Extracto

La elevada morbilidad y mortalidad de los pacientes con esófago (E) y gastrointestinal unión esofágica (UGE) cánceres, garantiza que los nuevos modelos preclínicos para una prueba de drogas. Se evaluó la utilidad de los xenoinjertos de tumores primarios (PTXGs) como modelos preclínicos. , marcadores inmunohistoquímicos Clinicopathological (p53, p16, Ki-67, Su-2 /
neu
y EGFR), y se evaluaron los perfiles globales de abundancia de ARNm para determinar sesgos en la selección de muestras implantadas o injertadas, en comparación con la población subyacente . Nueve primaria E /Gej líneas de adenocarcinoma xenoinjertos se caracterizan, además, por el espectro y la estabilidad de la expresión de genes /proteínas más pasajes. Siete líneas de xenoinjertos de adenocarcinoma esofágico primario fueron tratados con quimioterapia individual o combinado. Los tumores que se implantaron (n = 55) en ratones NOD /SCID tenían características sugerentes de la biología más agresivos que los tumores que no se implantaron (n = 32). De los implantado, 21/55 injertado; el injerto se asoció con tumores pobremente diferenciados (p = 0,04) y pacientes de mayor edad (p = 0,01). La expresión de marcadores inmunohistoquímicos fueron similares entre la muestra del paciente y xenoinjerto correspondiente. diferencias de ARNm observadas entre los tumores de los pacientes y primeros xenoinjertos de paso eran en gran parte debido a la pérdida de estroma humano en xenoinjertos. los patrones de ARNm de los primeros vs xenoinjertos de paso de finales de los años y de las pequeñas vs grandes tumores del mismo pasaje fueron similares. resistencia completa estaba presente en 2/7 xenoinjertos de tumores, mientras que los restantes mostraron diversos grados de sensibilidad, que se mantuvo constante a través de pasajes. Debido a su capacidad para recapitular características del tumor primario durante el injerto ya través de pasos en serie, puede ser PTXGs sistemas clínicos útiles para la evaluación de la sensibilidad a los fármacos de los cánceres humanos Gej E /

Visto:. Dodbiba L, J Teichman, Fleet Un , tailandés H, Starmans MHW, Navab R, et al. (2015) conveniencia de utilizar modelos de xenoinjertos-derivados de los pacientes para la evaluación farmacológica de nuevas terapias para el cáncer de esófago /gastro-esofágico Junction. PLoS ONE 10 (3): e0121872. doi: 10.1371 /journal.pone.0121872

Editor Académico: Wayne A. Phillips, Peter MacCallum Cancer Centre, AUSTRALIA

Recibido: 13 Julio, 2014; Aceptado: February 17, 2015; Publicado: 31 Marzo 2015

Derechos de Autor © 2015 Dodbiba et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Toda la expresión de ARNm archivos están disponibles en la base de datos GEO (número de acceso: GSE58870).

Financiación: GL fue apoyado por el Presidente Alan B. Brown en Molecular Genomics, Fondo de la Familia Posluns y Presidente CCO en Terapéutica Experimental y Estudios de Población. Este estudio se realizó con el apoyo del Instituto de Ontario de Investigación del Cáncer de PCB a través de fondos proporcionados por el Gobierno de Ontario. LEA recibió el apoyo de un Instituto de Investigación del Cáncer de Ontario para el Premio Nueva Investigador. PCB fue apoyado por un Premio Terry Fox Instituto de Investigación de Nueva Investigador. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

en las últimas décadas, de esófago (e) y el cáncer de la unión gastroesofágica (UGE) ha visto un aumento dramático en la incidencia en los países desarrollados, mientras que la supervivencia a cinco años sigue siendo baja en el 19% [1]. métodos para seleccionar las terapias con medicamentos apropiados, por tanto, la identificación están garantizados. Tradicionalmente, los paneles de líneas celulares se han utilizado para probar rápidamente agentes contra el cáncer [2,3]. Además, las inyecciones de líneas celulares en ratones inmunodeprimidos son comunes
in vivo y modelos de eficacia del fármaco [4,5]. Aunque los enfoques de líneas celulares han contribuido en gran medida al desarrollo de fármacos y la biología del cáncer, que son modelos imperfectos de las pruebas de drogas [6]. Además, se encontraron recientemente tres líneas celulares de cáncer de E /Gej ampliamente usados ​​haber sido contaminada por otras líneas celulares a principios de la cultura [7]. Por lo tanto, idetifying modelos de análisis de drogas pre-clínicos apropiados de este tipo de cáncer es un reto.

xenoinjertos de tumores primarios (PTXGs) son prometedores como modelos preclínicos alternativos para los ensayos de sensibilidad al fármaco. PTXGs se crean mediante la implantación de una pieza de tumor directamente de un paciente en ratones inmunocomprometidos y utilizando el xenoinjerto resultante para la experimentación. modelos de xenoinjertos de tumores primarios de pulmón [8], de mama [9], de colon [10], de cabeza y cuello [11] y los cánceres de E /Gej [12] han demostrado que recapitular el paciente la histología del tumor y la morfología celular en diversos grados. condiciones fisiológicas tales como la temperatura, los niveles de oxígeno, contenido de nutrientes
etc
. se parecen más a los presentes en pacientes con cáncer [6]. Además, PTXGs no han sufrido las presiones de selección y los cambios moleculares importantes que intervienen en el establecimiento línea celular y el crecimiento a largo plazo [6], [13,14]. Por lo tanto, PTXGs podrían ser más propensos a predecir las respuestas de drogas que las líneas celulares cultivadas, ya sea
in vitro
o
in vivo
. Sin embargo, mientras que PTXGs han demostrado que imitan la respuesta original del tumor al tratamiento con bastante precisión [15-17], que todavía están expuestos a fuerzas de selección relacionados con las diferencias entre microambientes humanas y de ratón [18]. Por lo tanto, es importante evaluar el grado en que PTXGs divergen de los tumores primarios de pacientes a nivel genómico y proteínas antes de embarcarse en estudios extensos de drogas.
Desarrollo
Hemos descrito previamente modelo PTXG [12]. El siguiente paso lógico es el objetivo general del presente estudio: evaluar la utilidad y las limitaciones de la utilización de modelos PTXG para las pruebas de drogas. En concreto, en qué grado son E /UGE tumores representante de tumores de pacientes, en el contexto de la evaluación farmacológica? Nuestros propios experimentos a través de múltiples tipos de cáncer han identificado problemas PTXG comunes, tales como: (i) la falta de injerto de muchos tumores; (Ii) las muertes inesperadas de ratón, lo que lleva a la necesidad de modificar y ejecutar experimentos en diferentes pasajes; (Iii) razones técnicas, tales como la necesidad de ampliar los xenoinjertos en grandes cohortes y para congelar abajo pasajes anteriores para garantizar la accesibilidad para estudios futuros, lo que resulta en tener que utilizar pasajes posteriores experimentos de drogas; y (iv) una incapacidad ocasional para identificar modelos específicos PTXG con las mismas características moleculares observados en un paciente

Estas cuestiones técnicas plantean cuatro importantes cuestiones relacionadas con modelo-, que se pueden exponer como hipótesis comprobables:. (a) PTXG modelos son representativos de la población subyacente de cáncer gastro-esofágico (es decir, evaluar el sesgo de incorporación del trasplante), y si no es del todo representativa, somos capaces de describir lo que los prejuicios están presentes y cómo podrían afectar a las conclusiones; (B) los modelos PTXG son útiles en general, incluso en los pasajes más tarde, ya que sus patrones de expresión de genes /proteínas se mantienen estables; esta hipótesis mide el grado de confusión por las presiones de selección durante los pases; (C) PTXGs pueden recapitular el amplio espectro de características representativas molecular de sus cánceres primarios subyacentes; esto responde a las preocupaciones de no encontrar la heterogeneidad inter-tumoral necesario desarrollar enfoques de la medicina personalizada a la terapia; y (d) PTXGs responden a la terapia farmacológica de forma estable a través de múltiples pasajes. Por lo tanto, se evaluó el potencial de E /UGE PTXGs para replicar lo que se encuentra en los tumores clínicamente Humanos E /UGE, y las condiciones en las que estos PTXGs son apropiadas para su uso como modelos de análisis de drogas pre-clínicos.

Materiales Métodos y

Información del paciente clínico y patológico

Todos los pacientes fueron reclutados a través de su consentimiento por escrito. La información del paciente, incluyendo el tratamiento y el resultado (
i
.
e
. supervivencia global) se obtuvo a través del sistema de registros de pacientes Electrónica de la Red Universitaria de Salud (UHN), Toronto, Canadá, por gastro oncólogos -intestinal. El Consejo de Ética de Investigación de UHN (REB #: 06-0982-CE). Aprobó el estudio

Animales y Tejidos de procesamiento

diabético no obeso-combinada severa inmunodeficientes (/SCID NOD) ratones fueron criados internamente en la instalación (OCI) Cuidado de Animales del Instituto de cáncer de Ontario. Todos los animales se mantuvieron en un ambiente libre de patógenos en un ciclo estándar de 12 horas día /12hr-noche y fueron alimentados con una dieta estándar de pellets y agua esterilizada
ad libitum
. Los animales se sacrificaron utilizando dióxido de carbono seguido por dislocación cervical. Todos los procedimientos fueron aprobados por las normas éticas del Comité de Cuidado de Animales (OCI animal protocolo #: 1293,16).

tejidos de cáncer humano E /UGE se obtuvieron de los pacientes sometidos a resección quirúrgica en UHN, Toronto, Ontario y se procesaron como se describe anteriormente [12]. En resumen, el tejido fresco se almacenó en medio RPMI 1640 (sin FBS añadidos) hasta que se cortó en piezas de dimensiones aproximadamente de 5 mm y se implanta subcutáneamente en el flanco de ratones NOD /SCID (dentro de las 24 horas de la resección, sin embargo, se colocaron los tejidos de cáncer en medios de cultivo de tejidos en una mediana de 45 minutos después de la resección, y se mantiene en los medios de comunicación hasta la implantación). Dos piezas representativas fueron salvados en el compuesto temperatura óptima de corte (OCT) (congeladas a -80 ° C para el trabajo molecular) y formalina fijo parafina incrustados bloques (FFPE) para el análisis molecular y patológica, respectivamente.

Tratamiento

Las cohortes de 10 ratones implantados por brazo de tratamiento fueron controlados por el crecimiento del tumor. Una vez visible, los tumores se midieron usando calibradores métricas (Scienceware, cat: 134160001) dos veces por semana. Los ratones fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron 15-20 mm en la dimensión más larga, considerado como un criterio de valoración humana por el Comité de Cuidado de Animales. Una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente 300-750 mm
3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en grupos de control y quimioterapia. Para los experimentos de tratamiento individuales, se inyectaron cohortes de ratones una vez por vía intraperitoneal con 6 mg /kg de cisplatino (1 mg /ml, Hospira, DIN: 02126613), 9 mg /kg de paclitaxel (2 mg /ml, Hospira, DIN: 02296624) o 100 mg /kg de 5-fluorouracilo (15 mg /ml, Hospira, DIN: 021 827 420), mientras que el grupo de control se inyectó con solución salina. Para los experimentos de tratamiento combinado, el grupo de quimioterapia se trató una vez con 5,4 mg /kg de cisplatino (1 mg /ml, Hospira, DIN: 02126613) y 9 mg /kg de paclitaxel (2 mg /ml, Hospira, DIN: 02296624), basada en experimentos de toxicidad de ratón. Los ratones fueron sacrificados 24 horas después del tratamiento inicial (etiquetado como tumores pequeños) y al final del experimento (grandes tumores). Una media de dos ratones (1-3) por brazo se sacrificaron para las comparaciones. Los tumores se cosecharon y se guardan en los PTU y FFPE bloques para la caracterización molecular /patológica.

La inmunohistoquímica de marcadores moleculares

Se evaluó un panel de marcadores moleculares mediante técnicas de inmunohistoquímica (IHC) para estudiar su estabilidad dentro de cada xenotrasplante. Los marcadores fueron elegidos en base a su importancia para el cáncer de E /UGE. secciones de tejido FFPE se tiñeron con anticuerpos contra p53 (clon DO-7, Vector Laboratories, Burlington, Canadá, la dilución: 1: 250), p16
INK4a (mtm laboratories, en Heidelberg, Alemania; no- diluyeron), Ki- 67 (clon SP6, NeoMarkers, Rockford, EE.UU., dilución: 1: 500), EGFR (clon 31G7, Zymed, San Francisco, EE.UU., dilución: 1: 100), Her-2 /
neu gratis (clon A0485, Dako, Burlington, Canadá, la dilución: 1: 25), HIF-1α (clon 54, BD Biosciences, Franklin Lakes, EE.UU., dilución: 1: 50) y CD31 (clon PECAM1, Santa Cruz, EE.UU., dilución: 1 : 1000). Un índice de tinción se utilizó para evaluar la expresión de CD31 y HIF-1α usando espectador Aperio ImageScope. Todos los otros marcadores moleculares fueron evaluados por un equipo de cegado de patólogos. Se utilizó una combinación de una puntuación proporción y una puntuación de intensidad. La puntuación proporción (proporción de células tumorales positivas) fue la siguiente: 0: ninguno, 1: 1-24%, 2: 25-49%, 3: 50-74, 4: ≥75%. La puntuación de la intensidad (intensidad de la tinción de las células tumorales) fue la siguiente: 0: ninguno, 1: débil, 2: moderada, 3: más fuerte. Una puntuación total se obtuvo mediante la combinación de ambas puntuaciones. Brevemente, p53 y p16 se consideraron positivos si la tinción apareció mientras se evaluó Ki-67 basado en el porcentaje de células tumorales positivas. expresión en la membrana EGFR determinado EGFR positividad. Her-2 /
se utilizó neu
de puntuación estándar; las muestras se considera que tienen expresión similar si diferían en menos de una puntuación de intensidad de manchas (por ejemplo. 2 + 3 + vs). Dos pruebas t lados se utilizaron para evaluar las diferencias en la expresión de estos parámetros.

La extracción de RNA

Se extrajo ARN de xenoinjerto de octubre incorporado y tejidos humanos (diez x 10μm de espesor rebanadas de criostato) utilizando RNeasy mini-kits (Qiagen, 74104). La integridad del ARN se evaluó mediante la Agilent Bioanalyzer-2100-y el Nano-6000-ARN Kit (Agilent Technologies, desde 5067 hasta 1511) y se cuantificó usando un Nanodrop-ND-1000 espectrofotómetro (Thermo-Científico). los números de la integridad del ARN (RIN) de 7 + 8 + o fueron los puntos de corte de calidad para los pacientes y muestras PTXG, respectivamente.

etiquetado y la hibridación

Las muestras fueron etiquetadas según la GeneChip WT Terminal etiquetado y la hibridación manual, hibridado a gene-1,1-ST humano arrays (Affymetrix) y escaneado con el escáner GeneChip 3000-7G (Affymetrix). Todas las matrices de criterios de control de calidad aprobadas (Expresión software de la consola, Affymetrix).

Análisis estadístico

Para el análisis de quimiosensibilidad, el retraso en el tiempo para que un tumor se duplique en volumen se comparó entre líneas y su tratadas correspondiente controles no tratados. Los retrasos de tiempo se determinaron mediante el trazado de los volúmenes tumorales en una escala logarítmica y-y dibujar una línea horizontal en el volumen de duplicación que interceptó el control y tratamiento curvas de crecimiento. El retardo de tiempo se determinó como la diferencia en el tiempo entre las dos intersecciones y se refiere como el retardo de tiempo de duplicación. El retraso medio tiempo de duplicación para la resistencia frente a las líneas sensibles se calculó mediante la agrupación de todos los ratones de control y compararlos con los valores agrupados de ratones tratados.

análisis estadísticos adicionales se realizaron en factores clínico-patológicos para determinar el sesgo en la muestra del estudio y para determinar los factores asociados con el injerto. Dos caras pruebas t se aplicaron en todos los casos. Los resultados se consideraron significativos cuando
p-valor
& lt; 0,05. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando SAS.v.9.2 (Cary, NC).

Análisis de perfiles de genes

Tanto tumor primario y el paciente se utilizaron muestras de xenoinjerto emparejados para el análisis del transcriptoma (en total, 51 muestras se analizaron para la abundancia de ARNm). Veintiún tumores de adenocarcinoma fueron perfilados (12/9 injertado no injertados). Durante ocho adenocarcinomas primarios injertados, se perfila un pasaje muestra uno (P1) de xenoinjertos. Además, el análisis se realizó en 21 xenoinjertos posteriores de paso (P3 a través P12), de los cuales nueve eran de tumores pequeños (a principios de la curva de crecimiento) y 12 eran de tumores grandes.

Se evaluaron las diferencias en los perfiles de ARNm entre (a) tumores de pacientes que injertan
vs
aquellos que no lo hicieron, (b) xenoinjertos P1
vs
P0 (primaria) tumores, (c) posteriores xenoinjertos de paso
vs
P1, y (d) grande
vs
pequeñas xenoinjertos de tumores dentro del mismo pasaje. Para cada comparación, un modelo lineal gen-sabia estaba en condiciones de comparar las dos condiciones, ajustado a la matriz por lotes y, en su caso, para el paso. Una corrección tasa de falsos descubrimiento se realizó para dar cuenta de las múltiples pruebas [19].

Todos los análisis se realizaron utilizando R (v2.15.3). El enrejado de paquetes (v0.20-15) y latticeExtra (v0.6-24) fueron utilizados para la representación gráfica. Los datos pre-procesamiento se llevó a cabo utilizando el algoritmo de RMA [20] (paquete de Affymetrix, v1.36.0) combinado con anotaciones actualizadas ProbeSet (paquete hugene11stv1hsentrezgcdf, v15.0.0) [21]. Un filtro de expresión se utiliza para eliminar el ruido experimental. Un umbral de baja intensidad se establece en función de las intensidades de genes del cromosoma-Y de las cinco muestras de pacientes femeninos como se describe anteriormente [22]. Las sondas con un registro de valores medios de expresión
2-transformado por debajo de cinco fueron retirados. En total, se retuvieron ~ 15.500 sondas.

Un análisis de poder se realizó con la función power.t.test (v.2.15.3 paquete de estadísticas) para estimar la probabilidad de que las diferencias en los niveles de expresión podrían ser identificados entre grupos. Dado que los datos en el registro de expresión era
2-espacio, una diferencia en la expresión media fue equivalente a la de registro
2 transformado-factor de cambio. El número de observaciones por grupo se estableció en 10 y el nivel de significación se fijó en 0,05 /15.500 = 3x10
-6 (
i
.
e
., Bonferroni corregido). El poder se calcula para una serie de factores de cambio (| log2 factores de cambio | desde 1,1 a 6) y de las desviaciones estándar. Se calculó la distribución de las desviaciones estándar para la expresión génica y la potencia calculada para todos los deciles. Para el 50% de los genes, hubo un 80% de probabilidades de detectar un log |
2 factores de cambio | de 1.7 (~ FC 3) y superior.

Resultados

características clínico-moleculares asociados a la implantación /Injerto

marcadores moleculares clave que reflejan las vías importantes relacionadas con E /UGE se evaluaron en 90 tumores primarios resecados, 55 de los cuales tenían suficiente tejido en la resección para ser implantado (Figura 1). De las muestras implantadas, 21 (38%) incorporado con éxito (4 carcinomas de células escamosas (SCC); 17 adenocarcinomas).

Dado que no todos los tejidos resecados estaban disponibles para su implantación, que era importante para determinar si alguno existen prejuicios entre los especímenes implantados y no implantados. Un análisis multivariado de ambos subtipos (SCC, adenocarcinoma) y de adenocarcinoma solamente, reveló una mayor probabilidad de implantación con tumores localizados en la UGE (en comparación con cualquiera tercio inferior /distal o Medio /Alto tumores, p = 0,01; Tabla 1).

de muestras implantadas, éxito del injerto fue mayor en los tumores procedentes de pacientes de mayor edad (OR = 1,10 /diez aumento año, p = 0,01) y en los tumores pobremente diferenciados (OR = 4,41, p = 0,04) . Her-2 /
neu
expresión fue significativamente mayor en las muestras de adenocarcinoma de injerto (OR = 2,51, p = 0,05). Una comparación entre injertados y todas las demás muestras (no injertados y no implantado) mostró que los tumores de pacientes de más edad (OR: 1,09, p = 0,01), Her-2 /
neu
positividad (OR = 2,38, p = 0,03), y la mala diferenciación (OR = 6,48, p = 0,01) fueron cada uno asociado con una mayor probabilidad de injerto. La misma comparación reveló que en el subconjunto adenocarcinoma, las mismas variables, además de adenocarcinomas UGE, se asociaron con una mayor injerto (p = 0,02; Tabla 1). Un modelo de riesgo proporcional de Cox reveló que la supervivencia global no fue significativamente diferente por injerto o el estado de implantación (p & gt; 0,05). Los análisis univariados se muestran en las Tablas S1 y S2
.
Un análisis global de la abundancia de ARNm de injertado (n = 12) y no injertado (n = 9) muestras de adenocarcinoma no revelaron diferencias entre los dos grupos. Incluso sin ajustar por múltiples pruebas, sólo 76 genes a través de una variedad de diferentes vías mostraron una diferencia en la expresión con p & lt; 0.01.

Comparación de primer paso (P1) xenoinjertos de tumores primarios vs

Para determinar los cambios de marcadores moleculares con el injerto, la expresión de proteínas se evaluó en siete pares de tumores de pacientes y xenoinjertos correspondientes (Tabla 2A) . P53, p16 y EGFR se calificaron como "coincidencia" o no, ya que estos eran por lo general en los fenómenos de activación /desactivación, sin gran variación en el grado de positividad. P53 (5 de 7 casos tenían partido primario-xenoinjerto), p16 (6/7), Her-2 /
neu gratis (6/7), y EGFR expresión en la membrana (5/7) mostró una alta concordancia entre tumores de pacientes (P0) y xenoinjertos temprano de paso (P1). Ki-67 índices también fueron similares entre los tumores y xenoinjertos de pacientes (p & gt; 0,05). la heterogeneidad de expresión estaba presente en el resto de casos. Los ejemplos de la expresión de estos marcadores entre los tumores de los pacientes y principios de los xenoinjertos se muestran en la Fig 2.

P53 en la línea A y Ki-67 en la línea H son ejemplos de expresión similar entre el paciente, el paso temprano ( P1) y el último paso (P

últimos
) xenoinjertos. P16 en la línea H se seleccionó para demostrar la heterogeneidad detectada en el mismo tejido (P

temprano
mostrando tanto positivos y la expresión negativa). la expresión de EGFR en línea E exhibió un aumento en la intensidad de paciente a xenoinjertos mientras Her-2 /
neu
expresión en la línea A mostraron una disminución en la intensidad. Estos ejemplos se incluyen para demostrar que las diferencias expuestas entre el tejido del paciente, el paso temprano y noticias de xenoinjertos de paso eran debido a la heterogeneidad intrínseca y no a los patrones específicos de expresión.

En el análisis de la abundancia de ARNm de primaria tejido del paciente
vs
primeros xenoinjertos de paso, hemos encontrado una buena concordancia (figura 3, primera columna) con R
2 valores que oscilan entre 0.52-0.88. Agrupación jerárquica sin supervisión mostró que xenoinjertos agrupados juntos mientras que los tumores de pacientes agrupados con otros tumores de pacientes (S1) Fig. 2164 genes fueron expresados ​​diferencialmente entre los tumores P0 y P1 (falso descubrimiento tasa y lt; 5%).

Se realizaron comparaciones entre P1 xenoinjerto
vs
del tumor del paciente (columna izquierda), P
última
vs
P
principios de xenoinjerto (columna central) y Large
vs
tumores de xenoinjertos Pequeño (columna derecha). los niveles de expresión normalizados para los distintos genes se utilizaron para trazar la comparación. R
2 valores están incluidos para cada comparación. ARNm para las líneas F y no se pudieron obtener para todas las comparaciones, ya se había producido la degradación del ARNm en el tejido congelado. Ambas muestras tenían ARNm intacto para el tumor del paciente, sino Línea I no tenían una tarde xenoinjerto paso a juego, mientras que la línea F no tenía un juego de xenoinjertos primer paso. Ambas líneas se incluyeron en las comparaciones estadísticas que se encontraba el de datos.

Una lista de GO (ontología de genes) términos se utilizan para verificar que las diferencias de abundancia de ARNm más significativas entre P0 y P1 son debido a la pérdida de estroma humano en el xenoinjerto. Términos relacionados con palabras clave como proceso inmune sistema, la diferenciación de las células endoteliales, proliferación de fibroblastos, la diferenciación de eritrocitos
etc
. se utilizaron como marcadores selectivos para genes del estroma. Se utilizó una definición rigurosa para su inclusión como un gen del estroma, con la expectativa de que muchos más genes potenciales del estroma pueden pasarse por alto. Usando esta definición, de los 15.630 genes en el microarray, 1.410 (9,02%) estaban relacionados con estroma. De los 2.164 genes que muestran expresión diferencial significativa entre los tumores primarios y xenoinjertos pasaje que 338 (15,6%) estaban relacionados con estroma, lo que demuestra el enriquecimiento (p = 0,0001).

cambios que se producen después de pases seriados

para evaluar si los cambios moleculares significativas se producen en xenoinjertos después de varios pasajes, se evaluaron los mismos marcadores moleculares como anteriormente en el paso temprano (P1, tumores de gran tamaño) y el paso tardío (último paso para fines de comparación, tumores de gran tamaño) durante siete líneas. Al igual que en el análisis anterior, p53 (5 de 7 fueron similares), p16 (6/7), Her-2 /
neu
(6/7), EGFR expresión membranosa (5/7) y Ki- 67 índice mostró una buena correlación entre los xenoinjertos de paso primeros y últimos (Tabla 2B). Los ejemplos de la expresión de estos marcadores entre los últimos xenoinjertos de paso temprano y se muestran en la Figura 2.

Temprana y perfiles de abundancia de ARNm de xenoinjertos finales de paso mostraron que no hubo diferencias significativas se mantuvo después del ajuste falsa tasa de descubrimiento. En un subanálisis prospectivo utilizando un umbral menos estrictas para la significación (p & lt; 0,01), sólo 64 genes mostraron una diferencia en la expresión. Además, los diagramas de dispersión de la expresión génica en principios de paso (P
temprano) y el último paso (P
última) de cada línea de xenoinjertos mostraron que hubo muy pocos cambios que se producen como los xenoinjertos se sometieron a pases en serie (figura 3, segunda columna). Un análisis de agrupamiento jerárquico encontró que los xenoinjertos agrupados dentro de sus correspondientes líneas tumorales y no de acuerdo con el paso (S1 figura).

Pequeños y Grandes xenoinjertos dentro de la misma Passage to
Pequeño (temprano en la curva de crecimiento ) y grandes (al final de la curva de crecimiento) los tumores dentro de la misma pasaje también se compararon para determinar si había alguna diferencia subyacentes en xenoinjertos dentro del mismo pasaje (pero de diferentes tamaños). P53, p16, Her-2 /
neu
y EGFR expresión eran similares (Tabla 2C). El análisis mostró que la abundancia de ARNm no hay genes expresados ​​diferencialmente pudieron ser identificados después del ajuste de tasa de falso descubrimiento. Sólo 23 genes fueron expresados ​​diferencialmente utilizando un umbral menos estrictas para la significación (p & lt; 0,01).

cinética de crecimiento del tumor y la quimiosensibilidad

Para determinar si los xenoinjertos de E /UGE se pueden utilizar para evaluar drogas respuestas (sensibilidad y resistencia), se trataron y analizaron la respuesta de varias líneas a la quimioterapia. Cisplatino, paclitaxel y 5FU se eligieron debido a su amplio uso en la práctica clínica para casos de cáncer de E /UGE. Los resultados iniciales con dos líneas (líneas B y F en la figura 4) fueron reportados previamente en Dodbiba et al, 2013 [12]. Este sentido, ampliar nuestros estudios a un mayor número de líneas de xenoinjertos.

medias ± SEM (n = 10 ratones por grupo) se representaron. Las flechas indican el tiempo en el tratamiento. Las líneas están dispuestas en orden de su tiempo de retardo ascendente a duplicar el volumen (TD), medido en días (d). líneas de adenocarcinoma (A) Siete varían en el grado de sensibilidad a estos agentes. Líneas A y B muestran claros signos de resistencia, mientras que las líneas restantes muestran diversos grados de sensibilidad. Línea H fue probado para la quimioterapia, pero debido a la toxicidad del ratón no se pudo completar. Debido a la naturaleza de crecimiento lento del tumor, la línea no se ensayó porque no suficiente tejido podría ser propagado. (B) La línea de carcinoma de células escamosas es muy sensible al tratamiento y se presenta aquí para propósitos de comparación. Nota: Los datos correspondientes a la línea B (P5) y la Línea F (P11) ha sido previamente publicada y corresponde a la línea 8 (P5) y la Línea 1 (P11) en Dodbiba et al. Laboratorio. Invertir. 93, 397-407 (2013).

líneas tumorales exhiben una amplia gama de quimiosensibilidad a una dosis combinada de paclitaxel y cisplatino (figura 4). Cuando la organización de las líneas con el fin de retardo de tiempo de duplicación ascendente, las líneas de adenocarcinoma forman modelos distintos (S2) Fig. líneas de adenocarcinoma resistentes mostraron poco o ningún retraso (promedio, 2,3 días; Líneas A y B), mientras que las líneas sensibles podían dividirse en dos categorías: (1) las líneas sensibles a la artesa muestran la contracción inicial después del tratamiento, seguido por el nuevo crecimiento en un similares tasa con el grupo control (media de retraso de tiempo de duplicación de 4,4 días, las líneas C y D); y (2) las líneas de ΔSlope sensibles muestran ninguna o muy poca contracción pero el crecimiento procedido con una pendiente disminuido (lo que representa un crecimiento más lento) en comparación con los controles (retraso medio en el momento de 6.7 días, las líneas E, F y G de duplicación). El retraso más grande (
i
.
e
., Quimiosensibilidad más grande) fue exhibida por la línea de carcinoma de células escamosas (demora media de 19,6 días).

Con el fin de evaluar si las propiedades chemosensitivity de las líneas cambian con el paso, se trataron tres líneas (B, F y D) con diferentes combinaciones de quimioterapia a través de diferentes pasajes. El comportamiento de cada línea fue similar entre los pasajes ya través de las modalidades de tratamiento. Línea B exhibió resistencia a los tratamientos individuales de cisplatino, paclitaxel y 5FU en el paso 3, y fue igualmente resistente a una dosis combinada de cisplatino y paclitaxel en el paso 5 (S3 Fig). Línea F mostró sensibilidad a la inicial tratamientos individuales de cisplatino, paclitaxel y 5FU en el paso 8 y ganó resistencia a estos tratamientos al ser dada una segunda dosis. En el paso 11, la línea de nuevo exhibe sensibilidad a una dosis combinada inicial de cisplatino y paclitaxel, y de manera similar no mostró retraso en el crecimiento adicional en el segundo tratamiento (S3 Fig). Quimiosensibilidad al mismo tratamiento (dosis combinada de cisplatino y paclitaxel) no ha cambiado a través de diferentes pasajes de la línea D (Fig S3). Al analizar el retardo de tiempo de duplicación de estas líneas en diferentes pasajes, quimiosensibilidad no cambió de paso a paso. En general, la resistencia inherente, aumento de la resistencia y la quimiosensibilidad se mantuvo constante a través de pasajes.

Marcadores Moleculares, Quimiosensibilidad y Respuesta de Contrapartida
humano
La expresión de p53, p16, Ki-67, EGFR y Herman 2 /neu

fueron similares en todos los tumores de diferentes patrones de chemosensitivity. Con el fin de determinar si la hipoxia estaba relacionado con la quimiorresistencia, también se evaluó la expresión de HIF-1α nuclear y la expresión CD31 en el control emparejado y tumores tratados. Ni CD31 ni HIF-1α mostraron ningún cambio en la expresión después del tratamiento en las etapas tempranas de crecimiento o el punto final (p & gt; 0,05). Además, no hay cambios en la expresión de proteínas se detectaron entre las tres principales categorías chemosensitivity (p & gt; 0,05), aunque este estudio no fue diseñado para detectar diferencias menores. Por lo tanto ninguno de los marcadores de la prueba son predictivos de la capacidad de respuesta de terapia, pero todas se mantuvo constante antes y después de la quimioterapia (datos no mostrados).

De siete líneas que se quimio-tratado como xenoinjertos, sólo tres también fueron tratados con quimioterapia en sus homólogos humanos (Línea a, D y e). De éstos, sólo dos pacientes podrían compararse para la respuesta al tratamiento con sus correspondientes xenoinjertos (líneas D y E). La respuesta al tratamiento en los pacientes se evaluó
a través de
una tomografía computarizada realizada dentro de los dos meses de iniciado el tratamiento. Tanto Paciente D (tratados con epirubicina, cisplatino y 5-FU) y E del paciente (5-FU, cisplatino y radiación) tenían enfermedad estable después del tratamiento. A pesar de que los pacientes son tratados de manera diferente, esta observación es similar a lo observado en los xenoinjertos, donde la sensibilidad de la línea D y E fueron encontrados en el medio de la tabla de respuesta (S2 figura).

Discusión

Para evaluar la utilidad potencial y las limitaciones de e /UGE PTXGs, hemos demostrado lo siguiente:

injertadas tumores tenían una diferenciación más pobre y una mayor intensidad de tinción de Her-2 /
neu
, en comparación que no implantado y /o tumores no injertado. Esta tendencia a tener más biológicamente tumores agresivos [23-25] injertadas es útil para nuestros objetivos, ya que el objetivo de las pruebas de drogas pre-clínica es el desarrollo de nuevas terapias que se dirigen a los pacientes de refracción de tratamiento. Cabe destacar que no todos los tejidos resecados estaban disponibles para la implantación debido a la necesidad de priorizar el uso clínico. tumores o tumores más pequeños, cuya participación margen era cuestionable o difícil de separar de la cicatrización debido a la terapia previa quimio-radioterapia o la falta de disponibilidad de un patólogo dentro del marco de tiempo para aprobar su uso en investigación de la muestra, afectado, que estaría disponible para el implante de tejidos.