Extracto
receptor de andrógenos (AR) vía de señalización sigue siendo el principal objetivo de nuevas terapias para el cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) . Sin embargo, la expresión de AR constitutivamente activa variantes carece de la región carboxi-terminal en CRPC puede conducir a la ineficacia terapia. Estas variantes AR se supone para apoyar el crecimiento de células de CaP en un entorno de andrógenos-agotado, pero su modo de acción aún sigue sin resolverse. Por otra parte, estudios recientes indican que las variantes AR constitutivamente activos se expresan en los tumores de próstata primarios y pueden contribuir a la progresión del tumor. El objetivo de este estudio fue investigar el impacto de variantes AR constitutivamente activos en la expresión de marcadores de la progresión tumoral. la expresión de N-cadherina se analizó en las células LNCaP que sobreexpresan la AR de tipo salvaje o una variante AR constitutivamente activa de QRT-PCR, Western blot e inmunofluorescencia. Hemos demostrado aquí por primera vez que la expresión de N-cadherina se incrementó en presencia de variantes AR constitutivamente activos. Estos resultados fueron confirmados en las células que sobreexpresan C4-2B estas variantes AR. Aunque la expresión N-cadherina se asocia a menudo con una regulación por disminución de la E-cadherina, este fenómeno no se observó en nuestro modelo. Sin embargo, además del aumento de la expresión de N-cadherina, una regulación positiva de la expresión de otros marcadores mesenquimales como
vimentina, caracol
y
ZEB1
se observó en la presencia de variantes constitutivamente activos. En conclusión, nuestros resultados ponen de relieve nuevas variantes consecuencias de AR constitutivamente activos en la regulación de los marcadores mesenquimales en cáncer de próstata
Visto:. Cottard M, Asmane I, E Erdmann, Bergerat JP, Kurtz JE, CERALINE J (2013 ) constitutivamente activa la expresión del receptor de andrógenos variantes regulan al alza de los marcadores mesenquimales en células de cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (5): e63466. doi: 10.1371 /journal.pone.0063466
Editor: Zoran Culig, Universidad Médica de Innsbruck, Austria |
Recibido: 9 Enero, 2013; Aceptado: April 2, 2013; Publicado: May 2, 2013
Derechos de Autor © 2013 Cottard et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Estrasburgo; la Liga Contra el Cáncer, la Alsacia Contra el Cáncer; y la Asociación para la Investigación sur les Tumeurs Prostatiques (ARTP). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es el cáncer más común en hombres mayores de 50 años de edad y la segunda causa de mortalidad masculina por cáncer en Europa. Los andrógenos de señalización juega un papel clave en las células de CaP proliferación o la supervivencia [1], y la eliminación de andrógenos sigue siendo el principal tratamiento para la recurrencia local y dependiente de andrógenos CaP metastásico. Sin embargo, el beneficio de esta terapia es transitorio y en última instancia, todos los tumores se repiten como resistente a la castración CaP (CRPC).
eventos genéticos que afectan y empalme del gen del receptor de andrógenos (AR) se han relacionado con CRPC. variantes AR constitutivamente activa, carece de la región carboxi-terminal que abarca el dominio de unión a ligando y la función de activación 2, podrían contribuir a la progresión de la PCa en la resistencia a la castración. Estas variantes AR constitutivamente activas son el resultado de los codones de parada prematuros debido a mutaciones sin sentido que las indicadas para la ARQ640X [2], [3], [4], [5] o del corte y empalme alternativo con la retención de una secuencia exonic críptica como se describe para AR -V7 [4], [6], [7], [8],.
El papel de las variantes AR constitutivamente activas en CRPC se ha demostrado en muchos estudios [7], [8], [11 ], [12]. La expresión de estas variantes truncadas AR se incrementa en un 20 veces en comparación con el CRPC CaP localizado [9], y se correlaciona con la capacidad de las células de CaP creciendo
in vitro
y
in vivo
en ausencia de andrógenos [7]. Sin embargo, los mecanismos moleculares exactos que conducen a su activación y su modo de acción en el CaP y CRPC siguen sin estar claros.
Los estudios recientes sugieren que las variantes AR constitutivamente activas podrían desempeñar un papel en la progresión tumoral. De hecho, aunque estas variantes AR constitutivamente activas que ya se expresan en los tumores de próstata primarios, su expresión es tanto más expresado en metástasis ósea [8]. Además, su expresión se asocia con un aumento de NFAT (factor nuclear de células T activadas) (1-proteína activadora) y la actividad AP-1, dos factores de transcripción implicados en la proliferación celular, la migración y la supervivencia [13].
N-cadherina, que pertenece a la superfamilia de cadherina, se encuentra en las uniones adherentes de las células nerviosas, endoteliales o mesenquimales y está implicado en la progresión del tumor [14], [15]. De hecho, la expresión de N-cadherina se incrementa en la mayoría de tipos de cáncer y promueve la migración de células tumorales, invasión y la supervivencia [14]. El aumento de expresión de N-cadherina también está asociada con la transición epitelial-mesenquimal (EMT), un fenómeno que se caracteriza por una disminución de marcadores epiteliales, tales como E-cadherina y un aumento de los marcadores mesenquimales tales como vimentina o N-cadherina [16], [17 ], [18], [19]. Estas modificaciones moleculares y celulares desempeñan un papel importante en las células tumorales difusión en los sitios secundarios [20], 21.
Más recientemente, los estudios han demostrado que la resistente a la castración CaP se asocia con una regulación al alza de la expresión de N-cadherina en modelos celulares, así como xenoinjertos CaP y muestras clínicas de CRPC [22], [23], [24]. Además, los anticuerpos monoclonales contra el N-cadherina se han demostrado retrasar la aparición de resistencia a la castración y para reducir el crecimiento de xenoinjertos de CRPC [23]. Tomados en conjunto, estos datos muestran que existe una correlación entre la expresión de N-cadherina y la resistencia a la castración. Sin embargo, los mecanismos moleculares mediante el cual la expresión de N-cadherina se incrementa en CRPC siguen siendo desconocidos.
El objetivo de este trabajo es mostrar una posible relación entre la presencia de variantes AR constitutivamente activos y la expresión de marcadores de progresión tumoral. Más en particular, nos hemos centrado en el impacto de las variantes AR constitutivamente activas en la expresión de N-cadherina y otros marcadores mesenquimales. En el presente estudio, hemos demostrado que
N-cadherina
, así como
vimentina
,
CARACOL
y
ZEB1 ¿Cuáles son upregulated en presencia de AR variantes constitutivamente activos en CaP.
Materiales y Métodos
cultivo de células
el carcinoma de próstata LNCaP línea celular humana, clon FGC y la línea celular 22Rv1 (ECACC, Salisbury, Reino Unido) se mantuvo en medio RPMI-1640 completo que contiene 10% de suero de ternera fetal (FCS), HEPES 10 mM, 2 mM L-glutamina, 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich, Francia) y piruvato de sodio 1 mM (Invitrogen, Fisher Scientific, Francia).
línea celular C4-2B (ViroMed laboratorios, Minnetonka, MN, EE.UU.) se mantuvo en medio DMEM suplementado con 20% de Ham F12, 10% de FCS, 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, 5 mg /ml de insulina, 13,65 pg /ml triyodo-tironina, 4,4 mg /ml de apo-transferrina humana, 0,244 mg /ml de D-biotina y 12,5 mg /ml de adenina (Sigma Aldrich, Francia).
plásmidos y transfección
Para los experimentos de inmunofluorescencia, el receptor de andrógenos de tipo salvaje (AR) (AR-WT) y la constitutivamente activa AR y AR Q640X Q670X [25] variantes estaban vinculados a EGFP como se describe anteriormente [2], [3]. Para el análisis de la expresión génica y Western-blot, PE-ARWT, PE-ARQ640X y PE-AR-V7 plásmidos se construyeron mediante la inserción del correspondiente ADNc AR entre los sitios NheI y BamHI en pEGFP-C3
.
Para las transfecciones , la JetPEI
TM reactivo de transfección (Polyplus transfección, Ozyme, Francia) se usó de acuerdo con el protocolo del fabricante. células LNCaP fueron sembradas en placas de 10 cm a 1 × 10
6 células /plato o en la placa de 6 pocillos a 2 x 10
5 /pocillo. Tres días más tarde, se cambió el medio y las células fueron transfectadas con 10 g del plásmido indica utilizando 20 l de reactivo de transfección JetPEI para platos de 10 cm o con 3 g de plásmido usando 6 l de JetPEI por placa de 6 pocillos. El medio se cambió 48 h después y las células se incubaron hasta 9 días de acuerdo con los experimentos. El medio se cambió cada dos días y para las incubaciones más allá de día 4 después de la transfección, las células se incubaron en presencia de 400 mg /ml de geneticina (Invitrogen, Francia).
Impacto de los andrógenos sobre la expresión de N-cadherina
células LNCaP fueron sembradas en 6 pozos de placa en medio completo y se transfectaron como se describe anteriormente. Veinticuatro horas más tarde, el medio se cambió a rojo fenol libre RPMI-1640 suplementado con 5% de dextrano recubiertos con carbón vegetal FCS (DCC-FCS) y con la concentración indicada de la dihidrotestosterona (DHT) (Sigma-Aldrich, Francia) o vehículo (etanol).
Para el experimento con MDV3100, células LNCaP transfectadas se incubaron en RPMI-1640 suplementado con 5% DCC-FCS que contiene la dosis DHT indicado y 100 nM MDV3100 (Enzalutamida, Selleck Chemicals, Euromedex, Francia) o vehículo (dimetilsulfóxido, DMSO). Para confirmar los efectos de los andrógenos sobre la expresión de N-cadherina, se cultivaron 22Rv1 células en medio RPMI-1640 con 100 nM o 1 M MDV3100, o DMSO.
clasificación de células
células LNCaP fueron sembradas en 10cm platos en 1 × 10
6 células /placa y fueron transfectadas con pEGFP-ARWT o pEGFP-ARQ640X. Cuatro días después de la transfección, las células se trataron con tripsina y gracias a la fluorescencia verde (EGFP) con un clasificador celular BD FACSAria-II (BD Biosciences, Le Pont de Claix, Francia) ordenados. ARN total fue extraído de EGFP negativo (no transfectadas) y las células EGFP positivas (transfectadas) y se utilizó para analizar la expresión génica mediante qRT-PCR.
Cuantitativa en tiempo real PCR
Total celular se extrajo ARN de líneas celulares utilizando el ensayo NucleoSpin® RNA II (Macherey-Nagel, Francia) de acuerdo con el procedimiento del fabricante. las concentraciones de ARN y la pureza se cuantificaron midiendo la absorbancia a 260 nm y 280 nm (GeneQuant pro, GE Healthcare, Francia). La transcripción inversa se realizó a partir de 400 ng o 1 RNA g usando RT Omniscript de ensayo (Qiagen, Courtaboeuf, Francia). ARN se diluyeron en 13 l y desnaturalizado a 65 ° C durante 5 minutos. Se añadió una mezcla de reacción de 7 l que contiene 1 × plantilla RT, 0,5 mM de cada dNTP, 1 mM oligo dT, inhibidor de RNasa y 10U 4U Omniscript transcriptasa inversa y la reacción se incubó 1 h a 37 ° C. La reacción se detuvo por calentamiento a 93 ° C durante 5 minutos.
N-cadherina
,
E-cadherina
,
vimentina
,
CARACOL
,
TWIST1
, y
ZEB1
niveles de mRNA fueron cuantificados usando PCR en tiempo real con LightCycler 480 (Roche Applied Science, Meylan, Francia). Para las reacciones de PCR, 5 l LightCycler® 480 SYBR Green I Master (Roche, Molecular Diagnostics, Mannheim, Alemania) y 1 l cebadores específicos (Tabla 1) (Qiagen, QuantiTect Primers, Courtaboeuf, Francia) se mezclaron con 4 l de 1: dilución 5 cDNA. Los resultados se normalizaron mediante limpieza de genes
β-actina
o
PBGD gratis (porfobilinógeno deaminasa) (Qiagen, QuantiTect Primer). especificidad de amplificación se verificó mediante el análisis de curva de fusión y por la migración de electroforesis. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron 3 veces. cuantificación relativa se utilizó para determinar el cambio veces en el nivel de expresión por el método ΔΔCt. Cada valor se expresa como la media ± SEM ΔΔCt. Los resultados se analizaron con la prueba t de Student y
p-valor
& lt; 0,05 fue considerado significativo
Western Blot
Las células se lisaron en tampón que contenía Tris 10 mM. -HCl pH 7, NaCl 140 mM, MgCl2 3 mM, 0,5 × Igepal, DTT 5 mM, inhibidor de 1 × fosfatasa, y 1 × inhibidor de la proteasa. La concentración de proteína para cada muestra se cuantificó usando BCA ensayo de proteínas (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, EE.UU.) de acuerdo con el procedimiento del fabricante. Una cantidad de 15 g hasta 100 g de proteínas totales se cargó en 7,5% de SDS-PAGE. Después de la migración y la transferencia a membrana de nitrocelulosa, las membranas se saturaron con PBS /0,1% de Tween /2% ECL y se incubaron a 4 ° C durante la noche con 0,1 mg /ml monoclonal de ratón anti N-cadherina (catálogo no. 610920, BD Biosciences, Francia) o 1 mg /ml monoclonal de ratón anti AR (nº de catálogo. 554225, BD Biosciences, Francia) de anticuerpos. β-actina (0,2 mg /ml) (catálogo no. sc-47778, Tebu-bio, Francia) se utilizó como control interno. Después de los lavados, se detectaron inmunocomplejos con 0,2 mg /ml de HRP-conjugado de cabra anti-ratón (nº de catálogo. Sc-2005 tebu-bio, Francia), o 0,5 mg /ml de rata IgG2a anti-ratón secundaria de anticuerpos (nº de catálogo. 553391, BD Biosciences, Francia), y finalmente reveladas por quimioluminiscencia (Immobilon
TM occidental, Millipore, Molsheim, Francia).
La tinción de inmunofluorescencia
Lab-Tek II cámara de diapositivas (2 pozos) fueron recubierto con medio de LNCaP durante dos horas y 1 × 10
5 células LNCaP /pocillo fueron sembradas. células LNCaP fueron transfectadas con 2 g de pEGFP-WT, pEGFP-ARQ640X o pEGFP-ARQ670X 3 días más tarde y se incubaron durante 4 días. células LNCaP se lavaron en PBS y se fijaron con paraformaldehído al 2%. Las células se bloquearon y se permeabilizaron por 0,1% de Triton /1% albúmina de suero bovino (BSA) /PBS durante 30 min a temperatura ambiente. Los cultivos se incubaron con el anticuerpo monoclonal de ratón 2,5 mg /ml de anti-cadherina N (nº de catálogo. 610920, BD Biosciences, Francia) o anticuerpo isotípico (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Francia) a 4 ° C durante la noche. Después de lavar en PBS, las células LNCaP fueron incubadas con 2 mg /ml Alexa Fluor cabra 568-conjugado anti ratón (Invitrogen, Fisher Scientific, Francia) durante 1 h y los núcleos se tiñeron con solución /ml DAPI 0,1 g durante 20 min a 30 ° DO. Las imágenes fueron capturadas con el microscopio de fluorescencia Leica LAS AF6000 usando software LAS AF (Leica).
Resultados
variantes del receptor de andrógenos constitutivamente activa regular al alza la expresión de cadherina N en las células de cáncer de próstata
variantes AR constitutivamente activa se han asociado con CRPC. Por otra parte, algunos estudios mostraron que CRPC también está asociada con una regulación al alza de la expresión de N-cadherina [22], [23]. Hemos investigado si las variantes AR constitutivamente activas regular al alza la expresión de N-cadherina en células de CaP.
N-cadherina
nivel de ARNm se determinó por qRT-PCR en las células LNCaP que sobreexpresan la constitutivamente activa AR Q640X o AR-V7, o la AR-WT como control (Figura 1).
N-cadherina
expresión se mantuvo sin cambios en las células LNCaP que sobreexpresan AR-WT en comparación con los controles. Curiosamente,
N-cadherina
expresión se incrementó en un 8.000 veces en presencia de ARQ640X y AR-V7 (Figura 1A-B). Estos datos se confirmaron en células C4-2B (Figura S1) y a nivel de proteínas en las células LNCaP (Figura 1C). Además, un tiempo experimento reveló que los niveles de proteína N-cadherina se aumentaron constantemente de día-3 después de LNCaP células transfección con ARQ640X (Figura 1D).
A). expresión N-cadherina se evaluó mediante qRT-PCR en las células LNCaP que sobreexpresan la constitutivamente activa AR Q640X o AR-V7, o la AR-WT y en las células transfectadas con el plásmido vacío (C3). Las células fueron cultivadas en medio completo durante 9 días después de la transfección. Se utilizaron células LNCaP parentales como control. eje Y representa el pliegue del cambio relativo en comparación con el control (células LNCaP parentales).
β-actina
se utilizó como la normalización de control endógeno. Expresión relativa se presenta como la media ± SEM de tres experimentos independientes. Cada muestra se compara uno a uno por dos colas desapareado prueba de la t.
NS: No significativo * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01 y *** P & lt; 0,001
. SEGUNDO). Western Blot que muestra la expresión de AR en las células LNCaP transfectadas y no transfectadas. DO). El análisis por inmunotransferencia de la expresión de N-cadherina en células LNCaP transfectadas 4 y 9 días después de la transfección. RE). El análisis cinético de la expresión de N-cadherina mediante Western Blot en las células LNCaP que sobreexpresan AR Q640X de 2 a 9 días después de la transfección. β-actina se utilizó como control de carga.
Para confirmar estos datos de transfección transitoria, se realizó un análisis de clasificación de células LNCaP después de la transfección para demostrar que la expresión de N-cadherina se restringió a las células que expresan constitutivamente una AR activa.
N-cadherina
expresión se analizó en EGFP negativo (células no transfectadas) o EGFP (células transfectadas) positivos fracciones de QRT-PCR. En consonancia con los resultados anteriores,
N-cadherina expresión
era indetectable en ambos EGFP fracciones negativas y positivas después de la transfección LNCaP con pEGFP-ARWT. Sin embargo, tras la transfección con pEGFP-ARQ640X,
N-cadherina
expresión se incrementó en células positivas EGFP que sobreexpresan el AR constitutivamente activa, pero no en la fracción negativa EGFP (figuras 2A-B). Estos resultados fueron confirmados por análisis de inmunofluorescencia que muestra un etiquetado N-cadherina exclusivamente en EGFP células positivas que expresan una variante AR constitutivamente activa (Figura 2C).
células LNCaP fueron transfectadas transitoriamente con pEGFP-ARWT o plásmido pEGFP-ARQ640X y se clasificaron 4 días después. UN).
N-cadherina
expresión fue analizada por QRT-PCR en EGFP positivas (transfectadas) y EGFP negativo fracciones (no transfectadas). SEGUNDO). receptor de andrógenos nivel (AR) se analizó por transferencia Western para verificar la pureza de cada fracción después de la clasificación de células. DO). El análisis de inmunofluorescencia de N-cadherina expresión (fluorescencia roja) en las células LNCaP transfectadas con (fluorescencia verde) EGFP-etiquetados AR-WT, AR Q640X o plásmido de expresión de AR Q670X. Ampliación:. × 20
En conjunto, estos datos sugieren fuertemente que las variantes AR constitutivamente activos upregulate expresión N-cadherina en células de CaP
Los andrógenos regulan negativamente la expresión de N-cadherina inducida por. constitutivamente variantes del receptor andrógeno activo
un estudio reciente informó que las variantes AR constitutivamente activas podrían requerir una larga duración AR (AR-FL) para activar genes diana endógenos. Para explorar el efecto de la endógeno AR-FL presente en las células LNCaP de la capacidad de las variantes de AR constitutivamente activas para inducir la expresión de N-cadherina, las células LNCaP que sobreexpresan AR-WT o una variante constitutivamente andrógenos se incubaron en presencia de 100 nM DHT o vehículo, y N-cadherina expresión se analizó mediante qRT-PCR. De acuerdo con nuestros resultados anteriores, no se observó expresión de N-cadherina en células que sobreexpresan AR-WT. Curiosamente, se observó una disminución de 1,4 veces en el nivel de expresión de N-cadherina cuando las células que sobreexpresan AR Q640X o AR-V7 se cultivaron en presencia de 100 nM de DHT en comparación con vehículo (Figura 3A). Además, esta represión N-cadherina andrógenos mediada era dependiente de la dosis (Figura 3B). Estos resultados sugieren que las variantes del receptor de andrógenos constitutivamente activos no requieren AR-FL hasta de regular la expresión de N-cadherina. Sin embargo, DHT-activado AR-FL parece antagonizar los efectos de las variantes del receptor de andrógenos constitutivamente activos en la expresión de N-cadherina (Figura 3C). Para verificar esta hipótesis, se utilizó la novela MDV3100 anti-andrógenos para inhibir DHT-activado AR-FL en las células LNCaP transfectadas. Como era de esperar, se observó un aumento significativo adicional de la expresión de N-cadherina en células LNCaP que sobreexpresan variantes AR en presencia de 100 nM MDV3100 (Figura 3D). Estos resultados también se confirmaron en células resistentes a la castración 22Rv1, se sabe que expresan tanto AR-FL y variantes AR constitutivamente activos. Se observó un aumento de 2 veces en el nivel de mRNA N-cadherina cuando las células 22Rv1 se cultivaron durante 4 días en presencia de 100 nM y 1 mM de la MDV3100 anti-andrógenos (Figura S2).
A). células LNCaP fueron cultivadas en medio RPMI-1640 que contiene 5% DCC-FCS y 100 nM de DHT o vehículo (EtOH). expresión N-cadherina se analizó mediante qRT-PCR en las células LNCaP 4 días después de la transfección con AR-WT o la constitutivamente activa AR Q640X o plásmido de expresión de AR-V7. SEGUNDO). nivel de expresión N-cadherina en células LNCaP fue investigado por qRT-PCR 4 días después de la transfección con AR Q640X plásmido de expresión en presencia de diferentes concentraciones de DHT (10 nM, 25 nM y 50 nM) o vehículo. DO). expresión N-cadherina inducida por variantes AR constitutivamente activa (variantes AR) estaba regulada negativamente cuando se hicieron crecer células LNCaP en presencia de DHT. Nuestra hipótesis es que endógeno AR-FL presente en las células LNCaP y variantes AR podría actuar de manera diferente. En este modelo, DHT-estimulado endógeno AR-FL reprime la expresión N-cadherina mientras variantes AR upregulate su expresión. RE). células LNCaP que sobreexpresan AR-WT, AR Q640X y AR-V7 se cultivaron en medio DCC-FCS suplementado con 100 nM de DHT y en presencia de 100 nM de MDV3100 o DMSO como control durante 3 días. la expresión de N-cadherina se analizó mediante qRT-PCR 4 días después de la transfección, y se normalizó a
β-actina
. El método ΔΔCt se utilizó para calcular la expresión relativa y cada valor se informó como la media de ΔΔCt ± SEM.
NS: No significativo * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01 y *** P & lt; 0,001
En conjunto, estos datos sugieren que la DHT activado AR-FL. podría competir con receptor de andrógenos constitutivamente activa para regular la expresión N-cadherina.
variantes del receptor de andrógenos constitutivamente activa se asocian con la expresión de marcadores mesenquimales
es ampliamente conocido que en las células tumorales, la expresión de marcadores mesenquimales se asocia con una baja regulación de marcadores epiteliales. La hipótesis de que la regulación al alza de la expresión de N-cadherina observada en la presencia de variantes AR constitutivamente activa se acompaña de una disminución de expresión de E-cadherina. Para probar esta hipótesis, se analizó la expresión de E-cadherina en LNCaP transfectadas con ARQ640X, AR-V7 o el tipo salvaje plásmido de expresión de AR, o el plásmido vacío como control.
E-cadherina
niveles de mRNA en células LNCaP después de la transfección con el plásmido de expresión ARQ640X o AR-V7 no mostró ninguna diferencia significativa en comparación con los controles (Figura 4A). Estos resultados se confirmaron adicionalmente por análisis de transferencia de Western (datos no presentados), lo que sugiere que la expresión de variantes AR constitutivamente activos en el CaP se asocia con un incremento marcado en la expresión de N-cadherina, pero no se correlaciona con una baja regulación de la E- cadherina.
células LNCaP fueron transfectadas con el ARWT, ARQ640X o plásmido de expresión de AR-V7 o el plásmido vacío (C3). UN).
E-cadherina
, B).
vimentina
, C).
TWIST1
, D).
CARACOL
y E).
ZEB1
niveles de expresión fueron analizados por QRT-PCR en el día 9 después de la transfección. Para cada muestra, los niveles de expresión se normalizaron a
PBGD
o
β-actina
y reportado como valor relativo a LNCaP línea celular parental. Los valores se presentan como la media de ΔΔCt ± SEM.
NS: No significativo * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01 y *** P & lt; 0,001
. F). Western Blot que muestra la evolución de la expresión ZEB1 en las células LNCaP que sobreexpresan variantes AR constitutivamente activos. Inmunotransferencia de 100 mg de extractos de proteína total. β-actina se utilizó como control de carga.
También investigó si la expresión del RA constitutivamente activa en células de CaP se asocia con otros marcadores mesenquimales. Los niveles de expresión de
vimentina Opiniones y factores de transcripción
TWIST1, ZEB1
y
CARACOL
se determina mediante qRT-PCR en el día 9 después de LNCaP células transfección con ARQ640X o AR-V7 plásmido de expresión, el plásmido salvaje tipo AR o el vector vacío como control (Figura 4B-E).
vimentina
expresión se incrementó en un 2,5 y 1,5 veces en las células LNCaP que sobreexpresan ARQ640X y AR-V7, en comparación con los controles, respectivamente (Figura 4B).
Aunque TWIST1 se sabe que inducen
N-cadherina expresión en
CaP, no hubo diferencias significativas en los niveles de mRNA de
se observó TWIST1 gratis (Figura 4C). Sin embargo, las variantes AR constitutivamente activas condujeron a un aumento estadísticamente significativo de
CARACOL
y
ZEB1
niveles de mRNA (Figura 4D, E). ZEB1 regulación al alza también se confirmó a nivel de proteínas (Figura 4F).
Discusión
El AR señalización es muy importante para la proliferación y supervivencia de las células del cáncer de próstata. La vía AR permanece activado durante la progresión del CaP hacia una enfermedad resistente a la castración y la aparición de AR constitutivamente activa variantes que carece del dominio de unión al ligando se considera ahora como un acontecimiento importante en CRPC. A pesar de algunos estudios sugieren que las variantes AR constitutivamente activos tienen un impacto en la progresión del tumor, su función sigue siendo hasta ahora sin resolver.
En este estudio, hemos demostrado que la N-cadherina está regulada positivamente en las células LNCaP que expresan constitutivamente activa variantes de AR, pero no en las células LNCaP que sobreexpresan una AR de longitud completa. Estos datos sugieren por primera vez que las variantes AR constitutivamente activos pueden inducir la expresión de N-cadherina. Este hallazgo se debe conectar a estudios recientes informes una correlación entre CRPC y N-cadherina regulación positiva [22], [23], [24]. De acuerdo con estos estudios, nuestros datos sugieren que la AR activa constitutivamente variantes de señalización podría ser un mecanismo que conduce a la expresión de N-cadherina en CRPC.
Estos resultados ponen de manifiesto una vez más la relación entre la ruta de señalización de AR y la expresión de N-cadherina. Estudios recientes sugieren que AR regula negativamente la expresión de N-cadherina [22], [23]. De hecho, la regulación positiva N-cadherina se asocia con una disminución de expresión de AR en xenoinjertos de CaP resistentes a la castración [23]. Además, la regulación positiva de N-cadherina observado en las células LNCaP-19 resistentes a la castración se puede invertir en la presencia de andrógenos [22], [26], [27]. De acuerdo con estos datos, hemos demostrado que los andrógenos se asociaron con una disminución de la expresión N-cadherina en nuestro modelo de sobreexpresión de una variante del receptor de andrógenos constitutivamente activa. Estos resultados sugieren que AR-FL y variantes AR constitutivamente activos podrían actuar de forma diferente (Figura 3C). Por ejemplo, la DHT estimulada AR-FL podría reclutar co-represores y, a su vez, reprime
N-cadherina
expresión. Además, AR constitutivamente activa variantes que carecen de la región carboxi-terminal podría comportarse de manera diferente e inducir
N-cadherina
expresión. Por otra parte, AR-FL y variantes AR constitutivamente activas podrían competir entre sí para regular la expresión de N-cadherina. Consistente con esta hipótesis,
N-cadherina
gen contiene un conjunto de elementos de respuesta a andrógenos (ARE) se repite en el intrón 1 [28].
Sin embargo, las variantes de AR constitutivamente activa podría también controlar indirectamente
N-cadherina
expresión. Por ejemplo, en el cáncer de próstata,
N-cadherina
expresión se asoció con una translocación nuclear de TWIST1 [29]. Aunque nuestros datos no mostraron diferencias significativas en
TWIST1
niveles de mRNA, AR variantes constitutivamente activas podrían mejorar la translocación nuclear de TWIST1, que a su vez podría inducir a
N-cadherina expresión
después de unirse a la E- caja dentro del primer intrón del
N-cadherina
.
Estas hipótesis merecen ser estudiados en estudios adicionales para comprender cómo constitutivamente activas variantes AR regulan
N-cadherina
expresión.
En este estudio, hemos demostrado también que las variantes AR constitutivamente activas se asociaron con un aumento de la expresión de marcadores mesenquimales como
vimentina
,
CARACOL Opiniones y ZEB1. Estos resultados son consistentes con un estudio reciente, que mostró un aumento de marcadores mesenquimales en los tumores de pacientes tratados con terapia de privación de andrógenos [24]. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que las variantes AR constitutivamente activas podrían estar asociados con el proceso de la EMT. Sin embargo, estos marcadores no son consistentemente asociados con la EMT. Por ejemplo, caracol confiere resistencia a la apoptosis de las células tumorales expuestas a las radiaciones ionizantes y fármacos genotóxicos, y permite a las células de mama para convertirse en células iniciadoras del tumor [30], [31], [32], [33], [34].
la expresión de marcadores mesenquimales reportados aquí en la presencia de variantes AR constitutivamente activas no se asoció con una regulación a la baja de E-cadherina en nuestro modelo. La correlación inversa entre la regulación positiva de N-cadherina y regulación a la baja de E-cadherina todavía se discute. De hecho, McKeithen y sus colegas, y más recientemente Tiwari y sus colegas informan de un co-expresión de ambos E y N-cadherinas en células tumorales [35], [36]. En estos estudios proteína E-cadherina muestra una localización subcelular diferente. Además, la regulación al alza informado N-cadherina después de la castración en LNCaP-19 células no se acompaña de una disminución de la expresión de E-cadherina en
vitro
cultivo celular en [22]. Sin embargo, la esperada regulación a la baja de E-cadherina en este modelo sólo se observa en los tumores ortotópico después de la castración, pero no en subcutáneos LNCaP-19 tumores, lo que sugiere un papel importante del entorno que rodea la próstata para E-cadherina regulación a la baja [22]. Además, una correlación inversa entre la expresión inducida por la castración N-cadherina y regulación a la baja de E-cadherina se ha documentado en LAPC9 y LuCaP35 modelos subcutáneos xenoinjertos [23], [24]. Sin embargo, esta cadherinas interruptor no se ha informado en dos estudios centrados en los tumores de próstata clínicos en humanos, a partir de pacientes con o sin terapia de privación de andrógenos [22], [24].
Se necesitan más estudios para comprender las consecuencias funcionales de N-cadherina y otra upregulation marcadores mesenquimales en la presencia de variantes AR constitutivamente activos. expresión N-cadherina es ampliamente asociado con la progresión del tumor en particular, debido a su papel en la migración y la invasión. De hecho, N-cadherina favorece la migración de las células cancerosas a través de la reorganización del citoesqueleto y la formación de lamellipodia [14]. También promueve la migración de células de cáncer de establecer interacciones homofílicas con los tejidos vecinos tales como el tejido estromal o endotelio [37], [38]. expresión N-cadherina también está asociado con la supervivencia en células de cáncer de próstata y células de melanoma. De hecho, la expresión de N-cadherina puede activar la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) vía /AKT para inactivar las proteínas pro-apoptóticas y para inducir un incremento de proteínas anti-apoptóticas como Bcl-2 [39], [40]. Por último, un estudio reciente mostró que la N-cadherina podría mediar la angiogénesis mediante la inducción de la expresión de MCP-1 (MCP-1) a través de la vía PI3K /AKT [41].
Actualmente existe un gran interés en el modo de de la acción de variantes AR constitutivamente activos en CRPC. En este estudio, hemos demostrado por primera vez que constitutivamente activa AR variantes de inducir la expresión de N-cadherina y otros marcadores mesenquimales en el CaP. Estos resultados apoyan la hipótesis de que estas variantes AR constitutivamente activos podrían contribuir a la diseminación sistémica de células de CaP, y reforzar la importancia de orientar estas variantes AR en CaP.
Apoyo a la Información
Figura S1.
expresión N-cadherina se upregulated en células C4-2B en la presencia de variantes AR constitutivamente activos.