales. entre diversos fenotipos funcionales dentro de un tumor, una subpoblación de células madre, como el cáncer (CSC) capaz de auto-renovación y la mayor parte de un tumor que consta de rápido-ciclo las células y las células más diferenciadas podían distinguirse [1] - [3] Como la heterogeneidad fenotípica ha demostrado ser altamente dinámico en muchos tumores incluyendo melanoma [4] -. [7] y la erradicación terapéutico de CSC subpoblación puede ser seguido de su regeneración de la no-CSC, ambas células madre cancerosas y la población mayor debe considerarse en el desarrollo de la terapia contra el cáncer [8] - [14]. Por lo tanto, una combinación de fármacos que causan una erradicación completa de todos los tipos de células dentro de un tumor puede ser necesario para lograr curaciones duraderas. En el proceso de selección de candidatos a fármacos altamente potentes, hay un problema sustancial en la creación de
in vitro y modelos en experimentales que predicen confiablemente la actividad del fármaco en los pacientes. En el presente estudio, células de melanoma obtenidos directamente a partir de muestras patológicamente distintas, melanoma nodular y melanoma de extensión superficial, se hicieron crecer de una manera independiente del anclaje en un medio de células madre y se enriquecieron con células que ejercen la capacidad de auto-renovación en comparación con las monocapas de suero impulsada [15]. Este
in vitro modelo
tridimensional también se ha demostrado para preservar la heterogeneidad del tumor original más exactamente de dos dimensiones cultivos monocapa [16] - [18] y un elemento importante de la novedad en la presente
vitro
de cribado en la biblioteca de compuesto natural
los compuestos naturales son ampliamente utilizados en la terapia contra el cáncer y puede ejercer actividad biológica considerable [19] - [21].. Aunque su mecanismo de acción a menudo no están bien definidos, la mayoría de agentes terapéuticos derivados de los productos naturales son principalmente eficaces en la eliminación células cancerosas con una elevada tasa de proliferación. Compuestos que afectan a la división celular pueden fallar, sin embargo, para erradicar la subpoblación de células madre, como el cáncer de la bicicleta lenta, lo que conduce finalmente a una recaída tumoral. En el presente estudio, aunque varios enfoques se han utilizado en el proceso de selección, se dio prioridad a aquellos compuestos que eran capaces de reducir el número de células clonogénicas. Una reducción en la clonogenicidad fue interpretado como un efecto directo sobre el potencial de auto-renovación de las células madre, como el cáncer. Además, la apoptosis, la etiqueta de retención, la frecuencia de células ABCB5-positivos y la expresión de Wnt /β-catenina señalización genes diana,
MITF
y
c-MYC
, se evaluaron en el melanoma poblaciones tratadas con compuestos seleccionados, ya sea como altamente anti-clonogénico o altamente citotóxicos. Se investigó la influencia de los compuestos seleccionados en las moléculas y las vías stemness-asociado. células lenta de la bicicleta considerados como células madre, como el cáncer (CSC) se pueden marcar como las células de la etiqueta de retención [12]. En el presente estudio, se utilizó un colorante fluorescente CFSE para identificar compuestos que dejaron las células del melanoma etiqueta de retención no afectado. proteína transportadora de ABCB5, un mediador de la quimiorresistencia en melanoma, también se reconoce como un marcador potencial de células madre como de melanoma [2], [22]. Las células de melanoma que expresan proteína ABCB5 podrían sobrevivir selectivamente cuando se expone a la dacarbazina, vemurafenib y otras drogas [22]. Se demostró que el anticuerpo anti-ABCB5 o siRNA silenciamiento de genes invierten la resistencia a medicamentos contra el cáncer melanoma [23], [24]. Investigamos si la proporción de células que llevan este transportador se alteró en el tratamiento con compuestos naturales seleccionados. la señalización de Wnt desempeña un papel crucial en la preservación de la pluripotencia de las células madre embrionarias y el desarrollo del cáncer [25]. informe reciente sugiere un papel para la vía de señalización /β-catenina en el mantenimiento de la viabilidad y /o el mantenimiento de la autorrenovación de las células iniciadoras del tumor de mama
in vitro
[26]. En el melanoma, β-catenina señalización aumenta durante la progresión tumoral y promueve la quimio-resistencia [27]. Nuestro estudio reciente reveló que la vía de señalización /β-catenina Wnt se suprime en las poblaciones de melanoma con la baja frecuencia de células clonogénicas (Hartman et al., Presentado). La influencia de los compuestos naturales seleccionados en dos /β-catenina genes diana de Wnt,
MITF
y
c-MYC
se investigó. Factor de transcripción actos MITF como un reostato para determinar la identidad fenotípica entre diferentes subpoblaciones de células de melanoma [28]. Aunque amplificada solamente en aproximadamente 20% de los melanomas, MITF se ha propuesto como un oncogén adicción linaje contribuir a melanoma quimiorresistencia [29], [30]. El proto-oncogén c-MYC juega un papel crucial en el desarrollo de un gran número de tumores humanos [31]. Más recientemente, se ha demostrado que la sobre expresión de c-MYC en el tumor puede ser dirigida con células T específicas [32]. Compuestos que inducen la apoptosis y /o inhibir la proliferación de una manera acto-c-MYC específica sobre dianas celulares diferentes [33], [34]. c-MYC la inhibición de células de melanoma resultados en la proliferación reducida a través de mecanismos que involucran varias enzimas de la biosíntesis de nucleótidos [35].
Hasta donde sabemos, no existen estudios previos que exploran tantos factores en paralelo en el proceso de selección inicial para compuestos activos de Productos Naturales El conjunto II (NCI). Sobre la base de los perfiles de actividad creados, cada uno de los compuestos seleccionados pueden investigarse más a fondo por su potencial aplicabilidad como parte de la terapia contra el cáncer o como una herramienta en el trabajo de laboratorio. Los productos naturales seleccionados como compuestos activos contra células de melanoma también puede proporcionar nuevas pistas para la conversión en agentes clínicamente útiles.
Materiales y Métodos
Los compuestos
Los Productos Naturales conjunto II se obtuvieron del Instituto Nacional del cáncer (NCI, http://www.dtp.nci.nih.gov). Los compuestos estaban en placas de 96 pocillos con 60 compuestos por placa. Las placas se almacenan en seco a -20 ° C. Cada pocillo contenía 0,02 mol de compuesto en 1 l de glicerol. solución de 10 mM (20 l) de cada compuesto se obtuvo mediante la adición de 19 l de DMSO a cada pocillo. Inmediatamente después de la solubilización de las soluciones de fármacos se aliqouted en varias placas de prueba para evitar la posible precipitación del compuesto. Todos los experimentos se realizaron con compuestos proporcionados por el NCI.
Los tejidos tumorales y las células Declaración de Ética
DMBC se obtuvieron en el Departamento de Biología Molecular del Cáncer partir de muestras quirúrgicas de melanoma en estadios avanzados. Características de los pacientes de melanoma especímenes fueron publicados anteriormente [15], [36], [37]. El estudio fue aprobado por la Comisión de Ética de la Universidad de Medicina de Lodz y consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes.
Cultivos celulares
Las células se mantuvieron en medio de células madre (SCM) en una de manera independiente de anclaje como se describe anteriormente [36].
Medición del número de células viables
Las células de melanoma fueron contados después de la tinción con azul de tripano (Sigma-Aldrich) y se sembraron a una densidad de 4 × 10
3 células viables por pocillo en placas de 96 pocillos. Las células se cultivaron durante 45 h con vehículo (0,05% DMSO) o los compuestos de los productos naturales Set II en 5 mM. Un ensayo de actividad de la fosfatasa ácida (APA) se utilizó para medir el número de células viables. Brevemente, las placas se centrifugaron, el medio se desecha y se reemplaza con tampón de ensayo 100 l que contiene acetato de sodio 0,1 M (pH = 5), 0,1% de Triton X-100 y 5 mM de fosfato de p-nitrofenilo, pNPP (Sigma-Aldrich) y se incubaron durante 2 h adicionales a 37 ° C. La reacción se detuvo con 10 l /pocillo de NaOH 1 M, y los valores de absorbancia se midieron a la longitud de onda de 405 nm usando un lector de microplacas (Infinito M200Pro, Tecan, Austria). Las células de melanoma no respondieron a 0,05% de DMSO con la viabilidad reducida.
Viabilidad Ensayo
cambios inducidos por fármacos en la viabilidad celular después del tratamiento 45 h También se evaluaron por citometría de flujo después de yoduro de propidio (PI) manchas o mediante el uso de un analizador automatizado de la viabilidad celular de acuerdo con procedimientos estándar. En ambos ensayos, las células fueron analizadas utilizando un citómetro de flujo FACSVerse (Becton Dickinson, San José, California, EE.UU.), y los resultados fueron procesados mediante el uso de software de FACSuite (Becton Dickinson).
Análisis de Ciclo Celular
las células de melanoma fueron tratados con el vehículo o los compuestos a las concentraciones indicadas durante 30 h o 45 h, después se recogió y se fija con 70% (w /v) de etanol a -20 ° C. Las células se lavaron dos veces con PBS y se volvieron a suspender en PI tinción tampón que contiene ARNasa (Becton Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.). Tras la incubación durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad, las células se analizaron utilizando un citómetro de flujo FACSVerse (Becton Dickinson). ModFit LT 3.0 del software (Verificar software, Topsham, MN, EE.UU.) se utilizó para calcular los porcentajes de células en cada fase del ciclo celular, y se utilizó el software FACSuit (Becton Dickinson) para calcular los porcentajes de células muertas en subG
1 .
Ensayo clonogénico
Las células del melanoma se incubaron en primer lugar con compuestos a las concentraciones indicadas durante 4 horas. Entonces, la viabilidad se determinó por tinción con azul tripán y 1000, las células de melanoma viables individuales fueron transferidas a 700 superior l agar mezcla de medio (SCM, 0,35% (w /v) de agar) y se cubrieron las suspensiones de células obtenidas en placas de cultivo de 12 pocillos recubierto con 700 l solidificados mezcla de agar inferior (SCM, 0,5% (w /v) de agar). Las placas se incubaron a continuación a 37 ° C en una incubadora humidificada durante 2 semanas, y en algunos casos también por 3 semanas. Las células se tiñeron con 500 l de 0,005% de cristal violeta durante 2 h, y las colonias al menos 50 micras de diámetro se contaron bajo el microscopio. La influencia de los compuestos en la clonogenicidad se expresó como porcentaje de control de acuerdo con la fórmula: colonias número generado después del tratamiento con los compuestos /número de colonias en el control con el vehículo × 100.
análisis de citometría de flujo de la apoptosis
la detección de la muerte celular se llevó a cabo por doble tinción con anexina V-FITC y PI (Roche Diagnostics, Manheim, Alemania). Las células de melanoma fueron sembradas en placas de 12 pocillos y se trataron durante 45 h con los compuestos a las concentraciones indicadas. Después del tratamiento, se recogieron las células, se centrifugaron a 400 xg durante 5 min y se tiñeron con Anexina V-FITC y PI de 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. 15.000 eventos fueron analizados por cada muestra por citómetro de flujo FACSVerse (Becton Dickinson), y los resultados se procesaron mediante el uso de software FACSuite (Becton Dickinson).
Evaluación de células ABCB5-positiva
La frecuencia de las células que expresan ABCB5 se evaluó por citometría de flujo. No conjugado anticuerpo primario anti-ABCB5 de Sigma-Aldrich y de cabra conjugado con FITC anti-anticuerpo secundario de conejo (BD Pharmingen) se utilizaron en este estudio. Típicamente, se analizaron 30.000 células por muestra. Isotipo controles se incluyeron en cada experimento. Para excluir las células muertas del análisis, 7-aminoactinomicina D tinción (7-AAD; eBiosciences) se utilizó. adquisición de citometría de flujo se realizó utilizando un citómetro de flujo FACSVerse (Becton Dickinson) y se analizaron usando software FACSuite. Los cambios en la frecuencia de células ABCB5 positivos después del tratamiento de drogas durante 45 h se expresaron como porcentajes del control con vehículo.
CFSE tinción
Para el análisis de la CFSE, las células del melanoma se tiñeron con CFSE 1,5 M (el profármaco carboxifluoresceína succinimidil éster de diacetato) durante 30 min a 37 ° C, se lavaron dos veces, se sembró en placas de doce pocillos a 1,25 × 10
5 /pocillo, y se expusieron a los compuestos durante 5 días a las concentraciones indicadas. A continuación, el medio se intercambió y las células se incubaron en medio libre de fármaco durante 6 días adicionales, y se evaluó por citometría de flujo. la emisión de fluorescencia verde se midió usando un citómetro de flujo FACSVerse (Becton Dickinson) y se analizaron usando software FACSuite.
Aislamiento de ARN, síntesis de ADNc y PCR en tiempo real
ARN se aisló y se purificó usando el ARN total kit de aislamiento con el mini sistema de columna (A & amp; A Biotecnología, Gdynia, Polonia). La concentración de ARN y la pureza se midieron con un lector de placas Tecan NanoQuant (Tecan, Austria). cDNA fue sintetizado utilizando 300 ng de cebadores aleatorios y transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.). Se utilizó el sistema de análisis de ADN en tiempo real Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Morklake, Australia) para evaluar la expresión génica mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). La amplificación se llevó a cabo mediante el uso de KAPA SYBR qPCR RÁPIDO Kit universal 2X qPCR Master Mix (Applied Kapa, Ciudad del Cabo, África del Sur), 200 nM de cada cebador y el molde de ADNc 25 ng por reacción. Los cebadores utilizados para la PCR en tiempo real fueron las siguientes: MITF: 5'-ACC GTC TCT CAC TGG ATT GG-3 'y 5'-TAC TTG GTG GGG TTT TCG AG-3'; C-MYC: 5'-AAT GAA CCG AAG AAG CCC GTA GTT ATC C-3 'y 5'-GTT GTC TCC ACG ACA AGT CCT CTT C-3'; Sox2: 5'-TCG AGT CTC CAA GCG ACG-3 'y 5'-ACG AGA AGC TTG CTC TCC-3'. La temperatura de hibridación para todos los genes era 56 ° C. La expresión relativa de los genes diana se calculó frente a una RPS17 gen de referencia (con los cebadores: 5'-AAT CTC CTG ATC CAA GGC TG-3 'y 5'-GAT CAA CAG AGG TTA TGT CAC G-3'), y un matemático se utilizó un modelo que incluye una corrección de la eficiencia de PCR en tiempo real.
Análisis estadístico
Los datos representan la media ± SD de tres experimentos separados a menos que se especifique lo contrario. La importancia de una aparente diferencia en los valores medios para cualquier parámetro probado fue validado por test t emparejado de Student. P & lt; 0,05 se consideró significativo un
Resultados
estrategia de selección de compuestos naturales en células de melanoma desarrollado a lo
independiente de anclaje
El Productos Naturales conjunto II, que consiste en 120. compuestos (Tabla S1 en File SI) derivados de la colección DTP abierto Repositorio de 140.000 compuestos, se proyectó para identificar compuestos eficaces contra las células de melanoma. En la pre-pantalla de compuestos, se utilizaron dos líneas celulares derivadas de melanoma avanzado, uno de melanoma nodular (DMBC12) [15] y una de melanoma de propagación superficial (DMBC11) [37]. Ambas poblaciones se hicieron crecer en SMC de una manera independiente del anclaje como esferoides 3-dimensionales multicelulares. En la criba primaria, las células de melanoma a partir de esferoides disociadas fueron expuestas a cada compuesto a una sola concentración de 5 mM. Tanto, se utilizaron ensayos no clonogénico y clonogénico en paralelo (Fig. 1).
En primer lugar, los compuestos de Productos Naturales El conjunto II se ensayaron en dos líneas celulares de melanoma obtenidos a partir de muestras patológicamente distintas, DMBC11 y DMBC12, a una sola concentración de 5 mM. Los cambios en la viabilidad (ensayo APA, ensayo volumétrico, la tinción PI y subG
1 ensayo) se midieron como efectos a corto plazo y los cambios en el potencial clonogénico como los efectos a largo plazo de los compuestos ensayados. Todas las pruebas de viabilidad se compararon las inconsistencias potenciales. Dos criterios se utilizan para seleccionar compuestos para su posterior análisis: compuesto debe reducir la viabilidad celular (PI-tinción) a ≤ 50% del control y clonogenicidad a ≤ 20% de control. A continuación, los compuestos seleccionados se utilizaron a concentraciones más bajas para las curvas de dosis-respuesta. Los compuestos más potentes fueron entonces investigados por su capacidad de inducir apoptosis, para influir en la frecuencia de células ABCB5-positivas y las células de la bicicleta lenta de la etiqueta de retención, y para alterar la expresión de genes.
Corto Plazo citotóxicos y citostáticos Efectos de los compuestos naturales en las células del melanoma
Cuatro métodos no clonogénicas fueron elegidos para el cribado inicial. Los cambios en el número de células viables se determinaron con base en la cuantificación de la actividad de la fosfatasa ácida citosólica (ensayo APA) (Fig. S1A en File SI) y por citometría de flujo usando un analizador de la viabilidad celular automatizado (ensayo volumétrico) (Fig. S1B en File SI ). La citotoxicidad de los compuestos se midió por citometría de flujo después de tinción PI, ya sea como la frecuencia de células PI-positivos (Fig. 2 y la Fig. S2 en File SI) o como porcentaje de células en subG
1 de fracciones. Histogramas para aquellos compuestos que se acumularon más de 40% de las células de melanoma en subG
1 fracción se incluyen en la Fig. 3 y la fig. S3 A en el archivo SI. Todos estos ensayos se utilizaron para evaluar la actividad del fármaco después de incubación corto, ya sea después de 45 h para la cuantificación de las fracciones de células viables y PI-positivo, o después de 30 h para los porcentajes de células en subG
1 fracciones. En paralelo, los compuestos naturales en 5 M se evaluaron en, línea celular leucémica p53 deficientes resistentes a los medicamentos K562 (Fig. 2, Fig. S1-S2 en el archivo SI). La comparación de la citotoxicidad de los productos naturales contra las células de melanoma y leucemia (Fig. 2) reveló que varios compuestos activos contra las células de melanoma no fueron activos en células K562. Por ejemplo, estreptonigrina (32), crassin (68) y geldanamicina analógico (72) redujo la viabilidad de las células de melanoma a menos del 3% de control, pero la reducción de la viabilidad de las células K562 no alcanzó 50% de control. Las células de melanoma eran también mucho más sensible a fastigilin B (63), bactobolin (84), la didemnina B (104), siomicina A (107), Toyocamicina (108), geldanamicina (110) y tubulosine (119), entre otros (Fig. 2). células K562, a su vez, fueron mucho más sensibles a lapachona (20) que las células de melanoma.
La viabilidad se midió después de 45% de vehículo (0,05% DMSO) tratados con control. Para la comparación, se utilizó la línea celular de leucemia K562. Cada cuadrado representa la respuesta de las células de melanoma o leucemia a uno de los 120 compuestos. Los colores indican el nivel de respuesta de las células. Por claridad, los números designados en el presente estudio de los compuestos ensayados (Tabla S1 en el archivo SI) se ponen en la primera prima y la primera columna. Ver Figura S2 en archivo SI para los datos cuantitativos.
histogramas representativos de células DMBC11 tratados con compuestos naturales para 30
1 no supera el 40%, histogramas fueron analizados utilizando el software ModFit para el cálculo de los porcentajes de células en cada fase del ciclo celular. Histogramas que muestran la detención del ciclo celular en G
0 /G
1 fase fueron marcados con el marco verde, en la fase S con el marco azul y G
2 /M en marco rojo, y los porcentajes de células de melanoma detenidos en esas fases se indican. Cuando la acumulación de células de melanoma en subG
1 superó el 40%, se utilizó software FACSuit y los porcentajes de células muertas se indican. Los resultados obtenidos para las células DMBC12 se muestran en la Figura S3A en File SI. Efectos de concentraciones más bajas para los compuestos más citotóxicos o de exposición más largo para los compuestos ineficaces en 30 h se incluyen en la Figura S3B en File SI.
En el análisis del ciclo celular, varios compuestos a la concentración de 5 mM células de melanoma acumulados ya sea en diferentes fases del ciclo celular o las células dañadas generados recogidos en subG
1 (Fig. 3 para DMBC11 células y la Fig. S3A en File SI para DMBC12 células). Colchicine (1), rotenona (19), vincristina (39), maitansina (60) y rizoxina (86) detenido la mayoría de las células del melanoma en G
2 /M fase. Resorufina (12), michellamina B (101) y la fumagilina (120), entre otras células detenidas en la fase S, mientras que Brefeldina A (47) y camptotecina (48) células acumuladas en G
0 /G
1 o subG
1, según la línea de drogas y celular. Varios compuestos, que a los 5 M no causó efectos sobre el ciclo celular después del tratamiento durante 30 h, se utilizaron en el experimento posterior durante 45 h, mientras que los compuestos que causan la acumulación de células en subG
1 se ensayaron a 1 M, y en caso de los compuestos más potentes en 0.1 M (Fig. S3B en File SI). Estreptonigrina (32) que genera una gran población de células en subG
1 a 5 micras, células DMBC12 acumulados en la fase S cuando se usa a 0,1 mM.
Pre-pantalla de la capacidad Clonigénicas como un efecto a largo plazo de compuestos naturales en células de melanoma
Un ensayo clonogénico se empleó para investigar los efectos de los compuestos naturales en la capacidad de auto-renovación de las células de melanoma. Las células se incubaron con los compuestos sólo por 4 h, y los efectos a largo plazo de esta incubación se evaluó como la capacidad de formación de esferas en agar blando después de 2 semanas. Cuarenta y ocho y cuarenta y seis compuestos a 5 micras redujo el número de clones formados en agar a ≤1% de control en poblaciones DMBC11 y DMBC12, respectivamente (Fig. 4 y la Fig. S4 en File SI). Como células clonogénicas pueden dividir más lentamente, y la colonia no pueden alcanzar el tamaño apropiado dentro de 2 semanas, para varios compuestos de la recuento de colonias se llevó a cabo una semana después. No hubo diferencias sustanciales entre el número de clones obtenidos después de dos y tres semanas (datos no mostrados).
Las células se incubaron en medio que contiene el compuesto de 4 h y luego se cultivaron en agar blando durante 14 días en presencia de medio libre de fármaco. Las colonias celulares se tiñeron con violeta cristal y se contaron. Los compuestos se agrupan en función de su actividad anti-clonogénico expresado como porcentaje de control tratado con vehículo (0,05% DMSO). Al menos dos experimentos independientes se realizaron por duplicado. Ver Figura S4 en archivo SI para los datos cuantitativos.
Comparación de los efectos a corto y de compuestos naturales activos a largo plazo sobre las células del melanoma
Después de la selección inicial realizada a las 5 M, cada compuesto de Productos Naturales El conjunto II podría ser asignado a una de las cinco categorías (Fig. 5). Cuarenta y seis compuestos a 5 micras no estaban activos en cualquiera de los ensayos empleados en ambas poblaciones analizadas. Ellos fueron excluidos de los nuevos análisis. Algunos de esos compuestos no activos, tales como la curcumina (27) o rapamicina (69) están bien caracterizados por su actividad contra el cáncer, pero al parecer a los 5 mM no eran activos contra células de melanoma de anclaje independiente. Varios compuestos fueron capaces de inducir la muerte celular en los dos primeros días, y, además, las células de manera eficiente erradicadas con potencial clonogénico. Los compuestos fueron considerados como muy potente, y sus actividades, tanto no clonogénicas y clonogénicas, se midieron a concentraciones más bajas en los siguientes experimentos. Dos medicamentos, actinomicina D (105) y ciclofosfamida (117), fueron excluidos del análisis, ya que son muy bien caracterizados por su
in vitro en
y
in vivo
actividad anticancerígena en. Además, parthenolide (61) también se excluyó como nuestro informe detallado que describe sus efectos sobre las células del melanoma de anclaje independiente, se publicó recientemente [36]. Como se dio prioridad a los compuestos que reducen el número de células de melanoma que muestran la capacidad de auto-renovación, también se analizaron más compuestos seleccionados del grupo de los anti-clonogénico pero no altamente citotóxicos.
Después de la evaluación inicial, se agruparon los compuestos sobre la base de sus actividades. Un compuesto se define como anti-clonogénico cuando se redujo el porcentaje de clones formada en agar blando a menos del 20% de control tratado con vehículo (0,05% DMSO). Un compuesto fue nombrado citostático cuando se redujo el número de células viables a menos del 50% de control Uso de contar el número de células viables, y citotóxica usando citometría de flujo después de tinción PI-. Los números correspondientes a los compuestos que se acumulan en las células del melanoma subG
1 están subrayados. Los compuestos que causaron la detención del ciclo celular están marcados en verde para G
0 /G
1 fase, azul para la fase S y rojo para G
2 /M fase. Varios compuestos (46) no estaban activos en cualquier ensayo. Pocos compuestos eran citotóxicos pero no marcadamente influenciados el número de colonias formadas en agar. Pocos otros compuestos ejercían sus efectos sólo en células clonogénicas o reducido clonogenicidad debajo de 20% de control, causado efecto citostático /citostático sin inducir la muerte celular sustancial. Varios compuestos fueron citostáticos y citotóxicos y, además, las células de manera eficiente erradicadas con potencial clonogénico. Estaban en el foco del estudio adicional. Véase la Tabla S1 en el archivo SI para los nombres de los compuestos que corresponden a los números que se muestran en la Figura.
En primer lugar, los efectos citotóxicos de los compuestos naturales potentes fueron confirmados en seis líneas celulares derivadas de pacientes, incluyendo cuatro líneas celulares adicionales derivados de especímenes quirúrgicos de melanoma nodular, DMBC2, DMBC8, DMBC10 [15] y DMBC9 [36]. Las concentraciones de los compuestos se redujeron a 1 micras y 0,1 m, y en algunos casos a 0,01 M o incluso 0,001 M, hasta IC
50 efecto se alcanzó (Tabla S2 en File SI). En general, sólo pequeñas diferencias entre las respuestas de las células del melanoma de diferentes poblaciones DMBC eran visibles en las concentraciones de fármaco de 1 micras y 0,1 mM. células DMBC8 parecían ser menos sensible a varios compuestos que otras poblaciones.
A continuación, las curvas de dosis-respuesta se prepararon por 45 compuestos que ejercen fuertes potenciales anti-clonogénicas y /o citotóxicos (Fig. 6 y Fig. S5 en Si file). Sobre la base de las curvas de dosis-respuesta, la lista de clasificación de los compuestos más potentes de la Natural Products conjunto II se preparó (Tabla 1). La actividad anti-clonogénico se clasificó por encima de la actividad citotóxica. IC
50 valores de siete compuestos estaban por debajo de 0,1 mM cuando se evaluó la influencia de drogas en la capacidad de formación de clones en agar suave. Entre estos compuestos, maitansina (60) ejerce un efecto citotóxico general más fuerte que el efecto anti-clonogénico, estreptonigrina (32), Toyocamicina (108), la colchicina (1) y equinomicina A (102) tenían una potencia similar en ambas actividades, mientras que nanaomycin A (74) y la iludina M (114) eran más potentes en la erradicación de las células con el potencial clonogénico que en la reducción de la viabilidad en el corto plazo de incubación. No se observaron fenómenos similares para varios compuestos que eran eficaces a concentraciones más altas. Por ejemplo, el IC
50 valores para los compuestos anti-clonogénicas, briostatina 1 (112), siomicina A (107), Fumitremorgina C (118), fumagallin (120) michellamina B (101) y la pentoxifilina (100) estaban en el intervalo de 0,1 - 1 M en el ensayo clonogénico pero en el rango de 1 -. 5 M en el ensayo de viabilidad
las curvas de dosis-respuesta se prepararon para los compuestos que muestran un alto potencial clonogénico anti-y /o citotóxico. curvas de color azul, la actividad anti-clonogénico; curvas negras, actividad citotóxica. Los gráficos resumen los resultados de al menos 3 experimentos independientes realizados por triplicado utilizando DMBC11 (cuadrado relleno) y DMBC12 (cuadrado abierto) líneas celulares. se incluyen las fórmulas químicas de los compuestos ensayados. Las curvas de dosis-respuesta para los compuestos menos potentes se muestran en la Figura S5 en archivo SI.
La inducción de la apoptosis en células de melanoma Expuestos a compuestos seleccionados
análisis de citometría de flujo de Anexina V /células PI-manchado reveló que los compuestos altamente citotóxicos inducidos apoptosis en células de melanoma, mientras que los compuestos erradicar principalmente las células con la capacidad de formar clones (Tabla 1) no provocó apoptosis en concentraciones eficaces para su actividad anti-clonogénico (Fig. 7) . Por ejemplo, maitansina (60) de la apoptosis inducida en la mayoría de las células en la concentración tan baja como 0,01 M. Por el contrario, nanaomycin A (74), que a 0.1 M casi completamente las células con potencial clonogénico erradicada no indujo apoptosis en esta concentración.
La inducción de apoptosis se determinó por citometría de flujo después de anexina V /yoduro de propidio tinción . se muestran gráficos de contorno típico de las células de melanoma tratadas con compuestos a las concentraciones indicadas. Figura S2. Figura S3. Figura S4. Figura S5. Tabla S2. Tabla S3.